High-throughput beeldanalyse van bolvormige tumoren: Een gebruiksvriendelijke software Toepassing op de Grootte van Sferoïden Meet automatisch en nauwkeurig

Biology
 

Summary

Wij stellen een hoog-beeldanalyse software applicatie de grootte van driedimensionale bolvormige tumoren afgebeeld met helderveld microscopie meten. Deze toepassing biedt een snelle en efficiënte manier om de effecten van therapeutische geneesmiddelen op sferoïden, wat gunstig is voor onderzoekers die sferoïden gebruiken drugschermen onderzoeken.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately. J. Vis. Exp. (89), e51639, doi:10.3791/51639 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het toenemend aantal toepassingen van driedimensionale (3D) bolvormige tumoren als een in vitro model voor drug discovery vereist de aanpassing aan de grootschalige screening formaten in elke stap van een drug scherm, waaronder grootschalige beeldanalyse. Momenteel is er geen kant-en-klare en gratis software voor beeldanalyse om dit groot formaat te voldoen. De meeste bestaande werkwijzen omvatten het handmatig plaatsen van de lengte en breedte van de afgebeelde 3D sferoïden, die een vervelend en tijdrovend proces. Deze studie geeft een high-throughput beeldanalyse softwaretoepassing - SpheroidSizer, die de grote en kleine axiale lengte van het afgebeelde 3D bolvormige tumoren automatisch en nauwkeurig meet; berekent het volume van elke individuele 3D tumor sferoïde; voert dan de resultaten in twee verschillende vormen in spreadsheets gemakkelijk manipulaties in de gegevensanalyse. Het belangrijkste voordeel van deze software is de krachtige beeldanalyse toepassing dieaangepast voor grote aantallen beelden. Het biedt een hoge-doorvoer berekening en kwaliteitscontrole workflow. De geschatte tijd om 1000 beelden te verwerken is ongeveer 15 min op een minimaal ingestelde laptop, of ongeveer 1 min op een multi-core prestaties werkstation. De grafische gebruikersinterface (GUI) is ook ontworpen voor eenvoudige kwaliteitscontrole, en kunnen gebruikers handmatig de computer resultaten overschrijven. De belangrijkste methode die in deze software is een bewerking van de actieve contour algoritme, ook wel bekend als slangen, die vooral geschikt voor afbeeldingen met ongelijke verlichting en lawaaierige achtergrond die vaak zichtbaar geautomatiseerde beeldverwerkingssysteem in high-throughput screens. Het gratis "Manual Initialize" en "Hand Draw" tools bieden de flexibiliteit om SpheroidSizer in het omgaan met verschillende soorten bolletjes en diverse hoogwaardige beelden. Deze high-throughput beeldanalysesoftware opmerkelijk vermindert arbeid en versnelt het analyseproces. Het implementeren van deze software is beneficial voor 3D bolvormige tumoren aan een routine in vitro model voor drug-schermen in de industrie en de academische wereld geworden.

Introduction

Drie-dimensionale (3D) bolvormige tumoren zijn "bolsymmetrisch aggregaten van tumorcellen analoog aan weefsels, zonder kunstmatige substraat voor celhechting" 1-3. De cytologie en morfologie van de bolvormige tumoren beter bootst de in vivo tumorweefsel organisatie en micromilieus dan monolaag tweedimensionale (2D) cellen. 3D bolvormige tumoren hebben praktisch in vitro model voor high-throughput screening van anti-kanker therapeutische middelen of onderzoeken van de werkzaamheid van kandidaat geneesmiddelen worden voordat in vivo dierlijke of klinische proeven 4. Klinisch wordt de werkzaamheid van een geneesmiddel tegen kanker behandeling beoordeeld op verminderde tumorgroei. Analoog kan bolvormige volume worden gebruikt als een maat voor de werkzaamheid in vitro kanker drug studies. Sferoïde volume (V = 0,5 * Lengte * Breedte 2) wordt bepaald op basis van grote en kleine axiale lengte (beter bekend als lengte en breedte)van de sferoïden 6, 7. De meeste onderzoekers handmatig trekken de lengte en breedte van elke sferoïde, vaak met behulp van de software die door microscopie bedrijven en verkocht samen met de beeldvormende instrumenten. Deze techniek wordt problematisch wanneer high-throughput drug schermen worden uitgevoerd en meer dan honderden beelden worden geproduceerd. Enkele recente studies het gebruik van open source image analyse software gereedschapskisten zoals CellProfiler 8-10 en ImageJ 11 tot rudimentaire segmentatie routines / macro's die Correctie helderheid en eenvoudige drempeling betrokken ontwikkelen. Deze routines moeten vaak opnieuw worden aangepast voor verschillende batches van beelden volgens de verlichting conditie en het beeldcontrast verandering; Daarom kunnen deze software pakketten niet voldoen aan de robuustheid eis van de high-throughput beeldanalyse. Friedrich en medewerkers (2009) gebruik van propriëtaire software om volume semi-autom de bolvormige metenatisch 5. De methode in Monazzam en papieren van zijn collega's 10 beschreven was een semi-automatische methode om de grootte spheroïde meten slechts voor een klein aantal afbeeldingen. Daarom bestaat er een duidelijke behoefte aan robuuste, flexibele, geautomatiseerde en kant-en-klare beeldanalyse voor de 3D bolvormige tumoren.

