루시 페라 제 활동을 통해 수용체 활성화의 측정 : 포유류의 후각 수용체의 높은 처리량 분석

Neuroscience

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Summary

후각 수용체 활성화 패턴 악취 ID를 인코딩하지만, 포유 동물의 후각 수용체 리간드 취제를 식별 발행 데이터의 부족은 악취 코딩의 광범위한 정보 모델의 개발을 방해한다. 이 프로토콜은 후각 수용체 리간드 및 수용체 활성화의 정량 높은 처리량의 식별을 용이하게하는 방법을 설명한다.

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Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity. J. Vis. Exp. (88), e51640, doi:10.3791/51640 (2014).

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Abstract

취기 약 1,000 쥐 400 인간의 수용체의 가족이 냄새 물질의 수천을 인식 할 수 있도록, 후각 수용체 활성화의 독특하고 중복 패턴을 만들 수 있습니다. 악취 물질 리간드는 인간의 수용체 1-11 미만 6 %에 발표되었다. 데이터의 부족은 일부 기능 이종 시스템에서이 수용체를 발현하는 어려움 때문이다. 여기서, 우리는 루시퍼 라제 리포터 분석을 이용하여 후각 수용체 활성화의 높은 처리량 평가 하였다 Hana3A 세포 후각 수용체 패밀리의 대부분을 표현하기위한 방법을 설명한다. 이 분석은 후각 수용체의 패널에 대하여 취기 (1)의 화면 패널에 사용될 수있다; (2) 용량 반응 곡선을 통해 취제 / 수용체 상호 작용을 확인; (3) 수용체 변이체 구비 수용체 활성화 수준을 비교한다. 우리의 샘플 데이터에서 328 후각 수용체 (26)의 냄새 물질에 상영되었다. 다양한 응답 점수 후각 / 수용체 쌍 SELEC했다테드 및 용량 반응 시험. 이 데이터는 화면이, 악취 물질에 대한 선의의 진실 반응이, 즉 수용체를 용량 반응 실험을 통과 할 후각 / 수용체 쌍에 대해 풍부하게 할 수있는 효과적인 방법임을 나타냅니다. 따라서, 이러한 높은 처리량 루시페라아제 분석법은 포유 동물의 후각 시스템 악취 코딩 모델 향해 후각 수용체-필수적인 단계를 특성화하는 효과적인 방법이다.

Introduction

포유 동물의 후각 시스템은 탐지 및 취기 수천 차별을 허용 악취 자극의 광대 한 수에 응답 할 수있는 능력을 갖는다. 후각 (논리합)는 후각 상피 (12)에서 후각 감각 뉴런에 의해 표현 분자 센서이다. 포유 동물의 냄새를 인식 취기에 의한 관찰 보고서의 차등 활성화를 통해 발생하고 또는 유전자 가족은 대략 1,000 쥐 400 인간의 수용체 12-16으로 광범위하다. 후각 신경 세포 및 이종 세포에서 관찰 보고서의 이전 기능 분석은 다른 냄새 물질은 고유 한 인식하는 것으로 나타났습니다하지만, 관찰 보고서 10,17-20의 앙상블을 겹쳐있다. 관찰 보고서에 리간드를 매칭 후각 코드와 후각의 실행 가능한 모델을 구축하기위한 핵심을 이해하는 것이 중요합니다. 인해 취기 및 논리합 모두의 다수뿐만 아니라 이종 시스템에서 논리합을 표현하는 어려움이 데이터는 F에서 큰폭 결석왔다ield; 참으로, 인간의 관찰 보고서 미만 6 % 게시 된 리간드 1-11있다. 이 프로토콜은 취제 / OR 상호 작용을 특성화하는 루시페라아제 분석의 사용을 설명한다. 이 분석은 논리합의 높은 처리량 특성화 취제 / OR 상호 작용을 이해뿐만 아니라 악취 코딩 모델을 개발에 필수적인 작업을 가능하게한다.

