High-throughput Analisi dei mammiferi olfattive Recettori: Misurazione del recettore Attivazione tramite Luciferase Activity

Neuroscience

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Summary

Olfattive pattern di attivazione del recettore codificano identità odore, ma la mancanza di dati pubblicati identificativi ligandi odoranti per i recettori olfattivi dei mammiferi ostacola lo sviluppo di un modello completo di codifica odore. Questo protocollo descrive un metodo per facilitare l'identificazione ad alta produttività di ligandi dei recettori olfattivi e quantificazione di attivazione del recettore.

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Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity. J. Vis. Exp. (88), e51640, doi:10.3791/51640 (2014).

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Abstract

Odoranti di creare modelli unici e sovrapposte di attivazione del recettore olfattivo, permettendo una famiglia di circa 1.000 murino e 400 recettori umani di riconoscere migliaia di odoranti. Ligandi odoranti sono stati pubblicati da meno di 6% di recettori umani 1-11. Questa mancanza di dati è dovuta in parte alle difficoltà funzionalmente esprimono questi recettori in sistemi eterologhi. Qui, descriviamo un metodo per esprimere la maggior parte della famiglia dei recettori olfattiva in cellule Hana3A, seguita da valutazione ad alta velocità di attivazione del recettore olfattivo utilizzando un saggio reporter di luciferasi. Questo test può essere utilizzato per (1) pannelli schermo di odoranti contro pannelli di recettori olfattivi; (2) confermare l'interazione odorizzante / recettore tramite curve dose-risposta; e (3) confrontare i livelli di attivazione del recettore tra le varianti del recettore. Nei nostri dati di esempio, 328 recettori olfattivi sono stati proiettati contro 26 odoranti. Coppie di odorizzante / recettori con diversi punteggi di risposta erano selezioneted e testato in dose-risposta. Questi dati indicano che uno schermo è un metodo efficace per arricchire per coppie odorizzante / recettore che passeranno un esperimento dose-risposta, cioè recettori che hanno una risposta bona fide a un odorizzante. Pertanto, questa high throughput saggio luciferasi è un metodo efficace per caratterizzare olfattiva recettori-un passo essenziale verso un modello di codifica odore nel sistema olfattivo dei mammiferi.

Introduction

Il sistema olfattivo dei mammiferi ha la capacità di rispondere ad un vasto numero di stimoli odorosi, consentendo la rilevazione e la discriminazione di migliaia di odoranti. Recettori olfattivi (OR) sono i sensori molecolari espressi dai neuroni sensoriali olfattivi nell'epitelio olfattivo 12. Riconoscimento odore dei mammiferi avviene attraverso l'attivazione differenziale delle RUP di odoranti, e l'OR famiglia di geni è ampia, con circa 1.000 murino e 400 recettori umani 12-16. Analisi funzionali precedenti di RUP nei neuroni olfattivi e nelle cellule eterologhe hanno dimostrato che diversi odoranti sono riconosciuti da unico, ma insiemi di RUP 10,17-20 sovrapposizione. Corrispondenza ligandi di RUP è fondamentale per comprendere il codice olfattivo ed essenziale per la costruzione di modelli sostenibili di olfatto. A causa delle difficoltà che esprimono RUP in sistemi eterologhi nonché il gran numero di entrambi odoranti e RUP, questi dati è stato praticamente assente dal field; anzi, meno del 6% delle RUP umani hanno un ligando pubblicato 1-11. Questo protocollo descrive l'uso di un saggio di luciferasi per caratterizzare odoranti / o interazioni. Questo test consente la caratterizzazione high-throughput di RUP, un compito che è essenziale per comprendere odorizzante / o interazioni, nonché lo sviluppo di un modello di codifica odore.

