Высокая пропускная анализ изображений опухолевых сфероидов: Программное обеспечение удобное приложение для измерения размера сфероидов автоматически и точно

Biology
 

Summary

Мы представляем программного обеспечения для анализа изображений высокой пропускной приложение для измерения размера трехмерных опухолевых сфероидов полученную с ярко-микроскопии. Это приложение обеспечивает быстрый и эффективный способ изучения последствий терапевтических препаратов на сфероидах, что выгодно для исследователей, которые хотят использовать сфероидов в экранах наркотиков.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately. J. Vis. Exp. (89), e51639, doi:10.3791/51639 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Все большее число приложений трехмерных (3D) опухолевых сфероидов в качестве модели в пробирке для открытия новых лекарств требует их адаптации к крупномасштабных форматов скрининга в каждом шаге экране наркотиков, в том числе крупномасштабных анализа изображений. В настоящее время нет готовых к использованию и бесплатное программное обеспечение для анализа изображений для удовлетворения этот масштабный формат. Большинство существующих методов привлечь вручную рисовать длину и ширину отображаемого 3D сфероидов, что является утомительным и трудоемким процессом. Это исследование представляет собой высокую пропускную программного обеспечения для анализа изображений приложение - SpheroidSizer, который измеряет старший и младший осевую длину отображаемого 3D опухолевых сфероидов автоматически и точно; вычисляет объем каждого отдельного 3D сфероида опухоли; затем выводит результаты в двух различных формах в электронных таблицах для простых манипуляций в последующем анализе данных. Основным преимуществом этой программы является ее мощное приложение анализа изображений, что являетсяадаптирован для большого количества изображений. Она обеспечивает вычисление высокой пропускной и контроля качества процесса. Расчетное время для обработки 1000 изображений составляет приблизительно 15 минут на минимальной конфигурации ноутбук или около 1 мин на рабочей станции в производительности многоядерных. Графический интерфейс пользователя (GUI), также предназначен для управления легко качества, и пользователи могут вручную изменять результаты работы с компьютером. Ключевым методом, используемым в это программное обеспечение адаптируется от активной алгоритма контура, также известный как Змей, что особенно подходит для изображений с неровной освещения и шумовом фоне, которые часто свирепствует автоматизированную обработку изображений на экранах высокой пропускной. Бесплатный "Руководство Initialize" и "Рука ничья" инструменты обеспечивают гибкость в SpheroidSizer в борьбе с различными видами сфероидах и разнообразных качественных изображений. Это программное обеспечение для анализа изображений высокой пропускной значительно уменьшает рабочую силу и ускоряет процесс анализа. Реализация этой программы это бeneficial для 3D опухолевых сфероидов стать обычным делом в модели пробирке для экранов наркотиков в промышленности и научных кругов.

Introduction

Трехмерная (3D) опухолевые сфероиды "сферически симметричные агрегаты опухолевых клеток, аналогичных тканей, без искусственных субстрата для прикрепления клеток" 1-3. Цитология и морфология опухоли Spheroids лучшие имитирует в естественных условиях организации ткани опухоли и микросреды, чем однослойные двумерных (2D) клеток. 3D опухолевые сфероиды стали практическим модель в пробирке для высокой пропускной показы противораковых терапевтических препаратов или изучения эффективности лекарственных препаратов-кандидатов, прежде чем животное в естественных условиях или клинических испытаний 4. Клинически эффективность любой противораковой медикаментозного лечения оценивается на основе уменьшенной роста опухоли. Аналогично, объем сфероид может быть использован в качестве меры эффективности для лабораторного изучения наркотиков рак. Сфероид объем (V = 0,5 * Длина * Ширина 2) определяется на основе большой и малой осевой длины (более известный как длина и ширина)6, 7 сфероидов. Большинство исследователей придется вручную рисовать длину и ширину на каждой сфероида, часто с использованием программного обеспечения, предлагаемые микроскопии компаний и продается вместе с аппаратурой для получения изображений. Этот метод становится проблематичным, когда экраны с высокой пропускной наркотиков выполняются и более сотни изображений производятся. Некоторые недавние исследования сообщили об использовании открытых исходного изображения программного обеспечения для анализа наборов инструментов, таких как CellProfiler 8-10 и ImageJ 11 развивать элементарные сегментации подпрограммы / макросы, которые участвующие коррекции освещения и простой пороговой. Эти процедуры часто нужно заново отрегулировать для различных партий изображений в соответствии с условиями освещения и изменение контрастности изображения; Таким образом, эти программные пакеты не может удовлетворить требование робастности анализа изображений высокой пропускной. Фридрих и сотрудники (2009) используется собственное программное обеспечение для измерения объема полу-автом сфероида втически 5. Метод, описанный в Monazzam и бумаги его коллег 10 был метод полуавтоматического для измерения размера сфероида в только в течение небольшого количества изображений. Таким образом, существует явная потребность в надежных, гибких, автоматизированных и готов к использованию анализа изображений инструменты для опухолевых сфероидов 3D.