관찰 보고서의 높은 처리량 연구는 세 가지 주요 과제에 직면하고 있습니다. 첫째, 이종 세포에서 발현 관찰 보고서는 ER에 유지하고, 이후 분석 시스템 23-25에서 냄새 물질과 상호 작용에서 관찰 보고서 방지, 프로 테아 솜 (21, 22)에서 분해. 이 문제는 논리합 19,26,27 광범위한 안정된 세포 표면 발현을 촉진 소품 단백질의 발견에 의해 해결되었다. 수용체 - 수송 - 단백질 1과 2 (RTP1 2) 쇼핑 후각 자극 (19)에 대한 응답으로 세포 표면 발현 및 활성화. 본 작업에 기초하여, HEK293T 세포되었습니다안정적으로 Hana3A 세포주 19,27 결과 RTP1 긴 (RTP1L) 및 RTP2, 수용체 발현을 향상시키는 단백질 1, 및 G의 αolf을 표현하기 위해 수정. 또, 분류 3 무스 카린 성 아세틸 콜린 수용체 (M3-R)는 세포 표면에서 관찰 보고서와 상호 작용 및 취기 제 (26)에 응답하여 활성화를 향상시킨다. 세포 표면 27에서 관찰 보고서의 넓은 범위의 강력한 일관성 및 기능 식 Hana3A 세포 결과에 RTP1S와 M3-R와 OR의 공동 형질. 둘째, 포유 동물 또는 레퍼토리는 매우 크다. 인간에서는, 예를 들면, OR 레퍼토리는 미각 수용체 레퍼토리보다 다양한 크기의 순서이며, 시각 수용체 레퍼토리보다 다양한 크기의이 순서. 하나의 복제 또는 것은 비교적 간단한 프로토콜이지만, 중요한 선행 노력이 포괄적 인 라이브러리를 생성하기 위해 필요합니다. 우리는 비전을 알고 있지만, 셋째, 파장은 색상으로 변환하고오디션 주파수 피치로 변환에, 냄새의 조직은 가난 어려운 연구자의 냄새 물질의 대표 샘플에서 보간하기 위해 만드는 이해된다. 일부 진전이 전면 10,28에 만들어진 있지만, 후각 풍경의지도가 불완전 남아있다. 관찰 보고서의 수백에 수십 분자의 수천을 상영하는 것은 어려운 작업입니다; 이 도메인의 높은 처리량 화면을주의 깊게 정의 캠페인을 필요로한다. 주요 남은 문제는 오히려 기술에 내재 된 문제보다 물류 비용의 사람입니다. 이종 스크리닝 폭넓게 학술기로 리간드를 식별하는 데 사용되지 않았지만, 개인 회사 100 인간 논리합 29 대한 리간드를 식별하는 동일한 기술을 사용하고있다. 불행하게도, 이러한 데이터 독점 남아있다.

여기에 설명 높은 처리량 루시 페라 제 분석은 평가 또는 활성화하는 데 사용되는 다른 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 비록 respon기본 후각 감각 뉴런의 SES는 전기 생리학과 칼슘 이미징을 사용하여 측정 된이 기술은 어려움으로 인해 후각 신경 세포에 대한 응답 특성의 중첩에 신경 세포의 반응에 이르게 또는 떨어져 괴롭 히고있다. , GFP - 라벨 수용체 타입 (30, 31)에서 노킹 (32, 33) 후각 신경 세포를 생쥐에 아데노 바이러스를 통해 특정 수용체를 제공, 또는 17,24,33 단일 수용체의 종류에 녹음을 링크 할 수 있습니다 녹음 한 후 RT-PCR을 수행,이 방법은 있지만 낮은 처리량과 대형 화면에 적합하지 않습니다. 이종 검사 시스템은 확장 성, 그리고 두 가지 주요 형태는 문헌에서 찾을 수 있습니다 : 캠프 통로 기자 이노시톨 인산염 (IP3) 통로 기자. 냄새 자극에, 관찰 보고서는 고리 AMP (캠프) 12의 생산 결과 G의 αolf 전달 신호 폭포를 활성화합니다. AC의 제어 하에서 반딧불 루시퍼 라제 리포터 유전자를 공동 형질 작성자AMP 반응 요소 (CRE), 루시퍼 라제 생산 부량 OR 활성화를 허용 악취 응답의 함수로서 측정 될 수있다. 또는 활성화 또한 G α15/16 또는 G의 α15-OLF 키메라 24,25,34 등의 G-단백질을 공동으로 표현하여 IP3 경로에 연결할 수 있습니다. 우리는 세 가지 요인에 따라 여기에 제시된 분석을 선택했습니다 : RHO-태그 후각 수용체와 RTP1 (1) 공동 발현 세포 표면 19,27의 후각 수용체의 발현을 향상을; (2) 캠프 응답 리포터 유전자의 사용은 측정 또는 정규 두 번째 메신저 경로를 통해 활성화 할 수 있습니다; (3) 분석은 높은 처리량 스크린에 매우 적합하다.

이것은 높은 처리량 루시퍼 라제 분석은 후각의 분야에 유용한 다양한 연구에 적용 할 수있다. 우선, 관찰 보고서의 다수의 SP에 대한 수용체 활성화 패턴을 결정하기 위해 단일 ​​취제에 대해 스크리닝 할 수있다ecific 악취 물질. 이런 종류의 연구는 스테로이드 악취 물질 androstenone 8에 응답 또는 책임으로 OR7D4을 확인했다. 반대로, 하나의 OR은 수용체 응답 프로파일 (10)을 결정하기 위해 방향제의 패널에 대해 스크리닝 할 수있다. 후보 후각의 취제 / OR 쌍이 이러한 화면을 통해 확인 될 때​​, 상호 작용의 증가 취제 농도 OR의 응답을 검사하는 투여 량 반응 실험을 수행함으로써 확인 될 수있다. 용량 반응 곡선은 OR에있는 유전 변이가 체외 후각 응답 8,9,11,35에 미치는 영향을 평가할 수 있으며, 이러한 연구는 진화의 종류 및 원인 돌연변이를 통해 수용체 진화의 시험을 허용, 종간 또는 변화에 확장 될 수있다 36, 37는, 마지막으로,이 분석은 길항 할 수 또는 알려진 후각 / 수용체 쌍 (38, 39)에 대한 특정 악취 물질에 대한 응답이다 냄새 길항제에 대한 화면으로 사용할 수 있습니다. 요약하면, 이러한 높은처리량 루시페라아제 분석법 특성화 OR 활성화 패턴 및 후각 시스템에서 악취 코딩의 더 나은 이해를 제공 할 것이다 연구의 범위에 적용 가능하다.

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Protocol

Hana3A 세포의 1. 문화

  1. 10 % (v / v) FBS가 최소 필수 배지 (MEM)를 보완하여 M10 미디어를 준비합니다.
  2. 문화 유지
    1. M10 미디어의 세포를 유지한다. 참고 : RTP1L, RTP2, REEP1, 및 G의 발현 벡터는 Hana3A 세포에 퓨로 마이신 내성을 부여 αolf하지만,이 항생제와 세포를 유지하는 것이 상당히 분석 결과에 영향을주지 않습니다.
    2. 1시 8분 10 CM 요리 2-3 일마다의 비율로 서브 컬쳐.
    3. 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다.

형질 2. 도금 세포

  1. Hana3A 세포의 100 % 합류 10cm 접시에서 대기음 매체.
  2. 10 ㎖의 PBS를 추가 접시를 소용돌이, 그리고 PBS를 흡입하여 세포를 씻으십시오.
  3. 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 3 ㎖를 추가하고 세포가 (약 1 분) 해리까지 기다립니다.
  4. 5 ㎖ M10를 추가하여 트립신을 비활성화하고 약 10 배 &를 triturating에 의해 세포 대단히 짧은 시간을 휴식# 160; 10 ㎖ 피펫. 피펫은 조심스럽게 미디어에 공기 방울을 도입 방지 할 수 있습니다.
  5. 각 96 - 웰 플레이트, 15 ML 원뿔 관, 5 분 200 XG에 원심 분리기로 전송 세포의 1 ㎖를, 그리고 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음하십시오.
  6. 단계 2.5에서 전송 세포의 1 ㎖ 당 6 ㎖의 M10의 세포를 Resuspend.
  7. 피펫 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 세포의 50 μL와 5 % CO 2와 37 ° C에서 밤새 품어.

후각 수용체의 3. 형질

  1. 플라스미드 DNA의 준비
    1. 독소가없는 프로토콜을 통해 플라스미드 DNA를 준비합니다. 참고 : 사용 플라스미드 DNA 준비 키트 지정 "독소가없는"또는 플라스미드 DNA 준비 프로토콜 페놀 - 클로로포름 추출 단계를 추가합니다.
    2. TE 버퍼에 100 NG / μL의 농도로 DNA를 희석.
  2. 근사치의 적절한 자랄 수 있도록 도금 셀 (단계 2.7) 관찰tely 30 ~ 50도 당 % 및 인큐베이터로 돌아갑니다. 참고 :이 포화 상태가 지질 형질 전환 시약 최적은 아니지만,이 단계에서 30 % ~ 50 %의 포화 상태가 형질 전환 후 루시 페라 제 활동 24 시간을 측정하기에 최적입니다.
  3. 형질 믹스의 제조
    1. 플라스미드 혼합하기 위해 표 1에 설명 된 볼륨 당 MEM 매체에 피펫 RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE - 루크, 그리고 pSV40-RL 플라스미드 (표시된 볼륨은 96 - 웰 플레이트 일 기준). RTP1S-PCI
      플라스미드 믹스
      물론 당 96 - 웰 플레이트 당
      MEM - 500 μL
      5 NG 480 NG
      M3-R-PCI 2.5 NG 240 NG
      PCRE 뤽 10 NG 960 NG
      pSV40-RL 5 NG 480 NG

      표 1. 플라스미드 믹스의 구성 요소. 당 잘 RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE - 루크, 그리고 pSV40-RL 및 MEM의 96 - 웰 플레이트 볼륨 당.
    2. 각각의 96 - 웰 플레이트, 450 μL의 MEM 배지에서 18 μL의 지질 형질 감염 시약을 희석.
    3. 피펫 플라스미드 믹스 (단계 3.3.1에서), PCI 플라스미드 (RHO-OR-PCI)에있는 로돕신 - 태그 후각 수용체와의 복잡한 상세한 수 있도록 (단계 3.3.2에서) 지질 형질 믹스 표 2에 따라 M10를 추가하여 반응을 중지 참고 :.이 반응 시간에 민감한하고 30 분 동안 계속 허용 할 수 없습니다. 잘 + 10 % 계산은 후속 단계에 충분한 양을 확보하는 것이 중요하다. 지질 형질 믹스
      복잡한
      물론 당 잘 + 10 % 당
      플라스미드 믹스 4.2 ㎕의 4.58 μL
      RHO-OR-PCI 0.05 NG 0.06 NG
      4.2 ㎕의 4.58 μL
      M10 41.7 μL 45.83 μL

      표 2. 복잡한 구성 요소. 당 잘 플라스미드 믹스 (표 1)도 + 10 % 볼륨 당, 후각 수용체 플라스미드 (RHO-OR-PCI) 및 지질 형질 혼합. M10을 실온에서 15 분간 인큐베이션 다음 가하여 반응을 급냉된다.
  1. 셀 플레이트에서 미디어를 누르십시오.
  2. 피펫 50 개 각 단지의 μL와 5 % CO 2와 37 ° C에서 밤새 품어.

4. 냄새 자극

  1. 물론 당 50~80%의 적절한 자랄을 보장하고 인큐베이터로 돌아 형질 전환 세포를 관찰합니다. 참고 : 세포는 50 미만 경우% 합류, 반딧불 루시 페라 제와 레 닐라 루시퍼 라 아제 수치는 수용체 활성화의 측정에 너무 낮을 수 있습니다. 플레이트를 폐기하는 것이 좋습니다.
  2. DMSO의 각 냄새의 1 M 주식 솔루션을 준비합니다.
  3. CD293 매체의 냄새 자극 솔루션을 준비합니다.
    1. 심사 실험을 위해, 100 μM로 냄새의 원액을 희석. 또한 (만 CD293) 또는 배경의 활성화를 위해 제어하기 위해 노 악취 제어를 준비합니다. 주 : 검사 실험의 경우, 각 OR / 냄새 쌍은 실험에 한 번 테스트됩니다. 우물에서 약간의 냄새 확산이 가능하기 때문에, 각 플레이트에 대해 하나의 악취 물질과 자극하는 것이 좋습니다.
    2. 용량 반응 실험을 위해, 세중의 각 수용체에 1 ㎜부터 시작하여 냄새 원액의 7-10 배 희석으로 준비하고 있습니다. 또한 냄새 배경 활성화를 위해 제어하기 위해 빈 벡터 형질 세포에 대한 세중 같은 악취 희석을 준비합니다. NOTE : 용량 반응 실험을 위해, 각각의 ODOR 농도 처리 중으로 실시해야한다.
  4. 셀 플레이트에서 미디어를 누르십시오.
  5. 피펫 (25)도 각각 냄새 자극 솔루션의 μL하고 4 시간 동안 배양한다.

루시 페라 제 분석을 통해 5. 측정 또는 활동

  1. -80 ° C에서 제조업체의 지침과 상점 당을 Resuspend 반딧불 루시 페라 제 기판
  2. 96 - 웰 플레이트 당 반딧불 루시퍼 기판의 1 ml에 녹여.
  3. 끄는 신선한 반딧불 루시 페라 제 반응을 준비하고 레 닐라 루시퍼 기판 시약 (버퍼 1 ㎖ 당 5 μL 루시퍼가 끄는 / 레 닐라 루시퍼 기판). 참고 : 시약의 약 1 ㎖를 96 - 웰 플레이트 당 필요합니다.
  4. 발광 마이크로 플레이트 리더를 준비합니다. 마이크로 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니 다. 시스템 아이콘 내 :
    1. "예열"탭에서 "ON"에 대한 확인란을 선택하고 25 °에 기계의 온도를 설정; C.
    2. "분배기"탭에서, 70 % 에탄올 1,000 μL 프라임 각각의 디스펜서 증류수 1,000 μL 하였다. 참고 : 각 디스펜서 알코올과 물을 분리 분취를 사용합니다. 에탄올은 디스펜서를 살균하는 데 사용하고, 물을 잔류 에탄올을 제거한다.
    3. 프라임 공기의 1,500 μL 각 디스펜서 (액체에서 디스펜서를 제거). 참고 : 공기로 프라이밍은 루시 페라 제 기판을 잔류 물에 희석되지 않도록합니다.
    4. (단계 5.2) 반딧불 루시 페라 제 기판의 1,080 μL 프라임 디스펜서 1. (단계 5.3에서) 레 닐라 루시퍼 기판 프라임 디스펜서 2. 참고 : 교차 오염 루시 페라 제의 기판에주의하십시오. 루시 페라 제 기판과 프라이밍 시약 디스펜서의 죽은 공간을 채 웁니다.
  5. 모두 개똥 벌레와 레 닐라 루시퍼 라제 발광을 읽을 수있는 다음과 같은 프로토콜을 설정합니다. 마이크로 플레이트 리더, UN과 관련된 소프트웨어 내"파일"메뉴를 데르, "새 작업"을 클릭합니다. "프로토콜"을 선택하고 "새로 만들기"를 클릭합니다. 다음 창에서, 다음 "표준 프로토콜"에 원을 선택해야합니다. "OK"를 클릭하십시오. 화면의 왼쪽에 "절차"를 두 번 클릭합니다.
    1. 디스펜서를 사용하여 모든 우물에 반딧불 루시 페라 제 기판의 10 μl를 분배합니다. "작업"메뉴에서 "분배"를 클릭합니다. "분배 단계"창에서 설정 : 없음, 10 μL에 "분배 량"225 μL / 초 "속도"에 "마중물" "분배기"1. "OK"를 클릭합니다.
    2. 30 초 동안 판을 흔들어. "작업"메뉴에서 "떨림"을 클릭합니다. SS : "흔들어 단계"창에서, 중간 및 0시 반 MM에 "시간"을 "강도"로 설정합니다. "OK"를 클릭합니다.
    3. 물론 당 0.5 초에 대한 모든 우물의 발광을 읽어보십시오. "작업"메뉴에서 "보기"를 클릭합니다;. "읽기 단계"창에서 설정 : 발광에 "검출 방법", 0시 0분 50초 MM에, 엔드 포인트에 "통합 시간"을 "유형을 읽기": SS : 초, "필터 세트"1, "방출" 홀에, Top 호텔 "광학의 위치", 135 "이득"및 1.00 mm로 "높이 읽기". "OK"를 클릭합니다.
    4. 디스펜서 2를 사용하는 모든 우물에 레 닐라 루시퍼 기판의 10 μl를 분배합니다. 세트 "분배기"2를 제외하고, 단계 5.6.1에서와 같이 조건을 설정합니다.
    5. 30 초 동안 판을 흔들어. 5.6.2 단계에있는 등의 조건을 설정합니다.
    6. 0.5 초에 대한 모든 우물의 발광을 읽고 잘 당. 5.6.3 단계에있는 등의 조건을 설정합니다.
  6. 96 - 웰 플레이트에서 뚜껑을 제거하고 마이크로 플레이트 리더에 접시를 놓습니다. 플레이트 발광을 읽는 단계 5.5에서 설정 프로그램을 시작합니다.
  7. 시약 디스펜서 펌프를 청소합니다. "분배기"탭에서 시스템 아이콘에서 :
    1. F 1000 μl를 제거복구 튜브에 반딧불 루시 페라 디스펜서에서 irefly 루시 페라 제의 기판. 참고 : 반딧불 루시 페라 제는 -80 ° C에서 저장 및 재사용 할 수 있습니다.
    2. 프라임은 70 % 에탄올 1,000 μL에 증류수 1,000 μL,, 그리고 마지막으로 공기의 1,500 μL 각 디스펜서 (액체에서 디스펜서를 제거). 참고 : 물이 시약 펌프, 에탄올 소독, 공기가 잔류 에탄올 건조에서 루시 페라 제의 기판을 제거합니다.

6. 데이터 분석

  1. 데이터 내보내기
    1. 마이크로 플레이트 리더 소프트웨어, 화면의 왼쪽에있는 "보고서 / 내보내기 건축"을 두 번 클릭합니다.
    2. 버튼 "Excel로 새로운 수출"을 클릭하고 "확인"을 클릭합니다.
    3. EXPORT1을 선택하고 "편집"을 클릭합니다.
      1. "콘텐츠"의 "시스템 설명"확인 "절차", "플레이트 설명"및 "플레이트 레이아웃 매트릭스"에서. "원시 데이터"를 포함ND "데이터를 계산".
      2. "워크 플로"에서 "절차의 완료시 자동 실행"을 확인합니다. 수출 모드에서, "모두 같은 통합 문서에있는 판"과 "새 워크 시트로"를 확인합니다.
      3. "파일"파일 이름 형식 및 파일 위치를 선택하고 "확인"을 클릭에서.
      4. "보고서 / 내보내기 빌더"창을 닫습니다.
  2. 정규화 루시 페라 제 값을 얻으려면, 각 웰의 레 닐라 발광 읽기 (단계 5.6.6)에 의해 각 웰의 반딧불 루시 페라 제 발광 읽기 (단계 5.6.3)를 나눕니다.

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Representative Results

기본 화면이 100 μM의 농도에서 26 냄새에 328 관찰 보고서를 테스트했다. 이 냄새의 농도를 효과적으로 알려진 리간드 (10)와 관찰 보고서의 큰 비율을 활성화하기 위해 입증되었습니다. 먼저 정규화 루시퍼 라제 활성은 레 닐라 루시퍼 라제 판독함으로써 반딧불 루시페라아제 판독 나누어 계산 하였다. 다음으로,베이스 라인 값은 각 웰 (그림 1)에 대한 표준화 된 루시 페라 제 수치의 냄새 컨트롤의 정규화 루시 페라 제 수치를 차감하여 계산 하였다. 용량 반응 곡선은 48 악취 물질에 대해 수행 / 또는 쌍을 무작위로베이스 라인 값의 범위에 걸쳐 분포하고, 그림 1의 색 막대로 표시된. 관찰 보고서가 1 ㎜에 1 nm의에 걸쳐 악취 물질의 7 농도로 처리하고, 결과 응답이 맞는지했다 비선형 회귀를 이용하여 S 자형 곡선. 이 세 가지 기준을 충족하는 경우 악취 물질 / OR은 작용제 간주되었다 : (1) 표준 오차의logEC (50)가 1보다 작 로그 단위이었다; (2) 곡선의 상하 파라미터에 대한 95 % 신뢰 구간이 중복되지 않았다; 및 (3)의 여분의 합 - 제곱 시험 취제는 빈 벡터로 형질 전환 된 대조군 세포보다 상당히 더 OR - 함유 세포를 활성화 된 것을 확인했다. 투여 량 반응 결과를 표 3에 요약되어있다.

이러한 데이터는 기본 화면에서 분석 측정 투여 량 반응 곡선의 결과를 예측하는 방법을 잘 결정하는 데 사용 하였다. 그림 1의 파란색 막대는 빨간색 막대는 위에서 설명한 우리의 세 가지 기준을 ​​충족하지 않았지만, 전체 용량 반응 실험에서 효능으로 분류 된 쌍에 해당합니다. 기본 화면의 값은 우리의 주 화면이 유용한 방법임을 나타내는 (특성 곡선 (AUC)을 운영 수신기에서 영역 = 0.68, P <0.01, 맨 - 휘트니 U 시험)의 전체 용량 반응 실험의 결과를 예측 전체 용량 반응 실험 (그림 2)에 작용 물질로 분류됩니다 방향제 / OR 쌍에 ​​풍부하게.

그림 1
후각 수용체 및 냄새 물질의 기본 화면에있는 각 악취 물질 / OR 쌍에 ​​대해 계산 된베이스 라인 루시퍼 값의 주파수. 히스토그램 (카운트)의 패널과 화면에 대한베이스 라인 루시 페라 제 값 그림 1. 주파수. 취제 / 수용체 활성화 쌍 드문 드문 같이, 값의 대부분은 제로에 중심 및 대형 중앙 분포는이 분석에 대한 잡음 분산을 추정한다. 컬러 바는 투여 량 반응 분석을 위해 선택 취제 / 수용체 쌍을 나타낸다; 파란색 막대는 전체 용량 반응에 따라 작용 물질로 분류하고, 빨간색 막대가 작용 물질로 분류되지 않은 쌍입니다 한 쌍입니다.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51640/51640fig1highres.jpg"대상 = "_blank"> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
악취 물질 / 수용체 화면 그림 2. ROC 곡선. 48 후각 / 수용체 쌍 작용제 인 또는 작용제하지 않은 것으로 분류되었다. 참 긍정적 인 속도 (감도) 다음 R 통계 패키지 (40)를 사용하여 위양성률 (1 - 특이도)에 대해 도시 하였다. 곡선 (AUC)에서이 지역은 높은 루시 페라 화면 값 후각 / 수용체 쌍 낮은 값보다 용량 반응을 통과 할 가능성이 있음을 나타냅니다 0.68입니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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베이스 라인 값 용량 응답
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0.049093369 패스
0.396788976 패스
-0.013655743 패스
0.011080217 패스
0.004203349 실패
0.003975049 실패
-0.077935718 패스
-0.084488317 패스
0.030236078 실패
-0.042963576 실패
0.03146​​6406 실패
0.025897747 실패
-0.030434651 실패
-0.004122795 실패
-0.010075533 실패
0.028883452 실패
0.019402373 실패
0.047508749 실패
0.00255344 실패
0.017221449 실패
0.340216655 패스
-0.026912181 실패
0.037140428 실패
0.467763017 패스
0.097665337 실패
0.080657267 패스
0.172819211 패스
0.05568393 패스
-0.106721064 패스
0.136614849 패스
0.457839849 실패
0.211751741 실패
0.1581464 패스
-0.62099155 패스
-0.066949491 패스
-0.78712035 패스
0.752503007 패스
1.433407558 패스
0.475431098 패스
1.457936815 패스
0.048652537 실패
0.027196782 실패
0.129599842 실패
-0.069781272 실패
0.016450039 실패
-0.025639207 실패
0.158152141 실패
-0.032570055 실패
0.140139926 실패
-0.052030276 실패
0.657140133 패스
1.040410297 패스
패스
0.399588712 패스
0.188094387 패스
0.039371424 패스
0.016784352 패스
0.229959571 패스
0.238381997 실패
0.074118909 실패
0.423901128 패스
0.152621022 패스
패스
0.075301806 패스
0.395233972 패스
0.261892958 패스
0.156693306 실패
2.163418147 패스
3.649862104 패스
0.025716169 패스
-0.033258008 패스
-0.026984127 실패
-0.338441868 패스
0.37398618 패스

용량 반응 시험 표 3. 후각 수용체 / 냄새 쌍.베이스 라인 루시 페라 제 값과 화면에서 선택 48 OR / 냄새 쌍에 대한 용량 반응 결과 (통과 또는 실패). 두 번 화면에서 테스트 30쌍를 들어, 모두베이스 라인 루시퍼 값이 포함되어 있습니다.

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Discussion

악취 물질 ID는 후각 수용체 활성화 패턴에 의해 인코딩되어 있지만 수용체가 활성화되고 어느 정도에하는 등의 수용체 활성화 패턴은, 인간의 후각 수용체 1-11 미만 6 % 알려져있다. 후각 수용체를 특성화하기위한 노력이 후각 수용체 가족 17,23,24,33,34의 서브 세트 만에 자신의 노동 집약적 인 방법이나 적용에 의해 제한되었다. Hana3A 이종 발현 시스템은 시험 후각 수용체의 대부분의 강력한 발현을 지원하고 후각 수용체 활성화 19,26,27을 모니터링하는 cAMP에 응답하여 루시퍼 라제 리포터 시스템과 함께 사용될 수있다. 96 - 웰 포맷이 분석의 성능은 상호 작용을 확인하기 위하여 취제 / 후각 수용체 쌍 및 투여 량 - 반응 곡선에 대한 가능성 후보를 결정하고, 수용체 활성화 수준 AF 얼마나 평가하는 스크린을 포함하여 높은 처리량 실험 디자인의 수를 지원인트라 및 인터 - 특정 변형에 의해 인해 영향받은. 화면에 높은 활성 값으로 악취 물질 / 수용체 쌍은 상당한 용량 반응을 보여 가능성이 더 높습니다. 이러한 데이터는이 검사 방법이되어 악취 물질 리간드와 후각 수용체 활성화 패턴의 식별을 용이하게, 용량 반응을 전달합니다 후각 / 수용체 쌍에 대해 풍부하게 할 수 있다는 것을 시사한다.

후각 수용체 분석을 위해 최적화 된 본 분석의 성공은 여러 가지 요인에 의존한다. 모든 플라스미드 DNA는 독소가없는 프로토콜을 통해 준비를해야합니다. 세포 표면에서 일관된 후각 수용체 발현이 중요합니다. Hana3A 세포주는 안정적이나 표현 도움이 몇 가지 액세서리 단백질을 표현하지만, RTP1S와 M3-R의 공동 형질은 각각 27, 수용체 발현 및 활성을 향상시킵니다. 소품 단백질 발현의 조합하므로 대부분 후각 수용체의 안정적인 발현을 초래 compariso의 N 또는 실험과 수용체 사이의 활성화. 또한, 세포의 컨 플루 모니터링 일관된 결과를 얻기 위해 중요하다. 대략 100 % 합류는 본원에 기재된 프로토콜을 실험 전반에 걸쳐 안정적인 세포 컨 플루 초래할 것이다 다음, 일본어 10cm 2 접시에 세포를 가정하고있다. 중요한 것은, 충분한 세포를 측정 루시 페라 제 수치를 얻기 위해 도금 될 것입니다,하지만 세포는 후각 자극 다음과 같은 수용체 활성화에 영향을 미칠 수있는 조건을 성장 오버되지 않습니다. 셀 밀도뿐만 아니라, 형질 전환 효율뿐만 아니라, 구성 적 레 닐라 식 상기 컨트롤 정규화. 평균 이하보다 2.5 표준 편차를 읽고 레 닐라 루시퍼 라제는 세포의 손실을 나타낼 수 있습니다. 세포는 세포보다 희박한 플레이트 표면으로부터 더 쉽게 분리 조밀 플라크를 피하기 위해 균일하게 도금되어야하고, 형질 감염 및 취제 해법은 분리 CEL을 피하기 위해 잘 측으로 부드럽게 추가되어야LS. 셀 손실은 악취 물질 독성, 0.5 % 이하 DMSO 농도를 유지하여 피할 수 있습니다 악취 물질 농도, 또는 과도한 DMSO를 낮추는 방법으로 피할 수있는 문제로 인해 발생 된 세포의 죽음으로 인해 수 있습니다. 마지막으로, 1 μM의 포르 스 콜린 캠프 응답 프로모터에서 루시 페라 제 기자의 표현을 일으키는 아데 닐 레이트 사이 클라 제의 활성화, 각 수용체를 발현하는 세포 인구를 치료하면 분석에 대한 긍정적 인 제어 역할을 할 수 있습니다.

본원에 기재된 분석법은 포유 동물의 후각 수용체 패밀리에 대한 높은 처리량 포맷보다 일반적인 적용을 포함한 다른 방법에 비해 개선을 나타내지 만, 그것은 한계가있다. 첫째, 우리의 시험 관내 분석은 후각 결합 단백질, 점막층, 세포 내 분자와 냄새 행동을 포함하는 생체 내 후각 시스템의 여러 구성 요소가 부족하다. 둘째로,이 방법은 후각 수용체를 측정하는 루시퍼 라제 리포터 시스템에 의존칼슘 이미징을 이용하는 일반적인 대체 방법과 대조적으로 활성화. 최근의 연구는 이러한 두 가지 방법이 충돌하는 결과를 생성 할 수 있습니다 것을 제안; 칼슘 이미징하지만 루시 페라 제 분석 (41)를 통해 검사 할 때 실제로, 몇 후각 수용체는 특정 악취 물질에 반응한다. 한 분석 유형이 인간의 후각 인식의 연구에 더 관련이 있는지 여부는 불분명하지만, 두 방법은 컨텍스트와 수용체의 종류에 따라 도움이 될 수 있습니다. 이 기능 발현 시스템이 성공적으로 테스트 포유 동물의 후각 수용체의 대부분을 표현하기 위해 사용하고있는 동안 셋째, 일부 관찰 보고서는이 시스템을 사용하여 표현에 순종하지 않을 수 있습니다. 이전에 uncharacterized 수용체가 냄새에 반응하지 않으면, 오히려 악취 물질과 수용체 사이의 상호 작용의 부족보다 세포 표면에서 발현의 부족으로 인해 수 있습니다. 수용체 세포 표면 발현 음의 분석에서 결론을 내리기 전에 면역을 통해 검사 할 수 있습니다 27,42 결과 (38, 39)에 대한 악취 길항제를 결정하기 위해, 대부분의 수용체는 처음 루시 페라 제 활동의 감소를 관찰하기 위해 냄새로 자극해야합니다.

이러한 제한에도 불구하고,이 분석 시스템은 크게 후각의 필드에 데이터 수집을 증가시키는 기능이있다. 먼저, 높은 처리량 96 - 웰 포맷은 대규모 수용체 및 / 또는 냄새 스크린 실현한다. 둘째, 그 이종 발현 시스템은 포유 동물의 후각 수용체의 다양한 적용 가능하다. 셋째, 루시퍼 라제 활성은 특정 악취 물질에 대한 수용체 활성화 패턴을 설명하는데 유용하다 후각 수용체 활성화를 측정하는 데 사용될 수있다. 넷째, 유사한 시험 관내 분석 시스템에서 이전 결과는 인간의 후각 인식 8,11,35을 예측하고있다. 이러한 특성은 partic 아르ularly 중요한 포유 동물의 후각 수용체 가족의 큰 크기와 특정 냄새에 의해 유발 또는 활성화 패턴에 관한 우리의 제한된 지식 없습니다. 후각 수용체 분석을 위해 최적화 된이 분석 시스템의 광범위한 애플리케이션은 후각 수용체 / 취제 상호 작용과 냄새 코딩의 기초 분자의 더 포괄적 인 그림을 올릴 것이다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 작품은 R01 DC013339, R03 DC011373, 루스 L. 키르 국가 연구 서비스 상 T32 DC000014에 의해 지원되었다. 작품의 일부는 NIH-NIDCD 코어 부여 P30의 DC011735 자금에 의해 부분적으로 지원되는 모넬 화학 감각 수용체 신호 코어를 사용하여 수행 하였다. 저자는 데이터 수집에 대한 도움 C. Sezille 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hana3A cells Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
RTP1S-pCI Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
M3-R-pCI Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
pCRE-luc Agilent 219076 LUC
pSV40-RL Promega E2231 RL
Minimum Essential Media, Eagle Sigma Aldrich M4655 MEM
FBS Life Technologies 16000-044 FBS
PBS (without Ca2+ and Mg2+) Cellgro 21-040-CV PBS
Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) Life Technologies 25300 Trypsin
CD293 Life Technologies 11913-019 CD293
96-well PDL white/clear plate BD BioCoat 356693 plates
Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Lipofectamine
Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay Promega E2980 dual glo
Synergy S2  BioTek SLAD BioTek S2
Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software BioTek Gen5 Gen5
BIOSTACK BioTek BIOSTACK2WR BioStack
Multiflo BioTek MFP MultiFlo
300 μl GripTips Integra 4433 GripTips
12.5 μl GripTips Integra 4414 GripTips
300 μl GripTips ViaFlo96 Integra 6433 XYZ tips
12.5 μl GripTips 384 XYZ Integra 6403 XYZ tips
384ViaFlo Integra 6030 384ViaFlo
TE buffer Macherey Nagel 740797.1
DMSO Sigma Aldrich D2650-100ML DMSO
Forskolin Enzo Life Sciences BML-CN100-0010 FOR

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