Gli studi High-throughput di RUP devono affrontare tre grandi sfide. In primo luogo, OR espressi in cellule eterologhe sono stati mantenuti al pronto soccorso e successivamente degradata nel proteasoma 21,22, impedendo ai RUP di interagire con odoranti nel sistema di dosaggio 23-25. Questo problema è stato affrontato dalla scoperta di proteine ​​accessorie che facilitano l'espressione sulla superficie cellulare stabile di una vasta gamma di RUP 19,26,27. Receptor-trasportatore-proteine ​​1 e 2 (RTP1 e 2) promuovere o espressione sulla superficie cellulare e l'attivazione in risposta alla stimolazione odorizzante 19. Sulla base di questo lavoro, HEK293T cellule eranomodificata per esprimere stabilmente RTP1 lungo (RTP1L) e RTP2, recettore espressione di miglioramento proteina 1, e G αolf, risultante nella linea cellulare Hana3A 19,27. Inoltre, il tipo 3 recettori muscarinici (M3-R) interagisce con RUP sulla superficie cellulare e migliora l'attivazione in risposta a odoranti 26. Co-trasfezione di un OR con RTP1S e M3-R in Hana3A cellule risultati nella robusta, coerente e funzionale espressione di una vasta gamma di RUP sulla superficie cellulare 27. In secondo luogo, mammifero o repertori sono abbastanza grandi. Negli esseri umani, per esempio, il repertorio OR è un ordine di grandezza più numerose di repertorio recettore gustativo, e 2 ordini di grandezza più numerose di repertorio recettore visivo. Sebbene clonazione di una singola O è un protocollo relativamente semplice, è necessaria notevole sforzo up-front per generare una libreria completa. In terzo luogo, anche se sappiamo che nella visione, di lunghezza d'onda si traduce in colori ein frequenza audizione si traduce in campo, l'organizzazione degli odori è poco conosciuta, rendendo difficile per i ricercatori di interpolare da un campione rappresentativo di odoranti. Anche se sono stati compiuti alcuni progressi su questo fronte 10,28, la mappa del paesaggio olfattivo rimane incompleto. Screening decine di migliaia di molecole contro centinaia di RUP è un compito arduo; schermi high-throughput in questo settore richiedono campagne accuratamente definiti. Le grandi sfide rimanenti sono quelli della logistica e dei costi, piuttosto che problemi inerenti alla tecnica. Sebbene lo screening eterologo non è stato ampiamente utilizzato per identificare ligandi da gruppi accademici, una società privata ha utilizzato la stessa tecnica per identificare ligandi per 100 RUP umani 29. Purtroppo, questi dati rimangono di proprietà.

La luciferasi saggio ad alta prestazione qui descritto ha diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi utilizzati per valutare O attivazione. Anche se la responsabilitàses dei neuroni sensoriali olfattivi nativi sono stati misurati utilizzando elettrofisiologia e di imaging di calcio, queste tecniche hanno difficoltà a prendere in giro oltre che O porta alla risposta di un neurone causa della sovrapposizione di proprietà di risposta per i neuroni olfattivi. Anche se bussare in una GFP-etichettata tipo di recettore 30,31, offrendo recettori specifici tramite adenovirus murino neuroni olfattivi 32,33, o l'esecuzione di RT-PCR dopo le registrazioni 17,24,33 può collegarsi registrazioni tipi di recettori singoli, questi metodi sono a bassa velocità e non adatto per schermi di grandi dimensioni. Sistemi di screening eterologhi sono più scalabili, e due forme principali si trovano in letteratura: i giornalisti di via cAMP e inositolo trifosfato (IP3) giornalisti di via. Dopo stimolazione odore, RUP attivano una cascata di segnali G αolf trasduzione che provoca la produzione di AMP ciclico (cAMP) 12. Mediante co-trasfezione una lucciola gene reporter luciferasi sotto il controllo di acAMP risposta elemento (CRE), produzione luciferasi può essere misurata in funzione della risposta odore, permettendo la quantificazione di OR attivazione. O attivazione può anche essere collegata al percorso IP3 mediante co-esprimono proteine ​​G come G α15/16 o un G α15-OLF chimera 24,25,34. Abbiamo scelto il saggio qui presentato sulla base di tre fattori: (1) la co-espressione di RTP1 con i recettori olfattivi Rho-contrassegnate migliora l'espressione di recettori olfattivi sulla superficie cellulare 19,27; (2) l'uso di un gene reporter cAMP-reattivo consente la misurazione di OR attivazione attraverso il percorso del secondo messaggero canonica; e (3) il saggio è adatto agli schermi high-throughput.