In deze studie beschrijven we SpheroidSizer - een MATLAB-gebaseerde en open-source software applicatie om de grootte van de tumor sferoiden automatisch en nauwkeurig te meten. SpheroidSizer kan een groot aantal verschillende groepen afbeeldingen 3D sferoïden verwerken in dezelfde sessie. Gebruik makend van de actieve contour algoritme 12-14, kan SpheroidSizer beeldcontrast verandering tolereren, robuust negeren geleidelijke verandering in de achtergrond verlichting en spheroids herkennen in het beeld. Het kan ook tolereren veel gebruikelijke artefacten, bijvoorbeeld, puin, afkomstig uit het monster. De workflow is zo ontworpen dat gebruikers de kwaliteit contro kunnen uitvoerenl tijdens of na de berekening. Handmatig overschrijven van het analyseresultaat kan gemakkelijk worden uitgevoerd op de plek. Profiterend van de parallel computing toolbox, kan de analyse snelheid verder worden versterkt door het coördineren van meerdere cores tegelijkertijd werken aan de berekening op de computer van een gebruiker. Bovendien SpheroidSizer geeft de resultaten in twee verschillende vormen gemakkelijk interfacing toe met afgaande analyse-instrumenten.

Protocol

1. 3D bolvormige tumoren vorming, medicamenteuze behandelingen en imago collectie zijn uitgevoerd zoals beschreven in onze vorige papier 15.

2. Software-installatie

  1. Installeer gelicentieerde MATLAB software op de computer wordt gebruikt voor beeldanalyse. De volgende gereedschapskisten van MATLAB zijn ook verplicht te worden geïnstalleerd - Signal Processing Toolbox, Beeldverwerking toolbox, en Parallel Computing Toolbox * (* nodig voor parallel computing-modus).
    OPMERKING: Veel universiteiten aanschaf en onderhoud groep licenties, zodat de software is gratis te downloaden en gebruiken door de aangesloten wetenschappers.
  2. SpheroidSizer programma installeren vanaf SpheroidSizer.zip bestand (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
    1. Sla het zip-bestand in uw lokale bestandssysteem.
    2. Pak het SpheroidSizer bestand.
    3. Sla de bestanden in een aangewezen directory / map, die vervolgens zal worden aangeduid als thij "Installatie Directory".
      OPMERKING: SpheroidSizer is uitgebreid getest op een Windows 7-besturingssysteem. De verwachting is om te werken aan alternatieve besturingssystemen met minimale aanpassingen (niet getest).

3. Voorbereiding van de Image Analysis door SpheroidSizer

  1. Bepaal het beeld schaal / resolutie van de imaging-systeem (absolute schaal van de afbeelding in micron per pixel (micrometer / pix)).
    OPMERKING: Als de grootte van elke pixel op de camera chip bekend is, kan het beeld schaal worden berekend als objectiefvergroting x pixelgrootte (um / pix). Deze waarde kan worden verkregen uit de imaging software uitgerust met de microscoop als ingebedde metadata, of met hulp van de leverancier imaging systeem. Deze waarde wordt in stap 4.6 vereist.
  2. Elke proprietary image file formats te converteren naar de geaccepteerde bestandsformaten - TIFF, JPEG, en andere veelgebruikte bestandstypen.
  3. Naam beeldbestanden en regelen directories (figuur 5A).
    OPMERKING: De software is gebaseerd op de goede lay-out van de mapstructuur en bestandsnamen om de resultaten te formatteren in plaat-formaat:
    1. Benoem de beeldbestanden in het volgende formaat: [naam plaat] _ [rij] [kolom] [extensie] of [plaat naam] [spatie] [rij] [kolom] [extensie]... [Rij] volgt de alfabetische volgorde en [column] volgt de numerieke volgorde.
      OPMERKING: Gratis verkrijgbaar automatische batch hernoemen software kan worden gevonden om gebruikers te helpen bij deze stap.
    2. Schik de directory / map op basis van het experiment op de volgende manier: Elk experiment moet een map. Onder directory elk experiment moeten er submappen voor elk tijdstip. Onder elk tijdstip subdirectory, moet er al de beelden van alle platen.
      OPMERKING: Om de analyseresultaten optimaal gesorteerd worden de opgemaakte resultaten, raden we met behoud van hetzelfde aantal cijfers voor elke identifier door het invullen van 0's op de left, bijvoorbeeld tijdstippen worden genoemd als 000H, 072H en 144H.