В этом исследовании мы описываем SpheroidSizer - в MATLAB на основе и программное приложение с открытым исходным кодом, чтобы измерить размер опухоли сфероидах автоматически и точно. SpheroidSizer предназначена для обработки много различных серий изображений 3D-сфероидов в той же сессии. Используя активный алгоритм контура 12-14, SpheroidSizer может терпеть изменение контрастности изображения, решительно игнорируют постепенное изменение фоновой подсветки и признать сфероидов в изображении. Он также может терпеть много обычные артефакты, например, мусор, происходит от образца. Рабочий процесс устроен так, что пользователи могут выполнять качества противоречивыел во время или после вычислений. Руководство перезапись результата анализа можно легко выполнить на месте. Воспользовавшись параллельных вычислений инструментов, скорость анализ может быть новый толчок развитию координации нескольких вычислительных ядер работать на вычислении одновременно на компьютере пользователя. Кроме того, SpheroidSizer выводит результаты в двух различных формах, что позволяет легко организовать интерфейс с последующих инструментов анализа.

Protocol

Формирование 3D опухолевые сфероиды, лекарства и коллекции изображений 1. Выполняются, как описано в нашей предыдущей статье 15.

2. Установка программного обеспечения

  1. Установите лицензионное программное обеспечение MATLAB на компьютер, используемый для анализа изображений. Следующие наборы инструментов от MATLAB также должны быть установлены - Signal Processing Toolbox, Обработка изображений инструментов и параллельные вычисления инструментов * (* нужен для режима параллельной вычислительной только).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многие университеты приобрести и поддерживать лицензии группы таким образом, чтобы программное обеспечение является бесплатным для загрузки и используется аффилированных ученых.
  2. Установите программу SpheroidSizer от SpheroidSizer.zip файл (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
    1. Сохраните файл почтовый в локальной файловой системе.
    2. Распакуйте файл SpheroidSizer.
    3. Сохраните файлы в указанную папку / папки, которые будут впоследствии были названы тон "Каталог установки".
      ПРИМЕЧАНИЕ: SpheroidSizer был тщательно протестирован на операционной системе Windows 7. Ожидается, что работать на альтернативных операционных систем с минимальными корректировками (не проверял).

3. Подготовка к анализу изображений по SpheroidSizer

  1. Определить масштаб изображения / разрешение системы формирования изображения (абсолютный масштаб изображения в микронах на пиксель (мкм / пикс)).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если размер каждого пикселя на чипе камеры известно, масштаб изображения можно рассчитать как размер цель увеличения х точек (мкм / пикс). Это значение может быть получено из обработки изображений, оснащенного микроскопом как встроенных метаданных или с помощью системы формирования изображений поставщика. Это значение будет необходимо в шаге 4.6.
  2. Конвертировать любой проприетарные форматы файлов изображений с принятыми форматов файлов - TIFF, JPEG и другие Распространенные форматы изображений.
  3. Имя файлов изображений и организовать directoriэс (рис. 5, а).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение опирается на соответствующую макет структуры каталогов и файлов для переформатирования результаты в формате пластины:
    1. Назовите файлы изображений в формате: [табличка] _ [строка] [столбец] [расширение] или [табличка] [пробел] [строка] [столбец] [расширение]... [Ряд] следует алфавитный порядок и [раздел] следующим образом численное заказ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свободно доступное программное обеспечение автоматического группового переименования можно найти, чтобы помочь пользователям в этом шаге.
    2. Организовать каталог / папку на основе эксперимента следующим образом: Каждый эксперимент должен иметь один каталог. Под каталоге каждого эксперимента, не должно быть подкаталогов для каждого момента времени. Под каждого подкаталога момент времени, не должно быть все изображения из всех пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы результаты анализа, чтобы быть оптимально отсортированных в отформатированных результатов, мы рекомендуем держать такое же количество цифр для каждого идентификатора, заполнив 0 находится на лEFT, например, временные точки названы 000H, 072H и 144H.

4. Анализ Изображение Сфероиды по SpheroidSizer

  1. Открыть MATLAB, затем откройте "Command Window", Тип CD '[Каталог установки]' и нажмите [Enter].
  2. Наберите "SpheroidSizer1_0" в "Command Window" и нажмите кнопку [RETURN], чтобы запустить программу SpheroidSizer.
  3. Нажмите кнопку "Обзор" в окне SpheroidSizer1.0 выбрать каталог эксперимент, который содержит все изображения.
  4. Выберите "Включая вложенные папки" тумблер по дну "Folder" текстовое поле для обработки нескольких вложенных папок изображения под указанную папку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если "Включая вложенные папки" переключатель не выбран, изображения непосредственно в директории обрабатываются только, и все вложенные папки игнорируются.
  5. Выберите опцию "On-The-муха дисплей" для DISPлежали каждый сегментированный изображение на вершине своего исходного изображения для контроля качества, как вычисление выполняется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: скорость вычислений быстрее, если опция "На лету дисплей" не выбран.
  6. Укажите "Resolution" (масштаб изображения / разрешение в мкм / пиксель) анализируемых изображений в окне, чтобы программа правильно преобразования измерений сфероида от пикселя к мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все изображения в той же папке или проанализированы вместе должны быть приняты в рамках этого же микроскопа с той же целью, так что масштаб изображения / разрешение остается постоянной для каждого эксперимента.
  7. (Необязательно) пользователи могут следовать шаг 5 для продвинутых пользовательских настроек.
  8. Нажмите кнопку "Compute", чтобы начать вычисления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение проводит автоматическую проверку имен файлов, прежде чем приступить к вычислению. Если диалоговое окно появляется с указанием - "Ошибка существует в имени файла", нажмите кнопку "Выйти и показать список ошибок"и исправить ошибки в перечисленных имен файлов (см. шаг 3.3). Затем нажмите кнопку "Compute", чтобы начать вычисление снова.
  9. Нажмите кнопку "Пауза" для приостановки вычисления; и вычисление может быть возобновлено, нажав ту же кнопку, показывая "Продолжить".
    ПРИМЕЧАНИЕ: "Таблица результатов" отображает "Папка", "Файл", "Volume" (в мм 3), "длина" (в мкм), "ширина" (в мкм), и "Действительно" (флажок) для всех анализируемых сфероидах (рис. 5, в). Объем рассчитывается на основе измеренного главной оси (длина) и малой оси (ширина) (V = 0,5 * Длина * Ширина 2). "Действительно" флажок вариант для пользователя, чтобы выбрать, если анализ изображения действительным или недействительным после контроля качества, см. Шаг 6.

5. Расширенный пользовательские настройки

  1. Нажмите кнопку "Дополнительно" в СФЕРoidSizer1.0 окно, чтобы открыть окно Дополнительные параметры системы в целях адаптации пользовательских настроек (Рисунок 5б).
  2. Введите имена файлов, представляющих интерес в "формат вывода" и "Выходной список" коробки в окне Расширенный Конфигурации под "Вход".
  3. Введите число от "2-10" в поле "Reduce". Это коэффициент для программного обеспечения, чтобы уменьшить размер изображения в расчете того, чтобы улучшить скорость вычислений. Чем больше число, тем выше скорость вычислений. По умолчанию "Уменьшить" установлен в 10.
  4. Введите к-быть-обработанный расширение файла изображения в поле "Включить тип".
  5. Введите расширения файлов изображений или окончаний, которые не собираются быть обработаны программой в коробке "Исключить тип" следующим образом: "_crude.jpg".
  6. выберите "Нет" для "Специального Color" для обработки 8 бит и 16 бит цвили изображения должным образом; выберите "12 бит" для "Специального Color" для обработки 12-битные цветные изображения правильно
  7. Проверьте "Использовать параллельных вычислений", если компьютер используется для анализа изображений оснащен несколькими процессорами и / или многоядерных процессоров. Если это так, то перейдите к шагу 5.7.1; если нет, то пропустите шаги 5.7.1 и 5.7.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: произойдет ошибка, если компьютер используется браузер не поддерживает выбранную конфигурацию.
    1. Отметьте опцию "Использовать параллельных вычислений" в окне Расширенный конфигураций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только режим параллельных вычислений, когда 4 или более ядер доступны для компьютера.
    2. Введите число от 4-12 в "# работников» (вычислительных ядер) коробка.
      Примечание: Этот номер должен быть равен или меньше, чем количество вычислительных ядер в компьютере пользователя. Максимум 12 налагается MATLAB параллельных вычислений инструментов поддерживает максимум 12 ядер. Когда параллельные вычисления будет бытьIng выполнена, небольшие дисплеи появится сообщение пользователю ждать параллельных вычислений, чтобы закончить; вычисление не может быть приостановлена, а равно как и "Об лету дисплей" функция выполняется в режиме параллельных вычислений.

6. Контроль качества

  1. Щелкните соответствующую ячейку в «Таблице Результатов", чтобы подтвердить точное граничное контур сфероида в анализируемых изображений,
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оригинальные и контроля качества изображения будет отображаться в правой части для рассмотрения. Пользователь может изучить все изображения последовательно, используя стрелку вниз на клавиатуре.
  2. Уточните границу сфероида на выбранном изображении, используя следующие два инструмента, если это необходимо:
    1. Нажмите кнопку "Руководство Initialize", чтобы отобразить исходное изображение. Затем нажмите и удерживайте кнопку мыши прямо вне сфероида и перетащите эллипс инструмент для покрытия сфероид на исходное изображение.
      ПРИМЕЧАНИЕ:Алгоритм CTIVE-контур инициирует помощью пользовательского представил контур и выполняет сходятся на нужную сфероида контуром. "Таблица результатов" будет автоматически обновляться с новыми результатами. "Руководство Initialize" инструмент позволяет пользователю вручную обеспечить инициализацию для активного-контура.
    2. Нажмите кнопку "Рука ничья", чтобы отобразить исходное изображение. Затем с помощью мыши или сенсорного включен экран точно провести границу сфероида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта схема измеряется непосредственно генерировать большой и малой осей, которые обновляются в «Таблице Результатов". "Рука ничья" инструмент используется только тогда, когда "Руководство Initialize" инструмент не сходится по нужной границе сфероида.
  3. Снимите флажок в "Действительный" колонки в соответствующей строке "Результаты Таблица», когда изображение не содержит любой действительный сфероид после осмотра. "; Неверный ярлык "появляется в верхнем левом углу изображения контроля качества. Если "Действительно" не установлен, значения всех измерений пусты для сфероида в экспортируемых отформатированных и выходных файлов результатов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: следующие сочетания клавиш доступны для использования в "итоговой таблицы": "стрелка вниз" в течение следующего изображения; "В" для действительно / недействительно; "М" для "Руководство Initialize" инструмента и "з" для "Рука ничья" инструмент.

7. Сохранение и экспорт данных

  1. Нажмите кнопку "Экспорт Study" в окне SpheroidSizer1.0 экспортировать промежуточное состояние анализа, если пользователю необходимо выйти из программы до завершения проекта. Укажите имя и каталог файла, который будет сохранен.
  2. Нажмите кнопку "Импорт Study", чтобы вернуть выше промежуточный результат состоянии из «Экспорт изучения» и продолжают пристаК на нем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: промежуточное состояние файлы в исходном формате MATLAB (мат.) И не имеют прямого чтения любых других программ. Функция безопасности встроен в программное обеспечение делает автоматические экспорт открытого проекта в случае, если программа выходит непреднамеренно. При необходимости, пользователь может найти этот файл, имя которого начинается с "~ TMP", который содержит соответствующую временную метку в [Установка каталог].
  3. Нажмите кнопку "Формат результаты" в окне SpheroidSizer1.0, чтобы сохранить результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: две формы результатов сохраняются в каталоге эксперимента. Экспортируемые имена файлов можно настроить в окне Расширенный Конфигурации (см. Протокол Шаг 5.2). Выход формат файла вкладка-очерчены таблица, которая организует значение громкости в оригинальном формате пластины в порядке номером пластины восходящего для каждого момента времени; и все временные точки организованы в порядке возрастания (рис. 5D). Список оutput файл является вкладка-очерчены таблица, которая содержит все измерения в виде упорядоченных списков (рис. 5E).

Representative Results

SpheroidSizer предназначен для получения автоматического обнаружения, разграничение и измерение 3D-сфероидов, с удивительно сниженной труда и остро повышения эффективности для больших объемов изображений. Рис. 1А показывает рабочий процесс SpheroidSizer. Шаги основные вычислительные включают автоматизированную инициализацию, активный алгоритм контура и контура количественное. После автоматизированные вычисления, функция контроля качества использует комбинацию "Ручная Initialize" и "Рука ничья" инструментов, чтобы спасти любую несовершенную сегментацию. Рис. 1В иллюстрирует подробную автоматизированной активное алгоритм контура. Стадия инициализации (0-я итерация) использует основные шаги обработки изображений для создания приблизительный размер и расположение сфероида и генерировать сферическую инициации контур по оценкам, размер. Контур инициация каналы в активную алгоритма контура. В свою очередь он перебирает отрегулировать в соответствии с местным изображенияградиент и форма кривизны. Алгоритм активным контур заканчивается, когда контур стабилизирует (сходится), то есть 477 итераций этой фотографии, или когда предопределенные максимальное число итераций выполняется. В этом примере контур инициализации намеренно увеличена, чтобы лучше продемонстрировать алгоритм. В действительности, инициализация как правило, очень близко к фактической границе и гораздо меньшее число итераций, необходимых для алгоритма сходиться. Затем алгоритм принимает морфометрические измерения обнаруженного сфероида границы. Большая и малая оси сфероида оцениваются при помощи MATLAB для обработки изображений инструментов (рис. 1в). Большая ось определяется как отрезок прямой, соединяющей одну пару самых дальних точек на контуре, который называется длиной (L). Малая ось определяется как самой длинной линии, перпендикулярной главной оси, на который ссылается ширина (W). В этом случае значения L и W очень близки, так каксфероид является сферической. Объем сфероида рассчитывается как V = 0,5 * L * W 2.

Одна из особенностей SpheroidSizer является его автоматическое обнаружение границы сфероидов даже на изображениях с неравномерным или шумный фон, используя активный алгоритм контура (рис. 2В-D). Вычислительная обработка изображений в светлом поле часто страдает от неравномерного фона, который вводит в заблуждение адаптивные методы порога основе, чтобы привести к нежелательным результатам порога. Вопрос особенно заметно при мульти-луночные планшеты используются и стенки колодцев может создать теневого влияния на изображениях. Тем не менее, поскольку активная алгоритм контур не чувствителен к постепенному изменению затенения в фоновом режиме, она способна определить сфероид сегментацию в этих ярких образов поля с правильной инициализации. Рисунок 2 показывает несколько примеров изображений с неровной или шумовом фоне, как неравномерное освещение (рис. 2Б (рис. 2С) или некротический сердечник (рис. 2D). С автоматизированной активного алгоритма контура, SpheroidSizer очерчивает эти сфероиды точно во всех этих изображений, как показано в красном контуре на нижней панели каждого рисунка.

Функция контроля качества из SpheroidSizer является ключом к высокой пропускной процесса. "Руководство Initialize" и "Рука ничья" инструменты являются ценными бесплатные инструменты для этого приложения. Среди сотен и тысяч изображений, это неизбежно, что автоматизированная алгоритм не в состоянии правильно определить сфероидов в некоторых изображений. Как показано на рисунке 3А, когда неправильное обнаружение сфероида возникает из-за этапа инициализации, то есть неправильный размер или местонахождение инициации контура в изображении (верхняя панель), «Руководство Initialize" инструмент работает, позволяя пользователю правильно определять местоположение и размер сфеOID вручную (нижнюю панель). Это вызывает активный алгоритм контура инициировать с определенной вручную контура и выполнять сходятся на нужной схеме. Для этих жестких изображений, как исходного изображения на фиг.3В, сфероид расположен в отвлекает и шумовом фоне. SpheroidSizer не в состоянии правильно определить сфероид по автоматизированным методом (верхняя панель) или с помощью "Руководство Initialize" инструмент с надлежащей инициализации (средняя панель). В этом случае, "Рука ничья" инструмент может быть использован, чтобы вручную нарисовать контур сфероида, как показано на нижней панели. Программа использует определенный пользователем границу для измерения старший и младший оси сфероида и рассчитать объем. Все скорректированные результаты сразу же включается в "Таблице Результатов" и может быть соответствующим образом на экспорт.

Для определения производительности SpheroidSizer в больших наборов данных, мы впервые сравнить время работы поАнализируя тот же набор 288 изображений с помощью 1) ручные измерения с микроскопа поставщиков прилагаемого программного обеспечения; 2) SpheroidSizer с одноядерным обычный ноутбук; и 3) SpheroidSizer с рабочей станции параллельно производительности вычислений с многоядерной. Ручные измерения следовать наш типичный протокол до разработки программного обеспечения: длина и ширина каждой сфероида нарисованы от руки и измеряется с помощью программы поставщика (как видно красные линии в верхней панели рисунке 4A); Затем пользователь копирует вниз значений измерений. SpheroidSizer обрабатывает каждый файл, генерируя сфероида границу (как показано красный контур в нижней панели фиг.4А), измерение осевого основными и вспомогательными длину и экспорта результатов в таблицах. Как видно из таблицы 1, на основе расчета от 288 изображений, она занимает в среднем 31,67 сек измерить один сфероид каждого изображения вручную; в то время как это займет всего SpheroidSizer менее 2 сек & # 160; при работе на одноядерном обычный ноутбук; и менее 1 сек при работе на рабочей станции производительности 12-основной. Таким образом, анализ изображений составляет более 18x быстрее на изображение с помощью SpheroidSizer чем ручных измерений. Это значительно сокращает труд, когда более тысячи изображений анализируются. Далее, мы сравним изменчивость в измерениях 24 сфероидах показанных на рисунке 4A между ручных измерений и SpheroidSizer. В 24 Сфероиды измеряются три раза обоими методами; и стандартное отклонение каждого отдельного сфероида рассчитывается. Как видно на рисунке 4В, стандартного отклонения от SpheroidSizer (зеленая линия и точками) близка к нулю за три сфероидах, которые были исправлены на этапе контроля качества, которые до сих пор показывают меньшую стандартное отклонение, чем те, от метода ручного измерения исключением. Все это означает, что SpheroidSizer более эффективно и точно выполняет анализ изображения.

e_content "> Мы провели экран наркотиков использованием человеческих сфероидов БОН-1 3D опухолевые чтобы выяснить, какие соединения в сочетании с hsp90 ингибитора являются потенциальными кандидатами для тестирования эффектов противоопухолевых в естественных условиях. человека БОН-1 3D опухолевые сфероиды были выращены на агарозных покрытием 96-луночных планшетах, как описано в предыдущей статье 15. Восемь различных соединений с шести последовательных разведений плюс СМИ и автомобиля были обследованы на их одно-и комбинаторных эффектов с 10 нМ и 20 нМ hsp90 ингибитора в дубликатов соответственно. Две сферические были использовали для каждой концентрации индивидуального соединения или комбинированных соединений. Были использованы четыре 96-луночных планшетах с суммарными 384 сфероидов. Все сфероиды были обследованы на 0, 72, 144, 168 и 192 ч. В общей сложности 1920 изображений были получены Из этого эксперимента. Потребовалось SpheroidSizer всего 30 минут, чтобы завершить вычислительную анализ 1920 изображений с еще 50 мин для контроля качества и экспорта данных. SPHEROidSizer ускоряет процесс анализа изображений чрезвычайно. показан снимок экрана договоренностей папок и файлов для этого эксперимента в качестве примера для протокола шаге 3.3. Цифры 5B-E показывает скриншоты анализа изображения всплывающих окон и результатов . используя SpheroidSizer качестве иллюстраций для протокола шаги 4, 5, и 7 Принимая объемы 3D-сфероидов с отформатированных таблице результатов, экспортируемой из SpheroidSizer, мы сделали графики - рост 3D опухолевых сфероидов на сложных процедур в зависимости от времени лечения. Два представительных графы из этого эксперимента представлены на рис 5F и 5G. Рисунок 5F показывает, что объединенные лечения ингибитора hsp90 и кладрибином (зеленая линия) подавляют рост 3D сфероидов более одного лечения ингибитора hsp90 (фиолетовая линия) или кладрибина (оранжевая линия), предполагая, что объединенные лечения ингибитора hsp90 и кладрибин может иметь противоопухолевую EFдефектов в естественных условиях. Рисунок 5G показывает, что объединенные лечения ингибитора hsp90 и адриамицин (зеленая линия) не ингибирует рост 3D сфероидов более одного лечения адриамицин (оранжевая линия) или ингибитора Hsp90 (фиолетовая линия), предполагая, что комбинированного лечения ингибитора hsp90 и адриамицин не может оказывать действие противоопухолевых в естественных условиях. Этот эксперимент помог нам лучше выбрать соединений, чтобы проверить свои противоопухолевые эффекты в естественных условиях и SpheroidSizer является ключом к скорейшему анализа экспериментальных данных.

Таблица 1
Таблица 1. Сравнение времени работы на анализе изображений между ручных измерений и SpheroidSizer при анализе и тот же набор 288 изображений. Пожалуйста, Cлизать здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблице.

Рисунок 1
Рисунок 1 SpheroidSizer -... Приложение с открытым исходным кодом программное обеспечение для измерения размера сфероида в) Ядро документооборота приложения Б) Иллюстрация активного алгоритма контура на разных этапах итерации. Пожалуйста, обратите внимание, что контур инициализации (итерация 0) намеренно увеличены для того, чтобы продемонстрировать алгоритм. C) Старший и младший измерения длины осевого и расчет объема по SpheroidSizer. L - большая ось: отрезок, соединяющий одну пару дальних точек на контуре (называемый длины); W - малая ось: самой длинной линией, перпендикулярной главной оси (упомянутой ширины).

класс = "jove_content" FO: держать-together.within-страницу = "всегда"> Рисунок 2
Рисунок 2. Представитель результаты от автоматизированной сегментации SpheroidSizer, показывая устойчивость к различным условиям изображений.) Типичный хорошее качество изображения. B) изображения с различной яркостью и контрастностью. C) Изображения с отвлекающей мусора. D) Изображения сфероидах с некротической ядра . Изображения на верхней панели каждого рисунка являются источником / оригинальные изображения; изображения на нижней панели каждой фигуры являются контроля качества изображения; и красный контур является сфероид сегментация запряженной автоматизированный расчет.

hres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Иллюстрация "Ручная Initialize" и "Рука ничья" инструменты. A) "Руководство Initialize" инструмент позволяет нарисовать примерочной форме эллипса через сфероида для инициализации, когда неточно сфероид сегментация происходит после автоматизированной инициализации. B ) "Рука ничья" инструмент позволяет точной ручной рисунок сфероида границе, когда неточные сферические сегментации произойти как с автоматизированной и ручной инициализации. Синяя линия вокруг сфероида показывает контур инициализации; красный контур является выявлены сфероид граница. Обратите внимание, что сфероид в "Ручная Initialize" в А) и сфероида в "Рука ничья" в B) намеренно увеличены, чтобы лучше продемонстрировать инструменты.

Рисунок 4 Рисунок 4. Сравнение производительности анализа изображения между SpheroidSizer и ручных измерений при анализе и тот же набор 24 изображений. A) Характерные сфероиды чтобы показать, как длина и ширина сфероидов определяются ручных измерений и SpheroidSizer. Топ 24 изображения содержат рисованной длина / ширина каждого сфероида в красных линий с использованием ручных измерений; нижние 24 изображений (те же 24 изображений) содержат компьютерную тяге сфероид границу в красным контуром использованием SpheroidSizer. B) Стандартное отклонение длины или ширины от трех измерений на каждой отдельной сфероида.

Рисунок 5
Рисунок 5. Типичный пример использования сфероидаДробилка в экране наркотиков - анализ изображений картинки Сфероиды ", которые были собраны с экрана наркотиков с использованием БОН-1 3D опухолевые сфероиды) Снимок экрана договоренностей папок и файлов для этого проекта Б) снимок экрана расширенный.. Окно конфигурации в SpheroidSizer. C) Снимок экрана окна SpheroidSizer1.0 с отображаемой таблицы результатов. D) Снимок экрана выходного файла формата экспортируемого из SpheroidSizer. Е) Снимок экрана выходного файла список экспортируемых из SpheroidSizer. F) Рост 3D опухолевых сфероидов на вариантах с ингибитором hsp90 и кладрибином. G) роста 3D-опухолевых сфероидов на вариантах с ингибитором hsp90 и адриамицин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. </ Р>

Discussion

Это исследование представляет собой быстрое, гибкое, эффективное и автоматизированная программа - SpheroidSizer для точного определения размера 3D опухолевых сфероидов. SpheroidSizer проста в использовании и требует минимального ввода данных пользователем. Наиболее важные шаги для точного, плавного и успешного ведения SpheroidSizer включают в себя: что сфероиды изображаются в центре поля, не касаясь края колодца; все файлы, которые будут проанализированы вместе, как один проект должен быть отображены под тем же микроскопа с той же целью; все файлы, которые будут проанализированы правильно назвал и расположены, как указано в протоколе; и правильные пользовательские настройки вводятся перед вычислением.