Questo saggio luciferasi ad alta produttività è applicabile ad una varietà di pregevoli studi al campo dell'olfatto. In primo luogo, un gran numero di RUP può essere proiettato contro un singolo odorante per determinare lo schema di attivazione recettore di un spodorizzante ecific. Questo tipo di studio ha identificato OR7D4 come OR responsabile per rispondere alla steroide androstenone odorizzante 8. Viceversa, uno o potrà essere schermato contro un pannello di odoranti per determinare il profilo di risposta recettore 10. Quando candidato olfattivo odorizzante / O coppie sono identificati tramite questi schermi, interazione può essere confermata effettuando un esperimento dose risposta esaminando la risposta del OR a concentrazioni crescenti di odorizzante. Curve dose-risposta possono anche valutare come variazione genetica in un OR colpisce in vitro risposta odorizzante 8,9,11,35, e questi studi possono essere esteso a interspecifica o variazione, consentendo l'esame dell'evoluzione del recettore attraverso le specie e le mutazioni causali nell'evoluzione 36,37, infine, questo saggio può essere utilizzato per lo screening di antagonisti odori che sono in grado di antagonizzare o la risposta ad una particolare odorizzante per una coppia odorizzante / ricevitore conosciuto 38,39. In sintesi, questo alto-Capacità saggio luciferasi è applicabile ad una serie di studi che aiuteranno caratterizzano o pattern di attivazione e fornire una migliore comprensione della codifica odore nel sistema olfattivo.

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Protocol

1. Coltura di cellule Hana3A

  1. Preparare supporti M10 completandolo mezzo minimo essenziale (MEM) con il 10% (v / v) di FBS.
  2. Cultura di manutenzione
    1. Mantenere le cellule in mezzi M10. NOTA: I vettori di espressione per RTP1L, RTP2, REEP1, e G αolf conferiscono resistenza puromicina alle cellule Hana3A, ma mantenendo le cellule con questo antibiotico non influenzano significativamente i risultati del test.
    2. Subculture con un rapporto di 01:08 a 10 centimetri piatti ogni 2-3 giorni.
    3. Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2.

2. Cellule placcatura per Transfezione

  1. Aspirare il terreno da un confluente 10 centimetri piatto 100% delle cellule Hana3A.
  2. Lavare le cellule con l'aggiunta di 10 ml di PBS, roteando il piatto, e aspirare il PBS.
  3. Aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina / EDTA e attendere cellule di dissociarsi (circa 1 min).
  4. Inattivare la tripsina aggiungendo 5 ml di M10 e rompere grumi di cellule triturando circa 10x &# 160, con una pipetta 10 ml. Dispensare con cautela per evitare l'introduzione di bolle d'aria nella media.
  5. Per ciascuna piastra da 96 pozzetti, trasferire 1 ml di cellule in una provetta conica da 15 ml, centrifugare a 200 xg per 5 min, e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet.
  6. Risospendere le cellule in 6 ml M10 per 1 ml di cellule trasferito nel passaggio 2.5.
  7. Pipettare 50 ml di cellule a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti e incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO 2.

3. Trasfezione di recettori olfattivi

  1. Preparazione di DNA plasmidico
    1. Preparare plasmide DNA tramite un protocollo privo di endotossine. NOTA: kit di preparazione uso del DNA plasmide designati "privo di endotossine", o aggiungere un passo di estrazione fenolo-cloroformio al DNA protocollo di preparazione plasmide.
    2. Diluire DNA ad una concentrazione di 100 ng / ml in tampone TE.
  2. Osservare le cellule placcato (Passo 2.7) per garantire una corretta confluenza di ravvicinamentotamente 30-50% per bene e tornare a incubatore. NOTA: Mentre questa confluenza non è ottimale per il reagente di transfezione lipidi, una confluenza del 30-50% in questa fase è ottimale per misurare l'attività della luciferasi 24 ore dopo la trasfezione.
  3. Preparazione di Transfezione Mix
    1. Pipetta RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE-luc, e pSV40-RL plasmidi in MEM medio per i volumi specificati nella tabella 1 per rendere il plasmide mix (i volumi indicati si intendono piastra a 96 pozzetti). RTP1S-PCI
      Mix plasmide
      per pozzetto per piastra a 96 pozzetti
      MEM - 500 microlitri
      5 ng 480 ng
      M3-R-PCI 2.5 ng 240 ng
      PCRE-luc 10 ng 960 ng
      pSV40-RL 5 ng 480 ng

      Componenti Tabella 1. Plasmidi mix. Per oltre e per volumi piastra a 96 pozzetti di RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE-luc, e pSV40-RL, e MEM.
    2. Per ogni piastra a 96 pozzetti, diluire 18 ml di lipidi trasfezione reattivo in 450 microlitri di media MEM.
    3. Pipetta plasmide mix (dal punto 3.3.1), rodopsina-tagged recettore olfattivo PCI plasmide (Rho-OR-PCI), e la miscela di trasfezione lipidico (dal punto 3.3.2) per rendere il complesso dettagliata tabella 2. NOTA: questa reazione è il tempo sensibile e non dovrebbe essere permesso di continuare per più di 30 min. Il pozzo + 10% calcolo è importante garantire un volume sufficiente per passi successivi. Mix di trasfezione Lipid
      Complesso
      per pozzetto per pozzetto + 10%
      Mix plasmide 4.2 microlitri 4.58 microlitri
      Rho-O-PCI 0.05 ng 0,06 ng
      4.2 microlitri 4.58 microlitri
      M10 41.7 ml 45,83 microlitri

      Tabella 2. Componenti complessi. Per bene e per oltre + 10% di volumi della miscela di plasmide (Tabella 1), il plasmide recettore olfattivo (Rho-OR-PCI), e mescolare lipidi trasfezione. M10 viene aggiunto per estinguere la seguente reazione a 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente.
  1. Toccare il supporto sulle piastre di cella.
  2. Pipettare 50 ml di complesso a ciascun pozzetto e incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO 2.

4. Odore stimolazione

  1. Osservare le cellule trasfettate per garantire una corretta confluenza del 50-80% per bene e tornare a incubatore. NOTA: Se le cellule sono meno di 50Letture% confluenti, lucciola luciferasi e Renilla luciferasi può essere troppo basso per la misurazione di attivazione del recettore. Si consideri scartando la piastra.
  2. Preparare 1 M soluzioni madre di ogni odore in DMSO.
  3. Preparare le soluzioni di stimolazione odore di CD293 medio.
    1. Per gli esperimenti di screening, diluire soluzione stock di odore a 100 micron. Anche preparare un controllo senza odore (CD293 solo) per controllare per OR attivazione sfondo. NOTA: Per gli esperimenti di screening, ogni coppia O / odore è stato testato soltanto una volta per ogni esperimento. Poiché alcuni diffusione odore di tutti i pozzetti è possibile, si raccomanda di stimolare con un odorizzante per ciascuna piastra.
    2. Per gli esperimenti dose-risposta, preparare sette diluizioni seriali di 10 volte di soluzione odore magazzino in triplice copia a partire da 1 mm per ciascun recettore. Anche preparare le stesse diluizioni odore in triplicato per cellule transfettate vettore vuoto al fine di controllare l'attivazione odore sfondo. NOTA: Per gli esperimenti dose-risposta, ogni odor trattamento concentrazione dovrebbe essere condotto in triplice copia.
  4. Toccare il supporto sulle piastre di cella.
  5. Pipettare 25 ml di soluzione di stimolazione odore ad ogni pozzetto e incubare per 4 ore.

5. Misura o attività via Luciferase Assay

  1. Risospendere substrato di luciferasi di lucciola secondo le istruzioni del produttore e conservare a -80 ° C.
  2. Scongelare 1 ml di substrato della luciferasi di lucciola per piastra a 96 pozzetti.
  3. Preparare fresco reazione luciferasi di lucciola dissetante e Renilla luciferasi reagente substrato (5 microlitri luciferasi quencher / Renilla luciferasi substrato per 1 ml di tampone). NOTA: circa 1 ml di reagente è necessario per piastra a 96 pozzetti.
  4. Preparare il lettore luminescenti micropiastre. Aprire il software lettore di micropiastre. All'interno l'icona di sistema:
    1. Sotto il "Pre-riscaldamento" Tab, selezionare la casella "ON" e impostare la temperatura della macchina a 25 °; C.
    2. Nella scheda "Dispenser", prime ciascun erogatore con 1.000 ml di etanolo al 70% seguita da 1.000 ml di acqua distillata. NOTA: Utilizzare aliquote separate di alcool e acqua per ogni erogatore. Etanolo è utilizzato per disinfettare i dispenser, e acqua rimuove l'etanolo residuo.
    3. Prime ciascun erogatore con 1.500 ml di aria (rimuovi dispenser da liquido). NOTA: adescamento di aria assicura che i substrati luciferasi non sono diluiti con acqua residua.
    4. Dispenser Prime 1 con 1.080 ml di substrato luciferasi di lucciola (dal punto 5.2). Dispenser Prime 2 con Renilla substrato luciferasi (dal punto 5.3). NOTA: Fare attenzione a non contaminare i substrati luciferasi. Adescamento con i substrati luciferasi riempie lo spazio morto nei dispensatori di reagenti.
  5. Impostare il seguente protocollo di leggere sia lucciola e Renilla luciferasi luminescenza. All'interno del software associato al lettore di micropiastre, ONUder menu "File", cliccare su "Nuova attività". Evidenziare "Protocolli" e cliccare su "Crea nuovo". Nella finestra successiva, il cerchio accanto a "protocollo standard" dovrebbe essere selezionata. Fare clic su "OK". Fare doppio clic su "Procedura" sul lato sinistro dello schermo.
    1. Dispensare 10 ml di substrato luciferasi di lucciola a tutti i pozzetti con dispenser 1. Sotto il menu "Azioni", fai clic su "Dispense". Nella finestra "Dispensare Step", impostare "Dispenser" a 1 "Adescamento" a nessuno, "Dispense Volume" a 10 microlitri e "Rate" a 225 ml / sec. Fare clic su "OK".
    2. Agitare la piastra per 30 sec. Sotto il menu "Azioni", fai clic su "Shake". Nella finestra "Shake Step", impostare "Intensity" per Medio e "Durata" alle 0:30 MM: SS. Fare clic su "OK".
    3. Leggi la luminescenza di tutti i pozzi per 0,5 sec per bene. Sotto il menu "Azioni", fare clic su "Leggi";. Nella finestra "Leggi Step", impostare "Metodo di rilevazione" a luminescenza, "Leggi Type" per Endpoint, "Integrazione Time" a 00:00:50 MM: SS: ss, "Filter Sets" a 1 "Emissione" Hole, "Ottica Position" a Top, "Gain" per 135, e "Leggi altezza" a 1.00 mm. Fare clic su "OK".
    4. Dispensare 10 ml di Renilla substrato luciferasi a tutti i pozzetti con dispenser 2. Impostare le condizioni della Fase 5.6.1, salvo set "Dispenser" a 2.
    5. Agitare piastra per 30 sec. Impostare le condizioni nel passaggio 5.6.2.
    6. Leggi luminescenza di tutti i pozzetti per 0,5 sec per bene. Impostare le condizioni nel passaggio 5.6.3.
  6. Rimuovere il coperchio dalla piastra a 96 pozzetti e posizionare la piastra nel lettore di micropiastre. Avviare il programma esposto al punto 5.5 per leggere piastra luminescenza.
  7. Pulire le pompe dispenser reagenti. Dall'icona sistema sotto la scheda "Dispenser":
    1. Purge 1.000 ml di fsubstrato di luciferasi irefly dal dispenser luciferasi lucciola in un tubo di recupero. NOTA: luciferasi della lucciola può essere conservato a -80 ° C e riutilizzato.
    2. Prime ciascun erogatore con 1000 ml di acqua distillata, seguiti da 1.000 ml di etanolo al 70%, e infine 1.500 microlitri di aria (rimuovi dispenser da liquido). NOTA: L'acqua elimina substrati luciferasi dalle pompe reagenti, disinfetta etanolo, e l'aria asciuga ogni residuo di etanolo.

6. Analisi dei dati

  1. Data Export
    1. Nel software lettore di micropiastre, fare doppio clic su "Segnala / Export Costruttori" sul lato sinistro dello schermo.
    2. Fare clic sul pulsante "Nuovo Esporta in Excel" e fare clic su "OK".
    3. Evidenziare Esport1 e fare clic su "Modifica".
      1. In "Contenuti" check "Descrizione del sistema", "Procedura", "Descrizione Piatto" e "Piatto layout Matrix". Include "dati grezzi", unnd "Calcolato dati".
      2. In "Workflow", selezionare "Esecuzione automatica al termine della procedura". In modalità di esportazione, controllare "Tutti i piatti nella stessa cartella di lavoro" e "come un nuovo foglio di lavoro".
      3. Sotto "File", scegliere il formato del nome file e il percorso del file e fare clic su "OK".
      4. Chiudere la finestra "Segnala / Export Costruttori".
  2. Per ottenere i valori normalizzati luciferasi, dividere la luciferasi di lucciola lettura luminescenza per ogni bene (Step 5.6.3), dalla lettura luminescenza Renilla per ogni pozzetto (fase 5.6.6).

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Representative Results

Uno schermo primario testato 328 RUP contro 26 odori ad una concentrazione di 100 mM. Questa concentrazione di odore è stato dimostrato per attivare efficacemente una grande proporzione di RUP con ligandi noti 10. In primo luogo, l'attività della luciferasi normalizzata è stata calcolata dividendo la lettura luciferasi lucciola dalla lettura Renilla luciferasi. Successivamente, i valori baselined sono stati calcolati sottraendo le letture luciferasi normalizzati per il controllo senza odore dalle letture luciferasi normalizzati per ogni pozzetto (Figura 1). Curve dose-risposta sono state effettuate su 48 odorizzante / O coppie casualmente distribuite su tutta la gamma dei valori baselined, come indicato dalle barre colorate in Figura 1. RUP sono stati trattati con 7 concentrazioni di odorizzante attraversa 1 nM a 1 mM, e quelli risultanti erano idonei ad una curva sigmoidale utilizzando la regressione non lineare. Un odorizzante / O è stato considerato un agonista se si è riunito tre criteri: (1) l'errore standard dellail logEC 50 era meno di 1 unità log; (2) gli intervalli di confidenza al 95% per i parametri superiore e inferiore della curva non si sovrappongono; e (3) la prova supplementare somme dei quadrati confermato che l'odorizzante attivato gli O-contenenti cellule significativamente maggiore rispetto alle cellule di controllo, che sono state trasfettate con un vettore vuoto. Risultati dose-risposta sono riassunti nella Tabella 3.

Questi dati sono stati poi utilizzati per determinare quanto bene misurazioni diagnostiche in uno schermo primario predicono i risultati dalla curva dose-risposta. Barre blu in figura 1 corrispondono a coppie che sono stati classificati come agonisti in un esperimento risposta dose piena, mentre le barre rosse non soddisfacevano i nostri tre criteri di cui sopra. Valori dalla schermata principale predetto risultati dal dosaggio pieno esperimento risposta (area sotto la curva ROC (AUC) = 0.68, p <0.01, Mann-Whitney U test), indicando che il nostro schermo principale è un metodo utile per arricchire di odoranti / o coppie che saranno classificate come agonisti in un esperimento risposta dosaggio pieno (Figura 2).

Figura 1
Figura 1. Frequenza di valori luciferasi baselined per uno schermo con un pannello di recettori olfattivi e odoranti. Istogramma della frequenza (Count) dei valori luciferasi baselined calcolati per ogni odorizzante / o coppia nella schermata principale. Come odorizzante / recettore coppie di attivazione sono scarsi, la maggior parte dei valori sono centrate a zero e la grande distribuzione centrale stima che la distribuzione del rumore per questo dosaggio. Colorate barre indicano coppie odorizzante / recettori scelti per l'analisi dose-risposta; barre blu sono coppie che sono stati classificati come agonisti basati sulla risposta dose piena, e le barre rosse sono coppie che non sono stati classificati come agonisti.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51640/51640fig1highres.jpg" target = "_blank"> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2
Figura 2. Curva ROC per la schermata di odorizzante / recettore. Odorizzante 48 accoppiamenti / recettori sono stati classificati come agonisti o come non agonisti. Tasso positivo True (sensibilità) si è poi tracciata contro il tasso di falsi positivi (1-specificità) utilizzando il pacchetto statistico R 40. L'area sotto la curva (AUC) è 0,68, che indica che le coppie odorizzante / recettore con valori schermo luciferasi più alti sono più propensi a passare dose-risposta rispetto a quelli con valori più bassi. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Tabella 3. Olfattiva coppie recettore / odore testati in risposta alla dose. Valori luciferasi baselined e risultati dose-risposta (passare o fallire) per 48 O / odore coppie scelti dallo schermo. Per 30 paia testati in due volte lo schermo, entrambi i valori di luciferasi baselined sono inclusi.

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Discussion

Identità odorizzante è codificato da olfattivi pattern di attivazione del recettore, ma pattern di attivazione del recettore, tra cui i recettori che vengono attivati ​​e in che misura, sono noti da meno di 6% dei recettori olfattivi umani 1-11. Gli sforzi per caratterizzare i recettori olfattivi sono stati limitati dai loro metodi o applicabilità alta intensità di lavoro solo a un sottoinsieme della olfattivo 17,23,24,33,34 famiglia di recettori. Il sistema di espressione eterologo Hana3A supporta la robusta espressione della maggioranza dei recettori olfattivi testati, e può essere utilizzato in combinazione con un sistema reporter luciferasi cAMP-responsive per monitorare l'attivazione del recettore olfattivo 19,26,27. Le prestazioni di questo test in un formato a 96 pozzetti supporta una serie di high-throughput disegni sperimentali, tra cui schermi per determinare probabili candidati per le coppie odorizzante / recettore olfattivo e curve dose-risposta per confermare le interazioni e valutare come i livelli di attivazione del recettore sono afzata da variazioni intra-ed inter-specifiche. Coppie di odorizzante / recettore con valori più elevati di attività in una schermata sono più propensi a dare prova di una dose-risposta significativa. Questi dati suggeriscono che questo metodo di controllo è in grado di arricchire per coppie odorizzante / recettore che passeranno dose risposta, facilitando così l'identificazione di ligandi odoranti e olfattivi pattern di attivazione del recettore.

Il successo di questo test ottimizzato per l'analisi recettore olfattivo dipende da diversi fattori. Tutti DNA plasmidico deve essere preparato tramite un protocollo privo di endotossine. Espressione del recettore olfattivo coerente alla superficie delle cellule è critica. La linea cellulare Hana3A esprime stabilmente diverse proteine ​​accessorie che aiutano a O di espressione, ma co-trasfezione di RTP1S e M3-R migliora espressione dei recettori e l'attivazione, rispettivamente, 27. Questa combinazione di espressione proteina accessoria risulta nell'espressione affidabile di maggior recettori olfattivi, consentendo CONFRONTOn O di attivazione tra esperimenti e recettori. Inoltre, il monitoraggio di confluenza cellulare è importante per ottenere risultati coerenti. Supponendo le cellule nel 10 con cm 2 per piatti sono circa 100% confluenti, seguendo il protocollo qui descritto comporta confluenza cella affidabile tutto l'esperimento. È importante sottolineare che le cellule sufficienti saranno piastrate per ottenere una lettura luciferasi misurabile, ma le cellule non saranno troppo cresciuti, una condizione che può influenzare l'attivazione del recettore dopo stimolazione odorizzante. Normalizzare per costitutivi espressione Renilla ulteriori controlli non solo per la densità delle cellule, ma anche per l'efficienza di trasfezione. Un luciferasi Renilla la lettura più di 2,5 deviazioni standard al di sotto della media può indicare la perdita di cellule. Le cellule devono essere placcato uniformemente per evitare placche dense che si staccano facilmente dalla superficie della piastra di cellule più vuoti, e soluzioni di transfezione e odoranti dovrebbero essere aggiunti delicatamente al lato del bene per evitare il distacco cells. Perdita di cellule potrebbe anche essere dovuto alla morte cellulare causata dalla tossicità odorizzante, un problema che può essere aggirato abbassando la concentrazione di odorizzante, o eccessiva DMSO, che può essere evitato mantenendo le concentrazioni di DMSO inferiore allo 0,5%. Infine, trattando ogni popolazione di cellule che esprimono i recettori con 1 mM forskolina, un attivatore ciclasi ciclasi che provoca espressione luciferasi reporter del promotore cAMP-reattivo, può servire come controllo positivo per il dosaggio.

Benché il saggio qui descritto rappresenta un miglioramento rispetto metodi alternativi, tra cui un formato ad alta produttività e applicabilità più generale alla famiglia del recettore olfattivo di mammifero, presenta delle limitazioni. In primo luogo, il saggio in vitro manca di molti componenti di un sistema olfattivo in vivo, comprese proteine ​​leganti odoranti, uno strato mucoso, molecole intracellulari e comportamenti annusando. In secondo luogo, questo metodo si basa su un sistema reporter di luciferasi per misurare recettore olfattivoattivazione in contrasto con i metodi alternativi comuni che utilizzano calcium imaging. Un recente lavoro suggerisce che questi due metodi possono produrre risultati contrastanti; infatti, alcuni recettori olfattivi rispondono ad una particolare odorizzante se esaminato con calcium imaging ma non saggio luciferasi 41. Se un tipo di saggio è più rilevante per gli studi di percezione umana olfattiva rimane poco chiaro, ma entrambi i metodi potrebbe essere utile a seconda del contesto e del tipo di recettore. Terzo, mentre questo sistema di espressione funzionale è stato usato con successo per esprimere la maggior parte dei recettori olfattivi mammiferi testati, alcuni RUP possono non essere suscettibili di espressione tramite questo sistema. Se recettori precedentemente uncharacterized riescono a rispondere ad un odore, potrebbe essere dovuto alla mancanza di espressione sulla superficie cellulare piuttosto che una mancanza di interazione tra odorizzante e recettore. Superficie cellulare espressione del recettore può essere esaminato tramite immunofluorescenza prima di trarre conclusioni dai dati analitici negativo i risultati 27,42 38,39, la maggior parte dei recettori devono prima essere stimolate con un odore per osservare una riduzione dell'attività di luciferasi.

Nonostante queste limitazioni, questo sistema di analisi ha la capacità di aumentare notevolmente acquisizione dati nel campo dell'olfatto. Primo, il formato ad alta velocità a 96 pozzetti rende schermi recettore e / o odore larga scala fattibile. In secondo luogo, il suo sistema di espressione eterologo è applicabile ad una varietà di recettori olfattivi dei mammiferi. Terzo, l'attività della luciferasi può essere utilizzato per misurare l'attivazione del recettore olfattivo, che è utile nel descrivere i modelli di attivazione del recettore per un particolare odorizzante. In quarto luogo, precedenti risultati di sistemi di dosaggio in vitro simili a prevedere percezione olfattiva umana 8,11,35. Queste caratteristiche sono particolarmente importante data la grande dimensione della famiglia dei recettori olfattivi dei mammiferi e la nostra conoscenza limitata per quanto riguarda le O pattern di attivazione indotte da odori specifici. Ampia applicazione di questo sistema di analisi ottimizzato per l'analisi del recettore olfattivo contribuirà ad un quadro più completo del recettore olfattivo / interazione odorizzante e la base molecolare di codifica odore.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da DC013339 R01, R03 DC011373, e Ruth L. Kirschstein Servizio National Research Award T32 DC000014. Una parte del lavoro è stato eseguito utilizzando il Monell chemosensory Receptor segnalazione core, che è supportato, in parte, da un finanziamento della P30 DC011735 NIH-NIDCD core Grant. Gli autori ringraziano C. Sezille aiuto con la raccolta dei dati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hana3A cells Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
RTP1S-pCI Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
M3-R-pCI Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
pCRE-luc Agilent 219076 LUC
pSV40-RL Promega E2231 RL
Minimum Essential Media, Eagle Sigma Aldrich M4655 MEM
FBS Life Technologies 16000-044 FBS
PBS (without Ca2+ and Mg2+) Cellgro 21-040-CV PBS
Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) Life Technologies 25300 Trypsin
CD293 Life Technologies 11913-019 CD293
96-well PDL white/clear plate BD BioCoat 356693 plates
Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Lipofectamine
Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay Promega E2980 dual glo
Synergy S2  BioTek SLAD BioTek S2
Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software BioTek Gen5 Gen5
BIOSTACK BioTek BIOSTACK2WR BioStack
Multiflo BioTek MFP MultiFlo
300 μl GripTips Integra 4433 GripTips
12.5 μl GripTips Integra 4414 GripTips
300 μl GripTips ViaFlo96 Integra 6433 XYZ tips
12.5 μl GripTips 384 XYZ Integra 6403 XYZ tips
384ViaFlo Integra 6030 384ViaFlo
TE buffer Macherey Nagel 740797.1
DMSO Sigma Aldrich D2650-100ML DMSO
Forskolin Enzo Life Sciences BML-CN100-0010 FOR

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