4. Beeldanalyse van de sferoïden door SpheroidSizer

  1. Open MATLAB, open vervolgens de "Command Window", typt u cd '[Installation Directory] "en druk op [RETURN].
  2. Typ "SpheroidSizer1_0" in het "Command Window" en druk op [RETURN] om het SpheroidSizer programma te starten.
  3. Klik op de "Browse" knop in de SpheroidSizer1.0 venster om het experiment map die alle afbeeldingen bevat.
  4. Selecteer "Inclusief submappen" toggle onder de "Map" tekstveld om meerdere mappen geneste afbeelding onder de aangewezen directory verwerken.
    OPMERKING: Als "Inclusief submappen" toggle niet is geselecteerd, alleen de beelden direct in de map worden verwerkt, en alle submappen worden genegeerd.
  5. Selecteer de optie 'On-the-fly scherm "naar displeg elk gesegmenteerd beeld op bovenkant de bron voor de kwaliteitscontrole van de berekening wordt uitgevoerd.
    OPMERKING: Berekening snelheid is sneller als "On-the-fly scherm" optie is niet gekozen.
  6. Geef "Resolutie" (afbeelding schaal / resolutie in micrometer / pix) van de geanalyseerde beelden in de doos, voor het programma te kunnen metingen van de bolvormige's converteren van pixel tot urn.
    LET OP: Alle afbeeldingen in dezelfde map of samen geanalyseerd moeten onder dezelfde microscoop met dezelfde doelstelling worden genomen, zodat het beeld schaal / resolutie blijft constant voor elk experiment.
  7. (Optioneel) gebruikers kunnen Stap 5 voor geavanceerde gebruiker gedefinieerde instellingen volgen.
  8. Klik op "Bereken" om de berekening te starten.
    OPMERKING: De software voert een automatische bestandsnaam worden gecontroleerd voordat de berekening. Als er een dialoogvenster verschijnt met vermelding - "Fout bestaat in bestandsnaam", klik op "Exit en lijst met fouten te tonen"en de fouten in beursgenoteerde bestandsnamen (zie stap 3.3). Klik vervolgens op "Bereken" om de berekening opnieuw te beginnen.
  9. Klik op "Pauze" knop om de berekening te onderbreken; en berekening kan worden hervat door op dezelfde knop met "Verder".
    OPMERKING: De "resultaten Table" geeft de "Map", "File", "Volume" (in mm 3), "Lengte" (in micrometer), "Width" (in micrometer), en "Geldig" (selectievakje) voor alle geanalyseerde sferoïden (figuur 5C). Volume wordt berekend op basis van de gemeten hoofdas (lengte) en nevenas (breedte) (V = 0,5 * Lengte * Breedte 2). De "Geldig" vakje is een optie voor de gebruiker om te kiezen of de analyse van het beeld is geldig of ongeldig na kwaliteitscontrole, zie stap 6.

5. Geavanceerde gebruiker gedefinieerde instellingen

  1. Klik op "Advanced"-knop in de SpheroidSizer1.0 venster het venster Geavanceerde configuraties om de gebruiker gedefinieerde instellingen (figuur 5B) aan te passen naar voren te brengen.
  2. Voer de bestandsnamen van belang in de "Format Output" en "Lijst Output" dozen in het venster Geavanceerde configuraties onder "Input".
  3. Voer een nummer van "2-10" in het vak "Reduce". Dit is een coëfficiënt voor de software om de beeldgrootte van berekening verminderen om de rekensnelheid te verbeteren. Hoe hoger het getal, hoe sneller de rekensnelheid. De standaard "Reduce" is ingesteld op 10.
  4. Voer de to-be-bewerkte afbeelding bestandsextensie in het vak "Inclusief type".
  5. Voer de extensies of eindes die niet gaan in het vak "Uitsluiten soort" als volgt te worden verwerkt door het programma: "_crude.jpg".
  6. Kies "None" voor "Special Color" naar 8 bit en 16 bit col verwerkenof beelden behoorlijk; kies "12 bit" voor "Special Color" naar 12-bits kleurenafbeeldingen goed te verwerken
  7. Check "Gebruik Parallel Computing" als de computer gebruikt voor beeldanalyse is uitgerust met meerdere CPU's en / of multi-core CPU's. Als dit waar is, ga dan naar stap 5.7.1; zo niet, dan sla dan stappen 5.7.1 en 5.7.2.
    LET OP: Er zal een fout optreden als de computer wordt gebruikt niet de gekozen configuratie ondersteunen.
    1. Controleer de "Use Parallel Computing" optie in het venster Geavanceerde configuraties.
      OPMERKING: Gebruik alleen de parallel computing modus wanneer 4 of meer cores beschikbaar zijn voor de computer.
    2. Box voer een nummer 4-12 in het "# Workers" (cores).
      Opmerking: Dit aantal is gelijk aan of kleiner dan het aantal cores in computer van de gebruiker te zijn. Een maximum van 12 wordt opgelegd door de MATLAB parallel computing toolbox ondersteunt het maximum van 12 cores. Wanneer parallel computing wordt zijning uitgevoerd, een klein dialoogvenster verschijnt en vraagt ​​de gebruiker om te wachten op de parallelle berekening te voltooien; de berekening niet kan worden onderbroken, en evenmin is het "On-the-fly-display"-functie wordt uitgevoerd in parallel computing-modus.