Преимущества SpheroidSizer включают его способность переносить постепенное изменение фона на изображении, а также для создания гладкой контуры которых соответствуют общей сферических форм сфероидов, использующих алгоритм активного контура. Выполнение активнымКонтур может быть нарушена в двух ситуациях: плохое инициализации, или в присутствии других местных краев отвлекающих от желаемого контура. В частности, в наших тестируемых случаев Вторая ситуация иногда произойти, когда некротический сердечник из большого сфероида привлекает активный контур, что приводит к меньшему контура сообщается. Стоит отметить, что другие автоматизированные пороговые методы, основанные также страдают в этой ситуации, если порог специально не установлен вручную. В связи с этим программа выдвигает усилия, чтобы помочь пользователям обнаружить и исправить угрозу сегментацию путем предоставления легко функции контроля качества. Если сегментация ошибка происходит от плохого инициализации, использование может использовать "Руководство Initialize" инструмент для переопределения автоматизированную инициализацию. Когда качество изображения слишком беден для активного контура, пользователи могут легко "Рука ничья" контур которые находят отражение в количественной оценке. Существующее программное обеспечение, например, CellProfiler могут быть адаптированы для этого приложения в полу-автоматизированной шоу, модын. Рабочий процесс может быть громоздким, когда большое количество изображений с разными условиями изображений представлены или когда подмножество изображений требуется больше вмешательства человека, чтобы правильно измерить. SpheroidSizer обеспечивает набор все-в-одном для расчета и контроля качества, чтобы управлять высокой пропускной рабочий процесс анализа изображений.

SpheroidSizer в настоящее время ограничивается обнаружения одного сфероид за изображение и только измеряет осевая длина сфероида. Программа может быть расширена для поддержки дальнейшего количественного определения необходимую такие исследователи, как количественного на сфероидах с некротической ядра, обнаружение нескольких сфероидов в одном изображении или мониторинга форму сфероидов. Кроме того, программа может быть изменена, чтобы обнаружить и измерить размер подакцизным опухолей из животного или человека, который наверняка будет полезно для исследователей при проведении в естественных условиях доклинических или клинических исследований. Пост-обработка обнаруженных сфероидах также могут быть исследованы цельING на снижение человеческого усилия, необходимые для контроля качества и дальнейшего улучшения пропускной способности. SpheroidSizer обобщенное применение анализа изображений для 3D опухолевых сфероидов, которые производятся из любых типов клеток, и, следовательно, могут быть использованы в широком исследованию рака сообщества.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Раймонд и Беверли Саклер Фонд за поддержку в нашем исследовании.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axiovert 200M inverted microscope Carl Zeiss Microscopy, LLC microscope for imaging
Vostro 1720 Dell Inc. single-core regular laptop
HP Z820 HP Inc. multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a Mathworks, Inc, Natick, MA MATLAB software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamilton, G. Multicellular spheroids as an in vitro tumor model. Cancer Lett. 131, 29-34 (1998).
  2. Sutherland, R. M., McCredie, J. A., Inch, W. R. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. J Natl Cancer Inst. 46, 113-120 (1971).
  3. Inch, W. R., McCredie, J. A., Sutherland, R. M. Growth of nodular carcinomas in rodents compared with multi-cell spheroids in tissue culture. Growth. 34, 271-282 (1970).
  4. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
  5. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat Protoc. 4, 309-324 (2009).
  6. Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37, 3639-3643 (1977).
  7. Ayers, G. D., et al. Volume of preclinical xenograft tumors is more accurately assessed by ultrasound imaging than manual caliper measurements. J Ultrasound Med. 29, 891-901 (2010).
  8. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
  9. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
  10. Monazzam, A., et al. A new, fast and semi-automated size determination method (SASDM) for studying multicellular tumor spheroids. Cancer Cell Int. 5, 32 (2005).
  11. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  12. Chan, V. L. Active contours without edges. IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).
  13. Bernard, O., Friboulet, D., Thevenaz, P., Unser, M. Variational B-spline level-set: a linear filtering approach for fast deformable model evolution. IEEE Trans Image Process. 18, 1179-1191 (2009).
  14. Kass, M. W. A., Terzopoulos, D. Snakes: Active contour models. International Journal of Computer Vision. 1, 321-331 (1987).
  15. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. J Vis Exp. (66), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics