Hochdurchsatz-Analyse von Bild Tumorsphäroide: Eine benutzerfreundliche Software-Anwendung, um die Größe der Sphäroide automatisch und präzise messen

Biology
 

Summary

Wir präsentieren ein Hochdurchsatz-Bildanalyse-Software-Anwendung, um die Größe von dreidimensionalen Tumorsphäroide mit Hellfeldmikroskopie abgebildet messen. Diese Anwendung bietet einen schnellen und effektiven Weg, um die Auswirkungen von Drogen auf therapeutische Sphäroiden, die vorteilhaft für die Forscher, die Sphäroiden in Drogen-Bildschirme verwenden wollen, ist zu prüfen.

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Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately. J. Vis. Exp. (89), e51639, doi:10.3791/51639 (2014).

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Abstract

Die zunehmende Anzahl von Anwendungen von dreidimensionalen (3D) Tumorsphäroide als in vitro-Modell für die Wirkstoffforschung erfordert die Anpassung an die großen Screening-Formate in jedem Schritt eine Droge Bildschirm, einschließlich Großbildanalyse. Derzeit gibt es keine ready-to-use und kostenlose Bildanalyse-Software, um dieses Großformat zu erfüllen. Die meisten bestehenden Verfahren die Länge und Breite der abgebildeten 3D Sphäroiden, die eine langwierige und zeitraubender Prozess ist manuell zeichnen. Diese Studie stellt eine High-Throughput-Bildanalyse-Software-Anwendung - SpheroidSizer, die die Haupt-und Neben axiale Länge der abgebildeten 3D Tumorsphäroide automatisch und genau misst; berechnet das Volumen der einzelnen 3D Tumor Sphäroid; gibt dann die Ergebnisse in zwei unterschiedlichen Formen in Tabellen für einfache Manipulationen bei der nachfolgenden Analyse der Daten. Der Hauptvorteil dieser Software ist die leistungsstarke Bildanalyse-Anwendung, istfür eine große Anzahl von Bildern geeignet. Es bietet Hochdurchsatz-Berechnung und Kontrolle der Qualität der Arbeitsabläufe. Die geschätzte Zeit bis 1000 Bilder zu verarbeiten ist etwa 15 min auf einem minimal konfigurierten Laptop oder etwa 1 min auf eine Mehrkern-Leistungs Workstation. Die grafische Benutzerschnittstelle (GUI) ist auch für die einfache Qualitätskontrolle entwickelt, und die Benutzer können die Ergebnisse Computer manuell überschreiben. Die Key-Verfahren in dieser Software verwendet wird, aus dem aktiven Konturalgorithmus, der auch als Schlangen bekannt, die sich besonders für Bilder mit ungleichmäßige Beleuchtung und laute Hintergrund, die oft plagt automatisierte Bildverarbeitung im Hochdurchsatz-Screens ist angepasst. Das kostenlose "Manual initialisieren" und "Hand-Draw"-Tools bieten die Flexibilität, SpheroidSizer im Umgang mit verschiedenen Arten von Sphäroiden und diverse hochwertige Bilder. Diese High-Throughput-Bildanalyse-Software deutlich reduziert Arbeit und beschleunigt den Analyseprozess. Die Umsetzung dieser Software ist beneficial für 3D Tumorsphäroide um eine Routine in vitro-Modell für Drogen-Bildschirme in Industrie und Wissenschaft zu werden.

Introduction

Dreidimensionale (3D) Tumorsphäroide sind "kugelsymmetrisch Aggregate von Tumorzellen analog zu Geweben, ohne künstliche Substrat für Zellhaftung" 1-3. Die Zytologie und Morphologie des Tumorsphäroide besser imitiert die in vivo-Tumorgewebe Organisation und Mikroumgebungen als Monolayer zweidimensionalen (2D-) Zellen. 3D Tumorsphäroide haben sich zu einem praktischen in-vitro-Modell für die Hochdurchsatz-Screening von Anti-Krebs-Therapie oder eine Prüfung der Wirksamkeit von Arzneimittelkandidaten vor in-vivo-Tier oder klinische Prüfung 4. Klinisch wird die Wirksamkeit einer Anti-Krebs-Medikament Behandlung auf der Grundlage reduzierten Tumorwachstum untersucht. Analog kann Sphäroid Volumens als Maß für die Wirksamkeit für die in vitro-Studien Krebsmittel verwendet werden. Sphäroid Volumen (V = 0,5 * Länge * Breite 2) basierend auf dem Haupt-und Nebenachsenlänge bestimmt (besser bekannt als Länge und Breite bekannt)der Sphäroide 6, 7. Die meisten Forscher haben, um die Länge und Breite auf jeder Sphäroid manuell zeichnen, oft mit Hilfe der Mikroskopie von Unternehmen angeboten und zusammen mit den bildgebenden Instrumente verkauften Software. Diese Technik wird problematisch, wenn Hochdurchsatz-Drogen-Bildschirme werden durchgeführt und mehr als hundert Bilder erzeugt werden. Einige neuere Studien über die Verwendung von Open-Source-Bildanalyse-Software Toolboxen wie CellProfiler 8-10 und ImageJ 11 bis rudimentär Segmentierung Routinen / Makros, die Beleuchtungskorrektur und einfache Schwellen beteiligt zu entwickeln. Diese Routinen müssen oft für verschiedene Chargen von Bildern entsprechend dem Beleuchtungszustand und der Bildkontraständerung neu eingestellt werden; Daher können diese Software-Pakete die Robustheit Bedarf des Hochdurchsatz-Bildanalyse nicht erfüllen. Friedrich und Mitarbeiter (2009) verwendet proprietäre Software, um die Lautstärke halb autom des Sphäroid messenmatisch 5. Die in Monazzam und seine Kollegen "Papier 10 beschriebenen Methode war eine halbautomatische Methode, um die Größe Sphäroid nur für eine kleine Anzahl von Bildern messen. Daher besteht eine klare Notwendigkeit für eine robuste, flexible, automatisierte und ready-to-use Bildanalysewerkzeuge für die 3D-Tumorsphäroide.

In dieser Studie beschreiben wir SpheroidSizer - ein MATLAB-basierten Open-Source-Software-Anwendung, um die Größe der Tumorsphäroide automatisch und genau zu messen. SpheroidSizer ist für viele verschiedene Chargen von Bildern 3D Sphäroide in der gleichen Sitzung zu verarbeiten. Mit Hilfe der aktiven Konturalgorithmus 12-14, kann SpheroidSizer Bildkontraständerung zu tolerieren, robust ignorieren allmähliche Veränderung der Hintergrundbeleuchtung und erkennen, Sphäroiden im Bild. Es kann auch tolerieren viele üblichen Artefakte, z. B. Schmutz, entstand aus der Probe. Der Arbeitsablauf ist so gestaltet, dass die Nutzer die Qualität contro durchführen könnenl während oder nach der Berechnung. Manuelle Überschreiben des Analyseergebnisses kann leicht an Ort und Stelle durchgeführt werden. Unter Ausnutzung der Parallel Computing Toolbox kann die Analysegeschwindigkeit durch Koordination mehrerer Rechenkerne auf die Berechnung gleichzeitig auf dem Computer eines Benutzers arbeiten gesteigert werden. Darüber hinaus SpheroidSizer gibt die Ergebnisse in zwei verschiedenen Formen auf einfache Schnittstellen mit nachgeschalteten Analysetools ermöglichen.

Protocol

1. 3D Tumorsphäroide Bildung, medikamentöse Behandlungen und Bildsammlung werden als in unserer früheren Arbeit 15 beschrieben durchgeführt.

2. Software-Installation

  1. Installieren lizenzierten MATLAB-Software auf dem Computer für die Bildanalyse verwendet. Die folgenden Toolboxen von MATLAB sind auch erforderlich, um installiert werden - Signal Processing Toolbox, Image Processing Toolbox, und Parallel Computing Toolbox * (* für Parallel-Computing-Modus nur benötigt).
    HINWEIS: Viele Universitäten zu erwerben und zu pflegen Gruppe Lizenzen, so dass die Software kann kostenlos heruntergeladen und von verbundenen Wissenschaftler verwendet werden.
  2. Installieren SpheroidSizer Programm von SpheroidSizer.zip Datei (http://pleiad.rwjms.rutgers.edu/CBII/downloads/SpheroidSizer.zip):
    1. Speichern Sie die ZIP-Datei in Ihrem lokalen Dateisystem.
    2. Entpacken Sie die Datei SpheroidSizer.
    3. Speichern Sie die Dateien in einem bestimmten Verzeichnis / Ordner, die später als t bezeichnet wirder "Installationsverzeichnis".
      HINWEIS: SpheroidSizer wurde ausgiebig auf einem Windows 7 Betriebssystem getestet. Es wird erwartet, dass auf alternative Betriebssysteme mit minimalen Anpassungen (nicht getestet) zu arbeiten.

3. Vorbereitung für die Bildanalyse von SpheroidSizer

  1. Bestimmen Sie den Bildmaßstab / Auflösung des Abbildungssystems (absolute Maßstab des Bildes in Mikrometern pro Pixel (um / pix)).
    HINWEIS: Wenn die Größe der einzelnen Pixel auf dem Kamerachip bekannt ist, kann das Bild als Maßstab Objektivvergrößerung x Pixelgröße (um / pix) berechnet werden. Dieser Wert kann von der Abbildungssoftware mit dem Mikroskop als eingebettete Metadaten oder mit Hilfe der Bilderzeugungssystem ausgestattet Anbieter erhalten werden. Dieser Wert wird in Schritt 4.6 erforderlich.
  2. Wandeln Sie alle proprietäre Bildformate der akzeptierten Dateiformate - TIFF, JPEG und anderen gängigen Bilddateiformate.
  3. Nennen Sie Bilddateien und arrangieren directoriES (Fig. 5A).
    HINWEIS: Die Software setzt auf die richtige Anordnung der Verzeichnisstruktur und Dateinamen, um die Ergebnisse in Plattenformat zu formatieren:
    1. Nennen Sie die Bilddateien im folgenden Format: [Plattenname] _ [Zeile] [Spalte] [Erweiterung] oder [Plattenname] [Leerzeichen] [Zeile] [Spalte] [Erweiterung]... [Zeile] folgt der alphabetischen Reihenfolge und [Spalte] folgt die numerische Reihenfolge.
      HINWEIS: Frei verfügbare automatische Batch-Umbenennung Software zu finden, um Benutzer in diesem Schritt zu unterstützen.
    2. Ordnen Sie das Verzeichnis / Ordner auf der Basis der Versuch in folgender Weise: Jedes Experiment sollte ein Verzeichnis haben. Unter Verzeichnis jedes Experiment, sollte es Unterverzeichnisse für jede Zeitpunkt sein. Unter jedem Zeitpunkt Verzeichnis, sollte es alle Bilder von allen Platten sein.
      HINWEIS: Damit die Analyseergebnisse, um optimal in den formatierten Ergebnisse sortiert werden, empfehlen wir, den gleiche Anzahl von Ziffern für jede Kennung, indem 0 auf der left, z. B. Zeitpunkte werden als 000H, 072h und 144H benannt.

4. Bildanalyse der Sphäroide durch SpheroidSizer

  1. Offene MATLAB, dann öffnen Sie die "Command Window" cd "[Installationsverzeichnis]" und drücken Sie [RETURN].
  2. Geben Sie "SpheroidSizer1_0" in der "Command Window" und drücken Sie [RETURN], um das Programm zu starten SpheroidSizer.
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Durchsuchen" in der SpheroidSizer1.0 Fenster, das Experiment Verzeichnis, das alle Bilder enthält.
  4. Wählen Sie "Unterordner einbeziehen" Toggle unter dem "Ordner" Textfeld, um mehrere verschachtelte Bild Ordner unter dem Verzeichnis bezeichnet verarbeiten.
    HINWEIS: Wenn Sie "Unterordner einbeziehen" Knie nicht ausgewählt ist, werden nur die Bilder direkt unter dem Verzeichnis verarbeitet werden, und alle Unterordner werden ignoriert.
  5. Wählen Sie die Option "On-the-fly-Display", um displegen jedes Bild segmentiert auf der Bildquelle für die Qualitätskontrolle, wie die Berechnung ausgeführt wird.
    HINWEIS: Die Berechnung ist schneller, wenn "On-the-fly-Display"-Option nicht gewählt wird.
  6. Geben Sie "Resolution" (Bildmaßstab / Auflösung in um / pix) der analysierten Bilder in der Box, damit das Programm korrekt Messungen der Sphäroid wandeln von Pixel zu um.
    HINWEIS: Alle Bilder im gleichen Ordner oder gemeinsam analysiert, sollte unter dem gleichen Mikroskop mit dem gleichen Ziel genommen werden, so dass der Bildmaßstab / Auflösung für jedes Experiment konstant bleibt.
  7. (Optional) Benutzer können Sie Schritt 5 für erweiterte benutzerdefinierte Einstellungen folgen.
  8. Klicken Sie auf "Berechnen", um die Berechnung zu starten.
    HINWEIS: Die Software führt eine automatische Dateinamen-Check, bevor Sie mit der Berechnung. Wenn ein Dialogfeld anzeigt, zeigt sich - "Fehler existiert in Dateiname", klicken Sie auf "Beenden und zeigen Liste von Fehlern"und beheben Sie die Fehler im Dateinamen enthalten sind (siehe Schritt 3.3). Dann klicken Sie auf "Berechnen", um die Berechnung erneut starten.
  9. Klicken Sie auf "Pause"-Taste, um die Berechnung anzuhalten; und die Berechnung kann durch Anklicken der gleichen Taste mit "Weiter" wieder aufgenommen werden.
    HINWEIS: Die "Ergebnistabelle" zeigt die "Ordner", "Datei", "Volume" (in mm 3), "Länge" (in um), "Breite" (in um) und "Valid" (siehe Kasten) für alle analysierten Sphäroide (Fig. 5C). Volumen wird auf der Grundlage des gemessenen Hauptachse (Länge) und Nebenachse (Breite) berechnet (V = 0,5 * Länge * Breite 2). Das "Gültig" Kontrollkästchen ist eine Option für die Benutzer zu wählen, wenn die Analyse des Bildes ist nach der Qualitätskontrolle gültig oder ungültig ist, siehe Schritt 6.

5. Erweiterte Benutzerdefinierte Einstellungen

  1. Klicken Sie auf "Erweitert" in der SpheroidSizer1.0 Fensters, um das Fenster Erweiterte Konfigurationen, um benutzerdefinierte Einstellungen (5B) einstellen zu bringen.
  2. Geben Sie die Dateinamen von Interesse in der "Output Format" und "Listenausgabe"-Boxen in der erweiterten Konfigurationen Fenster unter "Input".
  3. Geben Sie eine Zahl von "2-10" in der "Reduce"-Box. Dies ist ein Koeffizient für die Software, die Bildgröße bei der Berechnung, um die Rechengeschwindigkeit zu verbessern reduzieren. Je größer die Zahl ist, desto schneller ist die Rechengeschwindigkeit. Der Standard "Reduce" auf 10 gesetzt.
  4. Geben Sie die zu-sein-Bild verarbeitet Dateierweiterung in das "Include-Typ"-Box.
  5. Geben Sie die Image-Datei-Erweiterungen oder Enden, die nicht gehen, um durch das Programm in der "Ausschließen Art"-Box wie folgt verarbeitet werden: "_crude.jpg".
  6. Wählen Sie "None" für "Sonderfarbe" auf 8 Bit und 16 Bit verarbeiten coloder Bilder richtig; wählen "12-Bit" für "Spezialfarbe" 12-Bit-Farbbilder richtig verarbeiten
  7. Kreuzen Sie "Parallel Computing", wenn der Computer für die Bildanalyse verwendet wird, mit mehreren CPUs und / oder Multi-Core-CPUs ausgestattet. Wenn das wahr ist, dann gehen Sie zu Schritt 5.7.1; wenn nicht, dann überspringen Sie die Schritte 5.7.1 und 5.7.2.
    HINWEIS: Ein Fehler tritt auf, wenn der Computer verwendet nicht die gewählte Konfiguration nicht unterstützt.
    1. Aktivieren Sie die Option "Use Parallel Computing", im Fenster Konfigurationen.
      HINWEIS: Verwenden Sie nur das Parallel-Computing-Modus, wenn 4 oder mehr Kerne sind für den Computer verfügbar.
    2. Geben Sie eine Zahl von 4-12 in den "# Workers" (Rechenkerne) ein.
      Anmerkung: Diese Zahl ist gleich oder kleiner als die Anzahl von Recheneinheiten in dem Computer des Benutzers zu sein. Ein Maximum von 12 wird durch die MATLAB Parallel Computing Toolbox unterstützt die auferlegten maximal 12 Kerne. Beim Parallel-Computing wird seining ausgeführt wird, ein kleines Dialogfenster zeigt den Benutzer auffordert, für die parallele Berechnung bis zum Ende zu warten; die Berechnung kann nicht angehalten werden, und noch ist die Funktion "Display On-the-fly" in Parallel-Computing-Modus ausgeführt.

6. Qualitätskontrolle

  1. Klicken Sie auf die entsprechende Zelle in der "Ergebnistabelle", um den genauen Grenzkontur eines Sphäroid in den analysierten Bilder zu bestätigen,
    Hinweis: Der Original und die Qualitätskontrolle Bilder werden zeigen, bis auf der rechten Seite für die Überprüfung. Der Benutzer kann alle Bilder, die nacheinander zu prüfen mit dem Pfeil nach unten auf der Tastatur.
  2. Verfeinern der Grenze des Sphäroids auf dem ausgewählten Bild unter Verwendung der folgenden zwei Werkzeuge, falls erforderlich:
    1. Klicken Sie auf die "Hand initialisieren", um das Originalbild anzuzeigen. Dann klicken Sie und halten Sie die Maus direkt vor der Sphäroid und ziehen Sie die Ellipse-Werkzeug, um das Sphäroid auf dem Originalbild zu decken.
      HINWEIS: Die einective-Kontur-Algorithmus initiiert mit dem Benutzer übermittelten Kontur und ausführt, um auf die gewünschte Kontur Sphäroid konvergieren. Die "Ergebnistabelle" automatisch mit den neuen Ergebnissen aktualisiert. Der "Leitfaden Initialize"-Tool kann der Anwender manuell für aktive Kontur bieten Initialisierung.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hand Draw", um das Originalbild anzuzeigen. Dann nutzen Sie die Maus oder einen Touchscreen, um die Grenze des Sphäroiden genau zu zeichnen.
      HINWEIS: Diese Übersicht wird direkt gemessen, um Haupt-und Nebenachsen, die in der "Ergebnistabelle" aktualisiert generieren. Die "Hand Draw"-Tool wird nur verwendet, wenn die "Hand initialisieren" Tool ist nicht auf die gewünschte Grenze der Sphäroid konvergieren.
  3. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen in der "Valid"-Spalte in der entsprechenden Zeile der "Ergebnistabelle", wenn ein Bild keine gültigen Sphäroid bei der Untersuchung enthalten. Eine "; Ungültige Bezeichnung "erscheint in der oberen linken Ecke der Kontrolle der Qualität der Bild. Wenn "Gültig" nicht aktiviert ist, sind die Werte aller Messungen leer für die Sphäroid in den exportierten formatierte Dateien und Ausgabeergebnisse.
    HINWEIS: Die folgenden Tastenkombinationen sind in der "Ergebnistabelle" zur Verfügung zu bedienen: "Pfeil nach unten" für das nächste Bild; "V" für gültig / ungültig; "M" für "Manuell Initialisieren"-Tool und "h" für "Hand Draw"-Tool.

7. Speichern und Exportieren von Daten

  1. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Export-Studie" in der SpheroidSizer1.0 Fenster, um den Zwischenzustand der Analyse exportieren, wenn der Benutzer die Software vor dem Abschluss des Projektes verlassen muss. Geben Sie den Namen und das Verzeichnis der Datei gespeichert werden.
  2. Klicken Sie auf "Import-Studie" wieder das oben Zwischenzustand Ergebnis von "Export-Studie" zu bringen und weiter zu work auf sie.
    HINWEIS: Die Zwischenzustand-Dateien sind in einer nativen MATLAB-Format (Matte.) Und sind nicht durch andere Software-Programme direkt lesbar. Eine Sicherheitsfunktion in die Software integriert ist eine automatisierte Export der offenen Projekt, falls das Programm beendet unabsichtlich. Bei Bedarf kann der Anwender diese Datei, deren Name mit "~ tmp", dass die entsprechenden Zeitstempel in der [Installationsverzeichnis] ​​enthält zu finden.
  3. Klicken Sie auf "Format Ergebnisse" in der SpheroidSizer1.0 Fenster, um die Ergebnisse zu speichern.
    HINWEIS: Zwei Formen der Ergebnisse werden im Verzeichnis des Experiments gespeichert. Die exportierten Dateinamen können in der erweiterten Konfigurationen Fenster konfiguriert werden (siehe Protokoll Schritt 5.2). Das Format der Ausgabedatei ist ein tab-abgegrenzte Tabelle, die den Volumenwert in die ursprüngliche Plattenformat in der Reihenfolge der aufsteigenden Plattennummer für jeden Zeitpunkt organisiert; und alle Zeitpunkte in aufsteigender Reihenfolge (5D) organisiert. Die Liste output Datei ist ein tab-abgegrenzte Tabelle, die alle Messungen in Form von geordneten Listen (5E) enthält.

Representative Results

SpheroidSizer wurde entwickelt, um automatisierte Erkennung, Abgrenzung und Messung der 3D-Sphäroiden zu produzieren, mit bemerkenswert reduziert Arbeits-und akut erhöhte Effizienz für große Mengen von Bildern. 1A zeigt den Workflow SpheroidSizer. Die Kernrechenschritte umfassen automatisierte Initialisierung aktiven Konturalgorithmus und Kontur Quantifizierung. Nach der automatisierten Berechnung verwendet der Qualitätskontrolle Merkmal eine Kombination von "Hand initialisieren" und "Hand-Draw"-Werkzeugen, um jede unvollkommene Segmentierung zu retten. 1B zeigt die detaillierte automatisierte aktiven Konturalgorithmus. Der Initialisierungsschritt (0-ten Iteration) nutzt grundlegende Bildverarbeitungsschritte auf ungefähre Größe und Lage des Sphäroids zu erzeugen und erzeugen eine sphärische Kontur Initiierung mit einer geschätzten Größe. Die Einleitung Kontur-Feeds in den aktiven Konturalgorithmus. Im Gegenzug durchläuft sie nach den örtlichen Bildes anpassenSteigung und Krümmung Form. Der aktive Konturalgorithmus beendet ist, wenn die Kontur stabilisiert (konvergiert), dh 477 Iterationen für dieses Bild, oder wenn der vorgegebene maximale Anzahl von Iterationen ausgeführt wird. In diesem Beispiel wird die Initialisierung Kontur absichtlich vergrößert, um besser präsentieren den Algorithmus. In Wirklichkeit ist die Initialisierung der Regel sehr nahe an der tatsächlichen Grenze und viel weniger Iterationen für den Algorithmus erforderlich sind, um zu konvergieren. Anschließend nimmt der Algorithmus morphometrische Messungen der erfassten Grenze Sphäroid. Die Haupt-und Nebenachsen des Sphäroiden sind mit MATLAB Bildverarbeitungshilfsfunktionen (1C) gemessen. Die Hauptachse wird als Liniensegment, ein einzelnes Paar von den entferntesten Punkten der Kontur, die Länge (L) bezeichnet wird, definiert. Die Nebenachse ist als die längste Linie, die senkrecht zu der Hauptachse, die Breite (W) bezeichnet wird, definiert. In diesem Fall sind die Werte von L und W sehr nahe, da dieSphäroid kugelförmig ist. Das Volumen des Sphäroids als V = 0,5 * L * W 2 berechnet.

Eines der Merkmale der SpheroidSizer ist die automatische Erfassung der Grenze der Sphäroide auch auf Bilder mit unebenen oder verrauschten Hintergrund unter Verwendung des aktiven Konturalgorithmus (Fig. 2B-D). Computational Verarbeitung von Hellfeld-Bildern wird oft von unebenen Hintergrund, der adaptive Schwellen-basierte Methoden verleitet, um unerwünschte Ergebnisse produzieren Schwellen geplagt. Das Problem ist besonders deutlich, wenn Multi-Well-Platten verwendet werden, und die Wände der Wells kann Schatteneffekte auf die Bilder erstellen. , Da die aktive Konturalgorithmus ist nicht empfindlich auf die schrittweise Veränderung Schattierung im Hintergrund, ist jedoch in der Lage, Sphäroid Segmentierung in diesen hellen Feldbilder mit der richtigen Initialisierung zu identifizieren. Abbildung 2 zeigt einige Beispiele von Bildern mit unebenen oder laute Hintergrund, wie uneben Beleuchtungs (2B (Fig. 2C) oder nekrotischen Kern (Fig. 2D). Mit automatisierten aktiven Konturalgorithmus, SpheroidSizer umreißt diese Kügelchen genau in all diesen Bildern, wie in der roten Kontur an der unteren Platte jedes Bild dargestellt.

Die Qualitätskontrolle Merkmal SpheroidSizer ist der Schlüssel zu einem Hochdurchsatz-Workflow. Der "Leitfaden initialisieren" und "Hand-Draw"-Tools sind die wertvollen kostenlose Tools für diese Anwendung. Unter Hunderte oder Tausende von Bildern, ist es unvermeidbar, dass die automatisierte Algorithmus nicht in der Lage, um die Kügelchen in einigen Bildern korrekt zu erfassen. Wie in 3A, wenn unsachgemäße Erfassung der Sphäroid aufgrund der Initialisierung verursacht Schritt dargestellt, dh falsche Größe oder Position von der Einleitung Kontur im Bild (oben), funktioniert das "Handbuch Initialize"-Tool, indem der Benutzer richtig beschreiben die Lage und Größe des sphermanuell oid (unteres Bild). Es löst die aktive Kontur-Algorithmus, um mit manuell definierten Kontur initiieren und durchführen, um auf die gewünschte Kontur zu konvergieren. Für diesen schwierigen Bilder wie das Originalbild in Abbildung 3B ist der Sphäroid in einem störend und laut Hintergrund befindet. SpheroidSizer ist nicht in der Lage, die Sphäroid richtig zu identifizieren durch das automatisierte Verfahren (oben) oder von der "Hand Initialize"-Werkzeug mit der richtigen Initialisierung (Mitte). In diesem Fall kann der "Hand Draw"-Tool verwendet werden, um den Umriss der Sphäroid manuell zu zeichnen, wie in dem unteren Feld veranschaulicht werden. Das Programm verwendet die Benutzer-definierte Grenze, um die Haupt-und Nebenachsen des Sphäroids messen und berechnen die Lautstärke. Alle korrigierten Ergebnisse werden sofort in die "Ergebnistabelle" eingearbeitet und kann entsprechend exportiert werden.

Um die Leistung der SpheroidSizer in größeren Datenmengen zu bestimmen, haben wir zunächst Betriebszeit zu vergleichen, indemAnalysieren der gleiche Satz von 288 Bildern mit 1) manuelle Messungen mit Mikroskop Lieferanten gelieferten Software; 2) SpheroidSizer mit einem Single-Core normalen Laptop; und 3) SpheroidSizer mit einem Multi-Core-Rechenleistung parallel Workstation. Die manuellen Messungen über unser typisches Protokoll vor der Entwicklung der Software: die Länge und die Breite jedes Sphäroid werden von Hand gezeichnet und gemessen mit dem Verkäufer Programm (wie gesehen, die roten Linien in der oberen Platte der 4A); dann werden die Benutzer Kopien unten die Werte der Messungen. SpheroidSizer verarbeitet jedes Bild durch das Erzeugen der Sphäroid-Grenze (wie gezeigt, die rote Umrandung im unteren Teil von Abbildung 4A), die Messung der axialen Haupt-und Neben Länge und Export der Ergebnisse in Tabellenkalkulationen. Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, auf der Grundlage der Berechnung aus 288 Bildern, dauert es einen Durchschnitt von 31,67 sec einem Sphäroid pro Bild manuell zu messen; während es dauert nur SpheroidSizer weniger als 2 sec & # 160; wenn es auf einem Single-Core-normalen Laptop läuft; und weniger als 1 Sekunde, wenn sie auf einem 12-Core-Performance Workstation läuft. Daher ist die Bildanalyse über 18x schneller pro Bild mit SpheroidSizer als manuelle Messungen. Es reduziert den Arbeits, wenn mehr als Tausende von Bildern analysiert. Weiter vergleichen wir die Variabilität der Messungen der 24 in Fig. 4A gezeigt Sphäroide zwischen manueller Messungen und SpheroidSizer. Die 24 Sphäroiden werden dreimal mit beiden Verfahren gemessen; und die Standardabweichung der einzelnen Sphäroid berechnet. Wie in 4B, der Standardabweichung von SpheroidSizer (grüne Linie und Punkte) gesehen wird, ist nahe Null, außer für die drei Kügelchen, die an der Kontrolle der Qualität der Schritt, der noch zeigen kleinere Standardabweichung als die aus dem manuellen Messungen Verfahren korrigiert werden. Alle diese zeigen, dass SpheroidSizer führt die Bildanalyse effizienter und genauer.

e_content "> Wir führten eine Droge Bildschirm mit menschlichen BON-1 3D Tumorsphäroide um herauszufinden, welche in Kombination mit einem hsp90-Inhibitor-Verbindungen sind die möglichen Kandidaten für die Prüfung der Anti-Tumor-Wirkung in vivo. Menschen BON-1 3D Tumorsphäroide waren gewachsen auf Agarose-beschichtete 96-Well-Platten, wie im vorherigen Papier 15 beschrieben. Acht verschiedene Verbindungen mit sechs serielle Verdünnungen sowie Medien und Vehikel wurden für ihre Einzel-und Kombinationswirkungen, die mit 10 nM und 20 nM Hsp90-Inhibitor jeweils in Duplikaten untersucht. Zwei Sphäroide wurden Für jede Konzentration der einzelnen Verbindung oder die Verbindungen in Kombination verwendet. Vier 96-Well-Platten mit insgesamt 384 Sphäroide wurden verwendet. Alle Kügelchen wurden bei 0 abgebildet, 72, 144, 168 und 192 Stunden. Insgesamt 1.920 Bilder erzeugt wurden aus diesem Experiment. SpheroidSizer Es dauerte nur 30 Minuten, um die computergestützte Analyse der 1.920 Bilder mit einer zusätzlichen 50 min für die Qualitätskontrolle und Datenexport zu vervollständigen. SpheroidSizer beschleunigt die Bildanalyseprozess enorm. 5A zeigt einen Screenshot der Ordner-und Dateinamen Arrangements für dieses Experiment als Beispiel für Protokoll Schritt 3.3. 5B-E zeigt die Screenshots der Bildanalyse-Pop-up-Fenster und Ergebnisse . Verwendung SpheroidSizer als Illustrationen für das Protokoll die Schritte 4, 5 und 7 Da die Volumina der 3D-Sphäroiden aus der formatierten Ergebnistabelle aus SpheroidSizer exportiert haben wir Graphen - Wachstum von 3D Tumorsphäroide auf Verbindung Behandlungen gegenüber der Zeit von Behandlungen. Zwei repräsentative Graphen aus diesem Experiment sind in Fig. 5F und 5G gezeigt. 5F zeigt, dass die kombinierten Behandlungen von Hsp90-Inhibitor und Cladribin (grüne Linie) hemmen das Wachstum von 3D-Sphäroide mehr als die einzige Behandlung von HSP90-Inhibitor (lila Linie) oder Cladribin (orange Linie), was darauf hindeutet, dass die kombinierten Behandlungen von Hsp90-Inhibitor und Cladribin kann Anti-Tumor-ef habenDefekte in vivo. 5G zeigt, dass die kombinierte Behandlungen von Hsp90-Inhibitor und Adriamycin (grüne Linie) nicht hemmt das Wachstum von 3D-Sphäroide mehr als die Einzelbehandlung von Adriamycin (orange Linie) oder Hsp90-Inhibitor (lila Linie), was darauf hindeutet, dass die kombinierten Behandlungen von HSP90-Inhibitor und Adriamycin haben nicht anti-Tumor-Wirkung in vivo. Dieses Experiment hat uns geholfen, wählen Sie besser die Verbindungen, um ihre Anti-Tumor-Wirkung in vivo zu testen und SpheroidSizer ist der Schlüssel für die schnelle experimentelle Datenanalyse.

Tabelle 1
Tabelle 1 Vergleich der Betriebszeit. Auf Bildanalyse zwischen manueller Messungen und SpheroidSizer bei der Analyse der gleichen Menge von 288 Bildern. Bitte clecken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

Figur 1
Abbildung 1 SpheroidSizer -... Ein Open-Source-Software-Anwendung zur Messung der Größe der Sphäroid A) Der Kern-Workflow der Anwendung B) Illustration des aktiven Konturalgorithmus in verschiedenen Stadien der Iteration. Bitte beachten Sie, dass die Initialisierung Kontur (Iteration 0) absichtlich, um den Algorithmus. C) Die Haupt-und Nebenachsenlängenmessungen und Berechnung des Volumens von SpheroidSizer präsentieren vergrößert. L - Hauptachse: das Liniensegment ein einziges Paar am weitesten Punkte auf der Kontur (bezogen auf die Länge); W - Nebenachse: die längste Linie, die senkrecht zu der Hauptachse (bezogen auf die Breite).

class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figur 2
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus dem automatisierten Segmentierung SpheroidSizer, zeigt Robustheit gegen verschiedene Bildbedingungen. A) Typische Bilder von guter Qualität. B) Bilder mit unterschiedlicher Helligkeit und Kontrast. C) Bilder mit störenden Ablagerungen. D) Bilder von Sphäroiden mit nekrotischen Kern . Bilder an der Oberseite von jeder Figur sind die Quelle / Original-Bilder; Bilder an der unteren Platte jeder Figur sind die Kontrolle der Qualität der Bilder; und die rote Umrandung ist der Sphäroid-Segmentierung durch automatisierte Berechnung erstellt.

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Abbildung 3. Illustration des "Manual initialisieren" und "Hand-Zeichnen"-Tools. A) Der "Leitfaden Initialize"-Tool erlaubt das Zeichnen eines Passellipsenform über die Sphäroid für die Initialisierung, wenn ungenau Sphäroid Segmentierung nach der automatischen Initialisierung auftritt. B ) Die "Hand Draw"-Tool ermöglicht eine präzise Handzeichnung des Sphäroiden Grenze, als ungenau Sphäroid Segmentierungen erfolgen sowohl mit automatisierten und manuellen Initialisierung. Die blaue Linie auf der Sphäroid zeigt die Initialisierung Kontur; die rote Umrandung ist die identifizierten Sphäroid-Grenze. Bitte beachten Sie, dass das Sphäroid in "Manuell Initialisieren" in A) und dem Sphäroid in "Hand Draw" in B) ist absichtlich vergrößert, um besser präsentieren die Werkzeuge.

Fig. 4 4. Vergleich der Bildanalyse der Leistung zwischen SpheroidSizer und manuellen Messungen bei der Analyse der gleichen Menge von 24 Bildern. A) Repräsentative Sphäroiden zu zeigen, wie die Länge und Breite von Sphäroiden durch manuelle Messungen und SpheroidSizer bestimmt. Top 24 Bilder enthalten von Hand gezeichnet Länge / Breite jedes Sphäroid in roten Linien mit manuellen Messungen; unteren 24 Bilder (die gleichen 24 Bilder) enthalten Computer gezeichnet Sphäroid Grenze in roten Umriss mit SpheroidSizer. B) Standardabweichung der Länge oder Breite von drei Messungen an jedem einzelnen Sphäroid.

Figur 5
5. Ein repräsentatives Beispiel für die Verwendung SpheroidSizer in Droge Bildschirm - Bildanalyse auf die Bilder der Kügelchen ", die von einer Droge Bildschirm mit BON-1 3D Tumorsphäroide A) Ein Screenshot der Ordner-und Dateinamen Arrangements für dieses Projekt B) Ein Screenshot der erweiterten gesammelt wurden.. Konfigurationen Fenster in SpheroidSizer. C) Ein Screenshot von SpheroidSizer1.0 Fenster mit Ergebnistabelle angezeigt. D) Ein Screenshot von dem Format der Ausgabedatei von SpheroidSizer. E) exportiert Ein Screenshot der Liste Ausgabedatei SpheroidSizer. F exportiert) Wachstum von 3D-Tumorsphäroide auf die Behandlungen mit Hsp90-Inhibitor und Cladribin. G) Wachstum von 3D-Tumorsphäroide auf die Behandlungen mit Hsp90-Inhibitor und Adriamycin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. </ P>

Discussion

Diese Studie stellt eine schnelle, flexible, effektive und automatisiertes Programm - SpheroidSizer für die genaue Bestimmung der Größe von 3D Tumorsphäroide. SpheroidSizer ist einfach zu bedienen und erfordert nur minimale Benutzereingaben. Die wichtigsten Schritte für eine genaue, reibungslosen und erfolgreichen Ablauf des SpheroidSizer sind: dass die Kügelchen sind in der Mitte des Feldes abgebildet, ohne den Rand des Brunnens; alle Dateien zusammen als ein Projekt analysiert werden sollte unter dem gleichen Mikroskop mit dem gleichen Ziel abgebildet werden; Alle Dateien, die analysiert werden sollen, richtig benannt und angeordnet, wie in dem Protokoll angegeben ist; und korrekte benutzerdefinierten Einstellungen sind vor der Berechnung eingegeben.

Die Vorteile umfassen die Fähigkeit SpheroidSizer allmähliche Änderung in der Hintergrundbild vertragen sowie glatte Konturen, die den allgemeinen sphärische Form der Kügelchen unter Verwendung der aktiven Konturalgorithmus entsprechen, zu erzeugen. Performance der aktivenschlechte Initialisierung oder das Vorhandensein von anderen lokalen Kanten abzulenken von der Soll-Kontur: Kontur kann in zwei Situationen beeinträchtigt werden. Insbesondere in unserer getestet Fällen ist die zweite Situation manchmal passieren, wenn der nekrotischen Kern eines großen Sphäroid zieht die aktiven Kontur was zu kleineren Kontur gemeldet. Es ist erwähnenswert, dass andere automatisierte Schwellen-basierte Methoden auch in dieser Situation leiden, wenn die Schwelle ist speziell von Hand eingestellt. Die Software stellt daher freuen Bemühen zu helfen, zu erkennen und zu beheben Nutzer kompromittiert Segmentierung durch einfache Kontrolle der Qualität der Funktionen. Wenn Fehler passiert Segmentierung aus armen Initialisierung Anwendungen verwenden können "Manual initialisieren" Werkzeug, um die automatisierte Initialisierung überschreiben. Wenn die Bildqualität zu schlecht ist für die aktive Kontur kann der Anwender einfach "Hand Zeichnen" die Kontur, die in Quantifizierung Feeds. Bestehende Software wie CellProfiler können für diese Anwendung in einer halbautomatischen fashio angepasst werdenn. Der Arbeitsablauf kann mühsam sein, wenn große Mengen von Bildern mit unterschiedlichen Bilderzeugungsbedingungen werden dargestellt, oder wenn eine Teilmenge der Bilder braucht mehr menschlichen Eingriff vollständig zu messen. SpheroidSizer bietet ein All-in-One-Suite für die Berechnung und Qualitätskontrolle zu Hochdurchsatz-Bildanalyse-Workflow zu verwalten.

SpheroidSizer ist derzeit zur Erfassung eines Sphäroids pro Bild beschränkt und misst nur die axiale Länge des Sphäroids. Das Programm kann erweitert werden, weiter zu unterstützen Quantifizierung von Forschern wie Quantifizierung von Sphäroiden mit nekrotischen Kern benötigt wird, Erkennung von mehreren Kügelchen in einem Bild oder der Überwachung der Form der Sphäroide. Außerdem kann das Programm so modifiziert werden, erkennen und die Größe der entfernten Tumoren von Tier oder Mensch, die sicherlich von Vorteil für Forscher sein wird, wenn die Durchführung in vivo präklinischen oder klinischen Forschung zu messen. Nachbearbeitung der erfassten Sphäroiden kann auch Ziel untersucht werdenten zur Verringerung menschlicher Anstrengung für die Qualitätskontrolle erforderlich ist und weitere Verbesserung des Durchsatzes. SpheroidSizer ist ein verallgemeinertes Bildanalyseanwendung für 3D Tumorsphäroide, die von allen Zelltypen erzeugt werden, und kann daher von einer breiten Krebsforschungsgemeinschaft verwendet werden.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir möchten die Raymond und Beverly Sackler-Stiftung für ihre Unterstützung unserer Forschung danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axiovert 200M inverted microscope Carl Zeiss Microscopy, LLC microscope for imaging
Vostro 1720 Dell Inc. single-core regular laptop
HP Z820 HP Inc. multi-core performance workstation
MATLAB and Simulink R2013a Mathworks, Inc, Natick, MA MATLAB software

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