6. Kwaliteitscontrole

  1. Open het corresponderende cel in de "Results" tot de juiste grenscontour van een sferoïde in de geanalyseerde beelden bevestigen
    OPMERKING: Het origineel en de kwaliteitscontrole beelden zal verschijnen op de rechterkant voor beoordeling. De gebruiker kan nagaan alle beelden achter elkaar met behulp van de pijl-omlaag op het toetsenbord.
  2. Verfijnen de grens van de sferoïde op het geselecteerde beeld de volgende twee hulpmiddelen, indien nodig:
    1. Klik op de "Manual initialiseren" om de oorspronkelijke afbeelding weer te geven. Click-and-hold vervolgens de muis direct buiten de bolvormige en sleep de ellips tool om de Sferoïde op de oorspronkelijke afbeelding te dekken.
      OPMERKING: De eenctive-contour algoritme initieert behulp van de door de gebruiker voorgelegd contour en voert convergeren naar de gewenste bolvormige omtrek. De "Uitslagen Stand 'wordt automatisch bijgewerkt met de nieuwe resultaten. De "Manual Initialize" tool kan de gebruiker handmatig voorzien initialisatie voor actieve-contour.
    2. Klik op de knop "Hand Draw" om de oorspronkelijke afbeelding weer te geven. Gebruik vervolgens de muis of een touch-enabled scherm om de grens van de bolvormige precies trekken.
      OPMERKING: Dit overzicht wordt direct gemeten voor grote en kleine assen, die worden bijgewerkt in de "Uitslagen Stand" te genereren. De "Hand Draw" tool wordt alleen gebruikt als de "Manual Initialize" tool niet te convergeren op de gewenste grens van de bolvormige.
  3. Schakel het selectievakje in de "Geldig" kolom in de overeenkomstige rij van de "Results Table", wanneer een beeld bevat geen geldige spheroïde bij inspectie bevatten. Een "; Ongeldig "-label verschijnt in de linkerbovenhoek van het imago van de kwaliteitscontrole. Als "Geldig" is aangevinkt, worden de waarden van alle metingen zijn leeg voor de bolvormige in het geëxporteerde opgemaakte en output resultaten bestanden.
    OPMERKING: de volgende sneltoetsen zijn beschikbaar voor gebruik in de "Result Table": "pijl naar beneden" voor volgende afbeelding; "V" voor geldig / ongeldig; "M" voor "Manual Initialize" tool en "h" voor "Hand Draw" tool.

7. Opslaan en exporteren van gegevens

  1. Klik op de "Export Study" knop in de SpheroidSizer1.0 venster om de tussentijdse toestand van de analyse uitvoeren, als de gebruiker nodig heeft om de software af te sluiten voor het einde van het project. Geef de naam en de directory van het bestand moet worden opgeslagen.
  2. Klik op "Importeren Studie" knop de bovenstaande intermediaire toestand resultaat van "Export Study" terug te brengen en verder te work op.
    OPMERKING: De tussenliggende staat bestanden zijn in een native MATLAB formaat (mat.) En zijn niet rechtstreeks leesbaar door andere softwareprogramma's. Een veiligheidsvoorziening ingebouwd in de software maakt automatische uitvoer van de open-project voor het geval dat het programma wordt afgesloten onbedoeld. Wanneer nodig, kan de gebruiker dit bestand, waarvan de naam begint met "~ tmp" dat de overeenkomstige tijd stempel in de [Installatie Directory] bevat vinden.
  3. Klik op "Format Results" in het SpheroidSizer1.0 venster om de resultaten op te slaan.
    OPMERKING: Twee vormen van de resultaten worden opgeslagen in de directory van het experiment. De geëxporteerde bestandsnamen kan worden geconfigureerd in het venster Geavanceerde configuraties (zie Protocol Stap 5.2). Het formaat output bestand is een tab-afgebakend tafel dat het volume waarde in de oorspronkelijke plaat formaat in de orde van een oplopende nummerplaat voor elk tijdstip organiseert; en alle tijdstippen georganiseerd in een oplopende volgorde (Figuur 5D). De lijst output bestand is een door tabs afgebakend tafel dat alle metingen in de vorm van geordende lijsten (Figuur 5E) bevat.

Representative Results

SpheroidSizer is ontworpen om geautomatiseerde detectie, afbakening en meting van de 3D-sferoïden te produceren, met een aanzienlijke vermindering van arbeid en acuut verhoogde efficiëntie voor grote hoeveelheden afbeeldingen. Figuur 1A toont de workflow van SpheroidSizer. De kern berekening stappen omvatten geautomatiseerde initialisatie, actieve contour algoritme en contour kwantificering. Na automatische berekening, de kwaliteitscontrole-functie maakt gebruik van een combinatie van "Handmatig Initialize" en "Hand Draw" instrumenten om een onvolmaakte segmentatie redden. Figuur 1B toont de gedetailleerde geautomatiseerde actieve contour algoritme. De initialisatie stap (0 iteratie) maakt gebruik van de basisfuncties voor beeldbewerking stappen om geschatte grootte en locatie van de bolvormige genereren en het genereren van een bolvormige initiatie contour met een geschatte grootte. De initiatie contour voedt in de actieve contour algoritme. Op zijn beurt herhaalt te passen aan de lokale afbeeldinghelling en kromming vorm. De actieve contour algoritme eindigt wanneer de contour stabiliseert (convergeert), namelijk 477 iteraties voor het beeld of indien het vooraf bepaalde maximale aantal iteraties uitgevoerd. In dit voorbeeld wordt de initialisatie contour opzet vergroot beter demonstreren het algoritme. In werkelijkheid, de initialisatie is meestal zeer dicht bij de werkelijke grens en veel minder herhalingen nodig zijn voor het algoritme convergeert. Vervolgens heeft de algoritme houdt morfometrische metingen van de gedetecteerde spheroïde grens. De grote en kleine assen van de bolvormige worden gemeten met behulp van MATLAB beeldverwerking toolbox (figuur 1C). De hoofdas wordt gedefinieerd als het lijnsegment verbindt een enkel paar de verste punten op de contour, die wordt aangeduid lengte (L). De kleine as is gedefinieerd als de langste lijn loodrecht op de hoofdas, die wordt aangeduid breedte (W). In dit geval, de waarden van L en W dicht aangezien desferoïde is bolvormig. Het volume van de sferoïde wordt berekend als V = 0,5 * L * W 2.

Een van de kenmerken van SpheroidSizer is de geautomatiseerde detectie van de grens van de sferoïden ook op beelden met oneffen of lawaaierige achtergrond gebruikmaking van de actieve contour algoritme (Figuren 2B-D). Computationele verwerking van helder veld beelden wordt vaak geplaagd door ongelijke achtergrond, die adaptief-thresholding gebaseerde methoden misleidt om ongewenste drempeling resultaten te produceren. Het probleem is vooral duidelijk wanneer multi-well platen worden gebruikt en de wanden van de putjes kunnen schaduweffecten op de afbeeldingen. Omdat de actieve contour algoritme is niet gevoelig voor de geleidelijke verandering in schaduw achtergrond is kan sferoïde segmentatie identificeren die helderveld beelden met goede initialisatie. Figuur 2 toont een paar voorbeelden van beelden met oneffen of lawaaierige achtergrond, zoals ongelijke verlichting (Figuur 2B (figuur 2C) of necrotische kern (figuur 2D). Met geautomatiseerde actieve contour algoritme SpheroidSizer schetst deze sferoïden nauwkeurig in al deze beelden zoals in de rode contour bij het onderste paneel van elke figuur.

De kwaliteitscontrole kenmerk van SpheroidSizer is de sleutel tot een high-throughput workflow. De "Manual Initialize" en "Hand Draw" tools zijn de waardevolle gratis gereedschappen voor deze toepassing. Onder de honderden of duizenden afbeeldingen, is het onvermijdelijk dat de geautomatiseerde algoritme is niet in staat om de bolletjes correct te detecteren in sommige beelden. Zoals geïllustreerd in figuur 3A, wanneer onjuiste detectie van de bolvormige wordt veroorzaakt door de initialisatie stap, dwz onjuiste omvang of ligging van de inleiding contour in het beeld (bovenste paneel), de "Manual Initialize" tool werkt doordat de gebruiker goed bepalen de plaats en grootte van de spheroid handmatig (onderste paneel). Het startsein voor de actieve contour algoritme om te starten met handmatig gedefinieerde contour en uit te voeren om te convergeren naar de gewenste omtrek. Voor deze moeilijke beelden als het originele beeld in figuur 3B, is de bolvormige gelegen in een afleidende en lawaaierige achtergrond. SpheroidSizer is niet in staat om de bolvormige goed te identificeren door de geautomatiseerde methode (bovenste paneel) of door de "Manual Initialize" tool met de juiste initialisatie (middelste paneel). In dit geval kan de "Hand Draw" tool worden gebruikt om de omtrek van de bolvormige handmatig trekken, zoals weergegeven in het onderste paneel. Het programma gebruikt de gebruiker gedefinieerde grens tot de grote en kleine assen van de bolvormige meten en berekenen van het volume. Alle gecorrigeerde resultaten worden onmiddellijk opgenomen in de "Uitslagen Stand" en dienovereenkomstig kunnen worden geëxporteerd.

Om de prestaties van SpheroidSizer in grotere datasets bepalen we eerst vergelijken bedrijfstijd doorhet analyseren van de dezelfde set van 288 beelden met behulp van 1) handmatige metingen met microscoop leverancier geleverde software; 2) SpheroidSizer met een single-core gewone laptop; en 3) SpheroidSizer met een multi-core parallel computing prestaties werkstation. De handmatige metingen volgen ons typisch protocol voor ontwikkeling van de programmatuur: de lengte en breedte van elke sferoïde worden getrokken met de hand en gemeten met de programmaleverancier (gezien de rode lijnen in het bovenste deel van figuur 4A); Vervolgens kopieert de gebruiker de waarden van de metingen. SpheroidSizer verwerkt elk beeld door het genereren van de bolvormige grens (zoals de rode omtrek in het onderste deel van figuur 4A), meten van de axiale grote en kleine lengte en exporteren van de resultaten in spreadsheets. Zoals blijkt uit tabel 1, gebaseerd op de berekening van 288 beelden duurt gemiddeld 31,67 sec tot een bolvormige per beeld handmatig meten; terwijl het duurt maar SpheroidSizer minder dan 2 sec & # 160; bij het rijden op een single-core gewone laptop; en minder dan 1 sec bij het rijden op een 12-core prestaties werkstation. Daarom beeldanalyse is dan 18x sneller per beeld met behulp SpheroidSizer dan handmatige metingen. Het vermindert drastisch arbeid wanneer meer dan duizend beelden worden geanalyseerd. Vervolgens vergelijken we de variabiliteit in de metingen van de 24 bolletjes in figuur 4A tussen handmatige metingen en SpheroidSizer. De 24 sferoïden worden driemaal gemeten met beide methoden; en de standaardafwijking van elke afzonderlijke sferoïde berekend. Zoals te zien in figuur 4B, de standaarddeviatie van SpheroidSizer (groene lijn en stippen) dicht bij nul, behalve voor de drie bolletjes die worden gecorrigeerd bij de kwaliteitscontrole stap, die nog steeds blijkt kleinere standaarddeviatie dan die uit de handmatige metingen methode. Al deze geven aan dat SpheroidSizer voert de beeldanalyse efficiënter en nauwkeuriger.

e_content "> Wij hebben een drug scherm met behulp van menselijke BON-1 3D bolvormige tumoren uit te zoeken welke verbindingen in combinatie met een Hsp90-remmer zijn de potentiële kandidaten voor het testen van de anti-tumor effecten in vivo. Menselijke BON-1 3D bolvormige tumoren werden gekweekt on-agarose gecoate 96-well platen zoals beschreven in het vorige artikel 15. Acht verschillende verbindingen met zes seriële verdunningen plus media en trucks werden gescreend op hun single en combinatorische effecten 10 nM en 20 nM Hsp90 remmer in duplo respectievelijk. Twee sferoïden werden voor elke concentratie van de afzonderlijke verbinding of de gecombineerde verbindingen. Vier 96-well platen met totaal 384 sferoïden werden gebruikt. Alle sferoïden werden afgebeeld op 0, 72, 144, 168 en 192 uur. totaal 1920 beelden geproduceerd van dit experiment. Het duurde SpheroidSizer slechts 30 minuten naar de computationele analyse van de 1920 foto's compleet met een extra 50 min voor de kwaliteitscontrole en data-export. SpheroidSizer versnelt het beeldanalyse proces enorm. Figuur 5A toont een screenshot van de map regelingen en bestandsnamen voor dit experiment als een voorbeeld voor het protocol Stap 3.3. figuren 5B-E toont de screenshots van de beeldanalyse pop-up vensters en resultaten . gebruik SpheroidSizer als illustraties voor Protocol stap 4, 5, en 7, waarbij de volumes van de 3D sferoiden van de geformatteerde resultaten tabel geëxporteerd uit SpheroidSizer, we grafieken - groei van 3D bolvormige tumoren bij samengestelde behandelingen versus tijd van behandelingen. Twee representatieve grafieken van dit experiment worden getoond in Figuur 5F en 5G. Figuur 5F toont aan dat de gecombineerde behandelingen van Hsp90 remmer en cladribine (groene lijn) remmen de groei van 3D sferoiden meer dan de enkele behandeling van Hsp90 remmer (paarse lijn) of cladribine (oranje lijn), wat suggereert dat de gecombineerde behandelingen van Hsp90-remmer en cladribine kunnen anti-tumor ef hebbenfecten in vivo. Figuur 5G toont aan dat de gecombineerde behandelingen van Hsp90 remmer en adriamycine (groene lijn) remt de groei van 3D sferoiden meer dan de enkele behandeling van adriamycine (oranje lijn) of Hsp90 remmer (paarse lijn), wat suggereert dat de gecombineerde behandeling van Hsp90 remmer en adriamycine niet anti-tumor effecten in vivo. Dit experiment heeft ons geholpen de verbindingen beter te selecteren om hun anti-tumor effecten te testen in vivo en SpheroidSizer is de sleutel tot de snelle experimentele data-analyse.

Tabel 1
Tabel 1. Vergelijking van de bedrijfstijd op beeldanalyse tussen handmatige metingen en SpheroidSizer bij het ​​analyseren van de zelfde reeks van 288 beelden. Gelieve clik hier voor een grotere versie van deze tabel bekijken.

Figuur 1
Figuur 1 SpheroidSizer -... Een open-source software-applicatie voor het meten van de grootte van de bolvormige A) De kern workflow van de aanvraag B) Illustratie van de actieve contour algoritme in verschillende stadia van iteratie. Let op: de initialisatie contour (iteratie 0) opzet werd uitgebreid om het algoritme. C) De major en minor axiale lengte metingen en berekening van het volume door SpheroidSizer showcase. L - hoofdas: het lijnsegment verbindt een paar verste punten op de contour (bedoelde lengte); W - nevenas: de langste lijn loodrecht op de hoofdas (hierna breedte).

class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "altijd"> Figuur 2
Figuur 2. Representatieve resultaten van de geautomatiseerde segmentatie van SpheroidSizer, tonen de robuustheid tegen verschillende voorwaarden afbeelding. A) Typische beelden van goede kwaliteit. B) afbeeldingen met verschillende helderheid en contrast. C) Afbeeldingen met afleidende puin. D) Afbeeldingen van bolletjes met necrotische kern . Beelden op het bovenpaneel van elke figuur zijn de bron / originele beelden; beelden op het onderste paneel van elke figuur zijn de kwaliteitscontrole beelden; en de rode omtrek is de bolvormige segmentatie getrokken door geautomatiseerde berekening.

hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/>
Figuur 3. Illustratie van de "Manual Initialize" en "Hand Draw" gereedschap. A) De "Manual Initialize" tool maakt het mogelijk de tekening van een passende ellipsvorm over de spheroïde voor initialisatie, wanneer onjuiste spheroïde segmentatie optreedt na de automatische initialisatie. B ) De "Hand Draw" tool maakt nauwkeurige hand-tekening van de bolvormige grens, wanneer onjuiste spheroïde segmentaties optreden met zowel automatische en handmatige initialisatie. De blauwe lijn rond de bolvormige toont de initialisatie contour; de rode contour is de geïdentificeerde spheroïde grens. Let op: de bolvormige in "Manual initialiseren" in A) en de bolvormige in "Hand Draw" in B) met opzet wordt vergroot om de gereedschappen beter presenteren.

Figuur 4 Figuur 4. Vergelijking van beeldanalyse prestaties tussen SpheroidSizer en handmatige metingen bij het ​​analyseren van de zelfde reeks van 24 beelden. A) Representatieve sferoïden te tonen hoe de lengte en breedte van sferoïden worden bepaald door handmatige metingen en SpheroidSizer. Top 24 beelden bevatten handgetekende lengte / breedte van elke spheroïde in rode lijnen met behulp van handmatige metingen; onderste 24 beelden (dezelfde 24 foto's) bevatten computergetekende spheroïde grens in rood overzicht behulp SpheroidSizer. B) Standaardafwijking van lengte of breedte van drie metingen op elke afzonderlijke spheroïde.

Figuur 5
Figuur 5. Een representatief voorbeeld van het gebruik van SferoïdeSizer in drug scherm - beeldanalyse op beelden van de bolletjes 'die werden verzameld uit een drug scherm met behulp van BON-1 3D bolvormige tumoren A) Een screenshot van de map regelingen en bestandsnamen voor dit project B) Een screenshot van het gevorderde.. configuraties venster in SpheroidSizer. C) Een screenshot van SpheroidSizer1.0 venster met weergegeven Uitslagen Stand. D) Een screenshot van het formaat output bestand geëxporteerd uit SpheroidSizer. E) Een screenshot van de lijst output file geëxporteerd uit SpheroidSizer. F) groei van 3D bolvormige tumoren bij de behandelingen met Hsp90 remmer en cladribine. G) De groei van 3D bolvormige tumoren bij de behandelingen met Hsp90 remmer en adriamycine. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. </ P>

Discussion

Deze studie geeft een snelle, flexibele, efficiënte en geautomatiseerde programma - SpheroidSizer voor nauwkeurige bepaling van de omvang van 3D bolvormige tumoren. SpheroidSizer is gemakkelijk te gebruiken en vereist minimale gebruikersinvoer. De meest kritische stappen voor nauwkeurige, soepele en succesvolle werking van SpheroidSizer omvatten: de sferoïden zijn afgebeeld in het midden van het veld, zonder de rand van de put raken; alle bestanden naar elkaar worden geanalyseerd als een project moet onder dezelfde microscoop met dezelfde doelstelling worden afgebeeld; alle bestanden te analyseren correct benoemd en gerangschikt zoals aangegeven in het protocol; en juist door de gebruiker gedefinieerde instellingen worden voor de berekening opgenomen.

De voordelen van SpheroidSizer omvatten de mogelijkheid om de achtergrond geleidelijke verandering in het beeld tolereren en gladde contouren die beantwoorden aan de algemene bolvormen van de sferoïden gebruik van de werkzame contour algoritme genereren. Prestaties van actievecontour kan worden aangetast in twee situaties: slechte initialisatie, of de aanwezigheid van andere lokale randen afleiden van de gewenste contour. Specifiek in onze geteste gevallen, de tweede situatie soms gebeuren wanneer de necrotische kern van een grote bolvormige trekt de actieve contour resulteert in kleinere contour worden gemeld. Het is vermeldenswaard dat andere geautomatiseerde drempelwaarde gebaseerde methoden lijden ook in deze situatie indien de drempel specifiek handmatig ingesteld. De software Daarom stelt poging om gebruikers te helpen opsporen en verhelpen gecompromitteerd segmentatie door middel van eenvoudige kwaliteitscontrole functies. Als segmentatie fout gebeurt uit arme initialisatie, kan gebruik "Manual Initialize" tool gebruiken om de automatische initialisatie overschrijven. Wanneer de beeldkwaliteit is te slecht voor actieve contour, kunnen gebruikers gemakkelijk "Hand Trekt" de contour die feeds in kwantificering. Bestaande software zoals CellProfiler kan worden aangepast voor deze toepassing in een semi-automatische mode-n. De workflow kan lastig zijn wanneer grote hoeveelheden beelden met verschillende beeldvormende voorwaarden wordt overgelegd of een subset van de beelden heeft meer menselijke interventie te kunnen meten. SpheroidSizer biedt een alles-in-een suite voor berekening en kwaliteitscontrole aan high-throughput beeldanalyse workflow beheren.

SpheroidSizer is momenteel beperkt tot het opsporen van een bolvormige per beeld en meet alleen de axiale lengte van de bolvormige. Het programma kan worden uitgebreid ter ondersteuning verdere kwantificering nodig door onderzoekers zoals kwantificering van sferoïden met necrotische kern, constateren van meervoudige sferoïden in een beeld of controle van de vorm van sferoïden. Verder kan het programma worden aangepast voor het detecteren en meten van de grootte van de tumoren uitgesneden uit dierlijke of menselijke, die zeker gunstig voor onderzoekers wanneer die tijdens vivo preklinische of klinische onderzoek. Post-processing van de gedetecteerde sferoiden kan ook worden onderzocht doeling op het verminderen van menselijke inspanning die nodig is voor de kwaliteitscontrole en verdere verbetering van de doorvoer. SpheroidSizer is een algemene beeldanalyse verzoek om 3D bolvormige tumoren die worden geproduceerd uit elke celtypes, en daarom kan worden gebruikt door een brede kankeronderzoekgemeenschap.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

We willen graag de Raymond en Beverly Sackler Stichting bedanken voor hun steun aan ons onderzoek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axiovert 200M inverted microscope Carl Zeiss Microscopy, LLC microscope for imaging
Vostro 1720 Dell Inc. single-core regular laptop
HP Z820 HP Inc. multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a Mathworks, Inc, Natick, MA MATLAB software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamilton, G. Multicellular spheroids as an in vitro tumor model. Cancer Lett. 131, 29-34 (1998).
  2. Sutherland, R. M., McCredie, J. A., Inch, W. R. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. J Natl Cancer Inst. 46, 113-120 (1971).
  3. Inch, W. R., McCredie, J. A., Sutherland, R. M. Growth of nodular carcinomas in rodents compared with multi-cell spheroids in tissue culture. Growth. 34, 271-282 (1970).
  4. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
  5. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat Protoc. 4, 309-324 (2009).
  6. Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37, 3639-3643 (1977).
  7. Ayers, G. D., et al. Volume of preclinical xenograft tumors is more accurately assessed by ultrasound imaging than manual caliper measurements. J Ultrasound Med. 29, 891-901 (2010).
  8. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
  9. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
  10. Monazzam, A., et al. A new, fast and semi-automated size determination method (SASDM) for studying multicellular tumor spheroids. Cancer Cell Int. 5, 32 (2005).
  11. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  12. Chan, V. L. Active contours without edges. IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).
  13. Bernard, O., Friboulet, D., Thevenaz, P., Unser, M. Variational B-spline level-set: a linear filtering approach for fast deformable model evolution. IEEE Trans Image Process. 18, 1179-1191 (2009).
  14. Kass, M. W. A., Terzopoulos, D. Snakes: Active contour models. International Journal of Computer Vision. 1, 321-331 (1987).
  15. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. J Vis Exp. (66), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics