تحليل شامل لديناميات النسخ من عينات المخ بعد تجربة السلوكية

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Turm, H., Mukherjee, D., Haritan, D., Tahor, M., Citri, A. Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience. J. Vis. Exp. (90), e51642, doi:10.3791/51642 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الترميز الخبرات في الدماغ وترسيخ ذكريات طويلة الأجل تعتمد على النسخ الجيني. تحديد وظيفة الجينات المحددة في تجربة الترميز هي واحدة من الأهداف الرئيسية لعلم الأعصاب الجزيئية. وعلاوة على ذلك، فإن جمعية الوظيفية للجينات محددة مع سلوكيات معينة لها آثار لفهم أساس من الاضطرابات العصبية والنفسية. وقد لوحظ تحريض برامج النسخ قوية في أدمغة الفئران التالية مختلف التلاعب السلوكية. بينما تستخدم بعض العناصر الوراثية متكرر التالية التلاعب سلوكية مختلفة ونوى الدماغ المختلفة، برامج النسخ عموما هي فريدة من نوعها لالمنبهات حمل وهيكل التي يتم دراستها 1،2.

في هذا المنشور، يوصف بروتوكول للالنسخي قوي وشامل من نوى دماغ الفئران ردا على التلاعب السلوكي. وويتجلى البروتوكول في سياق تحليل ديناميات التعبير الجيني في النواة المتكئة التالية تجربة الكوكايين الحادة. لاحقا إلى خبرة محددة في الجسم الحي، يتم تشريح الأنسجة العصبية المستهدفة؛ تليها تنقية RNA، عكس النسخ واستخدام المصفوفات ميكروفلويديك لتحليل شامل لQPCR متعددة الجينات المستهدفة. ويهدف هذا البروتوكول نحو تحليل شامل (50-500 معالجة الجينات) للحد من كميات من المواد ابتداء، مثل الدماغ عينات صغيرة أو حتى الخلايا واحد.

البروتوكول هو الأكثر فائدة لتحليل مواز من عينات متعددة (مثل الخلايا واحدة، التحليل الديناميكي الأدوية التالية، فيروسية أو الاضطرابات السلوكية). ومع ذلك، يمكن للبروتوكول يخدم أيضا لتوصيف وضمان الجودة من قبل عينات للدراسات كامل الجينوم بواسطة ميكروأرس أو RNAseq، وكذلك التحقق من صحة البيانات التي تم الحصول عليها من دراسات كامل الجينوم.

Introduction

تمكن منظمة ديناميكية الدماغ المرونة الإدراكية والسلوكية. يتم ترميز الخبرات من خلال إدخال تعديلات على هيكل وقوة الروابط بين الخلايا العصبية في الدماغ 3. هذا "تعتمد على الخبرة اللدونة" هي نتيجة تحريض أنماط معينة من التعبير الجيني الذي يوفر البروتينات اللازمة لتعديل هيكل متشابك وقوة 4. تحديد الشبكات التنظيمية الجينات التوسط في تكوين الذكريات على المدى الطويل هو أحد الركائز الأساسية لعلم الأعصاب الجزيئية، مع توقع أن تحديد العناصر المهيمنة من برامج النسخ ستوفر نظرة ثاقبة في المبادئ الأساسية التي تنظم تشكيل الذاكرة، فضلا عن أهداف ل علاج الاعصاب والاضطرابات العصبية والنفسية. برامج النسخ تتكشف في موجات محددة زمنيا، وكل منها ترميز جينات شخصية مختلفة، والتي هي مهمة لدمراحل ifferent في تنفيذ نتائج هذا الحدث يشير 1،2. ولذلك فمن المهم لمعالجة الديناميات النسخي على الجدول الزمني المفصل الصدغي، وذلك لتحديد المجموعة الكاملة للجينات التي يسببها، واكتساب نظرة ثاقبة وظيفتها المحتملة وفقا لديناميات تحريض بهم.

الإدمان على المخدرات هو شكل قوي من الخبرة التي تعتمد على اللدونة الناجمة عن الآثار طويلة الأمد لتعاطي المخدرات على الدوائر العصبية في الدماغ 5،6. الأولي، والتعرض الحاد للأدوية قد يؤدي إلى تطوير إدمان والانتقال إلى استخدام المزمن. المعلومات السياقية هي عنصر حاسم في تطوير الإدمان. يتم تعيين منبهات البيئية المرتبطة المخدرات أهمية كبيرة في أذهان متعاطي المخدرات. معلومات سياقية تذكير لمتعاطي المخدرات من الخبرة الماضية المخدرات يمكن أن تحدث انتكاسة لحنين المخدرات حتى بعد فترات طويلة من الامتناع عن التعرض للمخدرات 7،8.وبالتالي فإن التحدي الكبير السريرية في الإدمان - الميل المدمنين إلى الانتكاس حتى بعد فترة طويلة من أعراض الانسحاب وقد تراجعت 9.

التوعية السلوكية لالكوكايين هو نموذج بسيط من الخبرة الكوكايين مفيدة في دراسة آليات الإدمان على المخدرات. في هذا النموذج على نطاق واسع درس لتوعية طويلة الأمد الناجمة عن التعرض المزمن لتعاطي المخدرات، واعتادوا القوارض أول من الحقن المالحة (داخل الصفاق، IP) في بيئة جديدة (دائرة مفتوحة في المجال الذي يتم رصد النشاط الحركي لهم) ؛ ثم، فإنهم يتلقون حقن يومية من الكوكايين في غرف الحقل مفتوحة أثناء نشاطهم ويتم رصد 10 (الشكل 1). هذا النموذج السلوكي النتائج عادة في توعية قوية للسلوك الحركي (8-12 أضعاف فوق النشاط الأساسي) 11، الذي يحتفظ به لمدة أشهر بعد التوقف عن حقن الكوكايين، مما يدل على تشكيل بيرفأثر الذاكرة asive من تجربة المخدرات.

الدوائر العصبية الثواب، والمشاركة بشكل طبيعي في تعزيز السلوكيات الأساسية لنجاح أي الأنواع (مثل التغذية والجنس)، واستغلالها من قبل تعاطي المخدرات لتعزيز السلوكيات المرتبطة المخدرات 12،13. ويبدو أن الآليات الجزيئية والخلوية التي يتم من خلالها تعزيز تجربة تعاطي المخدرات لتكون مشابهة إلى الآليات الكامنة وراء تشكيل ذكريات التعريفي أو الدلالي في هياكل الدماغ الأخرى 14. ولذلك، فإن متانة نموذج التوعية السلوكية تجعل من نظام نموذجا جذابا لدراسة آليات تعتمد على خبرة اللدونة.

النواة المتكئة (NAC) هي تكامل المركزي للدائرة الإثابة في الدماغ، وقد ارتبطت بشكل واسع مع تطور إدمان 5،6. تشكيل الإدمان يعتمد على النسخ الجديدة من البروتينات في النواة المتكئة، وقوية فيويلاحظ الدرفلة الجديد من برامج النسخ هيكلة بوضوح في تجربة رنا التالية الكوكايين 15-19. الرد النسخي الحادة للتعرض الكوكايين من المرجح أن تعمل على مستويات متعددة من أجل التكيف مع التحفيز تحريض قوي وتوجيه إنتاج بروتينات جديدة هي المسؤولة عن التغييرات الهيكلية والكهربية الناجمة عن التعرض للدواء 6،19-22.

من أجل تعزيز دراسة الآليات الجزيئية التي تعتمد على خبرة من اللدونة في الدماغ، يوصف بروتوكول لتحليل شامل لديناميات النسخ في عينات أنسجة المخ التالية التلاعب السلوكي. ويتضح البروتوكول في سياق التجربة السلوكية درس في المختبر الدقيقي - التوعية السلوكية على الكوكايين، وذلك باستخدام المصفوفات الحيوية ميكروفلويديك لتحليل النسخي. بروتوكول صفها من الواضح لا تقتصر على دراسة رانه النواة المتكئة في سياق التوعية السلوكية، ولكن يمكن تطبيقها على عدد كبير من النماذج السلوكية ومناطق الدماغ. في الواقع، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لأنسجة الجسم خارج الدماغ، ومجموعة متنوعة من الخبرات أو التلاعب الكائن الحي دراستها.

يتم تقسيم البروتوكول تقريبا إلى أربعة الخطوات. في الخطوة الأولى، يخضع الحيوان إلى النموذج السلوكي. في الخطوة الثانية الأنسجة هي microdissected. في الخطوة الثالثة - يتم تنقيته، عكس كتب مرنا وبحثها، وفي الخطوة الأخيرة يتم تحليل البيانات.

في سياق دراسة ديناميات النسخي، وتوقيت دقيق وتعريف للتجربة وربما المعلمات التجريبية أهم السيطرة عليها. لهذا السبب، النموذج السلوكي لدينا من خيار هو أن من التوعية السلوكية لالكوكايين، وهو النظام الذي يتيح مستوى عال من السيطرة المجرب على مدى المعلمات من بتجاربم. تتوفر النماذج السلوكية الإضافية التي تمكن توقيت دقيق ومعالجة نماذج مختلفة من التي تعتمد على خبرة اللدونة أو تشكيل الذاكرة. وتشمل هذه النماذج تكييف الخوف 23، والإثراء البيئي الحاد 24،25، رواية استكشاف الكائن 26 و تجربة بصرية التالية تربية الظلام 27. لا يزال والتوعية السلوكية لالكوكايين هو التلاعب السلوكي القوي باستمرار، وخلق أثر الذاكرة انتشارا للغاية والتي تستمر لعدة أشهر بعد تجربة الكوكايين 28.

ومقطوع الدماغ، تليها تسليخ مجهري اليدوي النواة المتكئة. لقد كانت تجربتنا أن تسليخ مجهري اليدوي من شرائح الدماغ بسرعة إعداد يوفر الأسلوب الأكثر موثوقية وسرعة استخراج الأنسجة ذات الصلة إلى النموذج السلوكي، وذوي الخبرة، حدود الأنسجة تصبح واضحة ومعترف بها بسهولة. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون شرائح غرامة preparالطبعه، تليها الليزر التقاط تسليخ مجهري. على الرغم من أن هذه الطريقة تمكن محددة للغاية ترسيم المنطقة من اهتمام، أنها بطيئة (وبالتالي المخاطرة بفقدان ومرنا عطوب)، مملة وتتطلب معدات مخصصة مكلفة (المجهر مزودة الإعداد الليزر التقاط). بروتوكول تعريفها هنا يمكن أيضا أن تتكيف مع وحيدة الخلية تحليل النسخي، بواسطة الشفط اليدوي للسيتوبلازم الخلايا التي تم تحديدها بصريا باستخدام ماصات التصحيح 29. من المهم أن نلاحظ أن بروتوكول وصف يوفر المتوسط ​​السكان، في حين أنه من المرجح جدا أنه في معظم الحالات، فقط جزء من السكان من الخلايا داخل الأنسجة وتشارك فعليا في الاستجابة لهذه التجربة. ومن مصلحة لمحة النسخ بطريقة انتقائية من داخل السكان خلية معينة الاستجابة للتجربة، ولكن مناقشة هذه النهج هو أبعد من النطاق الحالي.

لتنقية مرنا، عكس النسخ، وQPCR الاستعلام، والأنسجةتعطل بتمريرها من خلال إبر رفيعة، تليها استخدام مجموعات المتاحة تجاريا (لمزيد من المعلومات، انظر الجدول 8). يتم اختيار من الخبرة مع هذه المنهجيات، والتي تضمن موثوقية استخراج الحمض النووي الريبي عالية الجودة ونتائج قوية من التطبيقات المصب.

بينما يوصف بروتوكول للالإنتاجية العالية QPCR استخدام المصفوفات الحيوية، وعينات يمكن بحثها للتعبير الجينات باستخدام نقطة النهاية PCR، وانخفاض الإنتاجية QPCR، ميكروأرس التعبير الجيني أو تسلسل عميق. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن مرنا تم الحصول عليها من نوى الدماغ التالية النماذج السلوكية في كثير من الأحيان كميات الحد من تفضيل عالية الإنتاجية QPCR استخدام المصفوفات الحيوية. توفر المصفوفات الحيوية منصة تتيح تحليل شامل كفاءة النصوص من عدد كبير من العينات موازية في تجربة واحدة. بعد الاستحواذ الأولي لنظام ميكروفلويديك (عادة إلى بو المؤسسيrchase)، والتجارب غير مكلفة نسبيا لتشغيل. بعد هذا التحليل، مزيد من الاستعلام من العينات يمكن تنفيذها باستخدام منصات أكثر تكلفة للبحث عن نسخ جديدة (عن طريق ميكروأرس أو RNAseq) مع صفائف ديناميكية توفر مرجع شامل لضمان الجودة. أخيرا، لتحليل البيانات، وتستخدم نهج القياسية. مؤشرات محددة بشأن القضايا التي قد تنشأ ستناقش في نص البروتوكول.

هذا البروتوكول هو الأنسب للمحققين المهتمة في إجراء تحقيق شامل في نظام اهتمامهم، ودراسة الظروف ومكررات متعددة. البروتوكول هو أيضا الأنسب للمحققين الذين شحذ بالفعل في (من خلال ميكروأري أو RNAseq التجارب) على مجموعة فرعية من الجينات 50-500 المصالح، التي ترغب في الاستعلام مرارا وتكرارا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من الجامعة العبرية في القدس.

1. إعداد ACSF الحل

  1. إعداد الحل ACSF كما هو موضح في الجدول 1. جعل 1 L في DDH 2 O <(18 MΩ النقاء)، وبذلك الأسمولية إلى ~ 300 الميلي أسمول / L مع اضافة المناسبة من الماء أو كلوريد الصوديوم.

معدات 2. وغرفة اقامة

المعدات اللازمة لرصد السلوك الحركي الناجم عن الكوكايين تتكون من غرف السلوك (50 × 45 سم) السلكية مع الداخلية مصدر ضوء، مروحة والكاميرا (أو أجهزة الاستشعار بالأشعة تحت الحمراء)، ومزودة مربع المقوى الداخلي (30 × 30 سم) في ويسمح فيها الفئران على التحرك بحرية في حين يتم رصد تحرك بهم. يجب أن يتم تنفيذ الاختبار السلوكي بين 1 ساعة بعد أضواء على ل1 ساعة قبل الأنوار، على ضوء / دورة الظلام العادية. ينبغي تدريب الحيوانات على الدوام في نفس الوقت كل يوم.

  1. تنظيف الغرف بعد كل محاكمة بالمطهرات التي تقدمها منشأة الماوس و / أو إزالة الرائحة الكاشف، من أجل منع التحيز جديلة حاسة الشم وضمان التطهير السليم.

هام: أثناء التعامل مع الفئران تكون هادئة، هادئة ومتأنية.

3. إعداد الحيوان

  1. منزل 5 C57BL6 الفئران الذكور (6-12 أسابيع من العمر، ~ 25-35 غرام من الوزن) في القفص في غرفة مع ضوء 12 ساعة / دورة الظلام، وحرية الوصول إلى الغذاء والماء، وفقا لمعايير ومتطلبات الحيوانية المحلية الرعاية توجيه لجنة والبروتوكولات. قبل البدء في التجربة، تزن الفئران وتسجيل البيانات. يدار الكوكايين في وقت لاحق وفقا لوزن الفئران.
  2. نقل جميع الأقفاص التي تحتوي على الفئران في غرفة السلوكي 30 دقيقة قبل البدء في المحاكمة الأولى.
  3. روض جميعالفئران المستخدمة في التجربة إلى المجرب المناولة والحقن والرصد في الإعداد السلوك. ويتحقق هذا عن طريق الحقن داخل الصفاق اليومية 3 متتالية من 250 ميكرولتر المالحة كما هو موضح أدناه.
  4. إدارة حقنة داخل الصفاق من 250 ميكرولتر المالحة. مباشرة بعد الحقن، ضع الماوس في غرفة السلوك لمراقبة النشاط الحركي لمدة 15 دقيقة. كرر هذا الإجراء لمدة 3 أيام متتالية، في نفس الساعة كل يوم.
  5. في اليوم الرابع، تقسيم الفئران إلى مجموعتين. إعداد محلول المخزون من الكوكايين في 2 ملغم / لتر في المياه المالحة. إدارة حقنة واحدة من الكوكايين الحل (النهائي 20 ملغ / كلغ) للمجموعة التجريبية وفقا لوزن الماوس (على سبيل المثال ل25 غ الماوس - حقن 250 ميكرولتر، في حين أن 30 ز الماوس سيتلقى 300 ميكرولتر). إدارة المالحة مع مجموعة التحكم. مباشرة بعد الحقن، ضع الماوس لمدة 20 دقيقة في غرفة السلوك لرصد النشاط الحركي (typicالحليف، يتم رصد 15 دقيقة الأولى).
  6. بعد حقن الكوكايين والتضحية الفئران عند نقاط زمنية مختلفة (0، 1، 2، 4، 8 و 24 ساعة بعد الحقن). الأهم من ذلك، تأكد من أن الفئران المرجعية (0 نقطة زمنية) لن تتلقى أي حقن في هذا اليوم. نظرا لأهميتها، لا بد أن تشمل مكررات للمجموعة المرجعية.

4. تشريح النواة المتكئة

  1. تخدير الفئران مع isoflurane في الوقت المناسب بعد حقن الكوكايين / المالحة. يجب على تنفيس الأيزوفلورين مباشرة خارج الغرفة. ولذلك، يجب أن يتم تنفيذ الإجراء في غطاء الدخان الكيميائي.
  2. رصد عمق التخدير عن طريق اختبار رد الفعل القدم الخلفية. قرصة مخلب للحصول على رد انسحاب الحيوان. الحيوان الذي يظهر رد الفعل ليس على مستوى الجراحية التخدير وليس في حالة الموت ببطء ل.
  3. استخراج الدماغ:
    1. الموت ببطء الماوس عن طريق قطع الرأس.
    2. <لى> إزالة الجلد فوق مركز الجمجمة وقطع الجمجمة مع مقص حاد.
    3. إدراج مقص عند النقطة التي يدخل الحبل الشوكي الدماغ (الثقبة ماغنوم) وجعل اثنين من التخفيضات الجانبية.
    4. من النقطة نفسها، جعل خفض السهمي طويل طول الدرز السهمي. عند الوصول إلى البصلة الشمية، مقطع إلى اليسار وإلى اليمين.
    5. مع ملقط، إزالة الجمجمة بعناية، واستيعاب كل شوط من الجمجمة بحزم وسحب إلى الجانب، مع الحرص على عدم الضغط على أو تلف الدماغ.
    6. إزالة الدماغ بينما قطع الأعصاب القحفية باستخدام مقلوب ملعقة ملعقة الصغيرة.
  4. وضع الدماغ في حل ACSF الجليد الباردة لمدة 1-2 دقيقة إلى فتور وتتصلب.
  5. إزالة الدماغ من ACSF، الفتيل السوائل الزائدة مع منشفة ورقية، وخلق خفض الاكليلية بين المخيخ وبقية الدماغ والغراء الدماغ، مع جزء منقاري تواجه ما يصل، على خشبة المسرح vibratome.
  6. قطع رنا: الحفاظ حلول ACSF في درجات حرارة الجليد الباردة في غرفة تشريح للvibratome. تم تحديد قسم في 200 ميكرون حتى النواة المتكئة (NAC) بوضوح وفقا لPaxinos وفرانكلين ماوس أطلس الدماغ (حوالي 1.8 ملم الأمامي إلى Bregma، وإيلاء الاهتمام لشكل الجسم الثفني، ومكان وشكل الصوار الأمامي و البطينين، فضلا عن التشكل العام للقسم الدماغ). عند هذه النقطة، إنشاء اثنين من 400 ميكرون أقسام، والتي سيتم تشريح رنا.
  7. تحت المجسام، واستخدام شفرة غرامة لتشريح المنطقة رنا الخروج من الشرائح. تعريف رنا هو وفقا لPaxinos وفرانكلين أطلس الماوس الدماغ، ويمكن بسهولة أن تشريح في الأجزاء المناسبة من أربع تمريرات سريعة من النصل على الأنسجة. (الشكل 2).
  8. وضع أقسام رنا فورا في 900 ميكرولتر Trizol كاشف تحلل في أنبوب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى RNA EXTRالعمل.

5. استخراج الحمض النووي الريبي وعكس النسخ [كدنا]

  1. ذوبان الجليد الأنابيب التي تحتوي على النواة المتكئة المقاطع في trizol كاشف تحلل في درجة حرارة الغرفة وتجانس المحللة مع حقنة 1 مل متصلة إبرة 25 G حتى الأنسجة متجانسة تماما (15-20 مرات على الأقل). الجولات القليلة الأولى صعبة، وتحتاج إلى دفع الأنسجة ضد جدار الأنبوب من أجل كسرها إلى قطع صغيرة يمكن أن تدخل رأس الإبرة.
  2. لضمان التجانس، الماصة المحللة في QIAshredder مصغرة عمود الدوران والطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  3. الماصة لالمحللة إلى أنبوب microcentrifuge جديد واستخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. قياس تركيز الحمض النووي الريبي وتحليل سلامة وجودة باستخدام Bioanalyzer المعدات أو ما يعادلها. استخدام 100-500 نانوغرام RNA كل جولة من إعداد [كدنا] مع صandom الاشعال مسدوس.

6. التمهيدي التصميم والاختبار التمهيدي

  1. اختيار الاشعال جيدة: للحصول على زوج التمهيدي الأمثل لQPCR النصوص مرنا، اتبع هذه الاحتياجات (الشكل 3):
    1. الاشعال تصميم لا تحتوي على أطول من 17-28 القواعد. تجنب يكرر النوكليوتيدات كما أنها تعزز mispriming.
    2. الاشعال التصميم مع درجة حرارة انصهار (T م) بين 56-68 مئوية (60-64 الأمثل ° مئوية). يجب أن يكون T م ضمن الزوج التمهيدي في حدود 1 درجة مئوية عن بعضها البعض.
    3. أن ندرك أن حجم المنتج يجب أن يكون مثاليا بين 80 و 150bp.
    4. ضمان واحد على الأقل من الاشعال تغطي تقاطع اكسون-اكسون، أو تحتوي على amplicon على إنترون كبيرة (-إنترون يمتد)، لتجنب التضخيم من الملوثات الحمض النووي الجيني.
    5. استخدام البرمجيات موثوقة استنادا Primer3 (للأمثلة انظر الجدول 2) من أجل تحسين التصميم التمهيدي.
  2. اختبار العلاقات العامةimers: من أجل ضمان خصوصية وكفاءة الاشعال، عنصر تحكم QPCR رد فعل يجب أن يتم تنفيذ:
    1. استخدام العينة الإيجابية (التي تحتوي على قالب [كدنا] لجميع أزواج التمهيدي ذات الصلة) ويعاير [كدنا] (مثل ثمانية التخفيفات ثلاثة أضعاف من التركيز الأولي لل~ 10 نانوغرام) في التفاعلات المتوازية مكررة. تشمل مراقبة أي قالب والذي يسيطر على التلوث ضمن الحلول المستخدمة للتفاعل.
    2. حساب الكفاءة التمهيدي باستخدام الصيغة: (10 (- 1 / المنحدر) -1) × 100، بحيث يكون منحنى المنحدر الأمثل هو - 3.333 (أي 10 (- 1 / 3.333) = 2) (الشكل 4).
    3. تحديد خصوصية التضخيم. ويتجلى التضخيم محددة من ذروة بارزة واحدة مشتركة لجميع منحنيات ذوبان المنتجات تضخيمها، في حين خارج الهدف التضخيم سوف تظهر على أنها انحراف واضح الابام ذروة واحدة كبيرة.

7. تحليل QPCR

  1. قبل التضخيم:
    1. ويستند تحليل شامل عن QPCR الاستعلام مواز للحد من كميات من الحمض النووي الريبي مع عدد كبير من أزواج التمهيدي. لذلك، وهي خطوة من قبل التضخيم أمر ضروري. في هذه الخطوة، [كدنا] يخضع 14-18 دورات من قبل التضخيم مع خليط من جميع الاشعال التي سيتم استخدامها لالاستعلام عن عينة في المستقبل (ما يصل الى 800 أزواج التمهيدي).
    2. تمييع كل الاشعال في TE (منخفض EDTA) إلى 50 ميكرومتر لالتضخيم محددة الهدف (STA).
    3. تجمع معا 1 مكل من كل التمهيدي 50 ميكرومتر تحدد ليتم تضمينها في رد فعل STA، تصل إلى 800 المقايسات.
    4. إعداد قبل المزيج وعينات للSTA كما هو موضح في الجدول رقم 3. السماح للخطأ من خلال إعداد مزيج ل110٪ من عدد العينات التي تحتاج إلى تضخيم.
    5. قسامة 3.75 ميكرولتر STA قبل مزيج لكل عينة. إضافة 1.25 ميكرولتر[كدنا] لكل.
    6. دوامة لخلط ردود الفعل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثانية.
    7. وضع STA ردود الفعل في cycler الحرارية والدورة كما هو مبين في الجدول 4.
  2. نوكلياز خارجية الأول (ExoI) العلاج:
    1. تمييع إكسو أنا كما هو مبين في الجدول رقم 5.
    2. إضافة 2 ميكرولتر من المخفف ExoI (4 U / ميكرولتر) لكل رد فعل STA 5 ميكرولتر، دوامة، وتدور إلى أسفل (> 6،000 x ج) ومكان في cycler الحرارية في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم في 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. تمييع المنتجات النهائية إلى التركيز المناسب للاختبار. استخدام TE العازلة (إضافة 43 ميكرولتر TE العازلة إلى 7 عينة TSA ميكرولتر).
    4. تخزين المنتجات STA المخفف في -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.
  3. الدهان التمهيدي والإعداد العينة لQPCR:
    1. إعداد عينات كما هو مبين في الجدول 6. إعداد مزيج فقا لرقاقة المختارة للتجربة، وإضافة عينات حسب الاقتضاء.
    2. AGIتيت حلول عينة ميكس مدة لا تقل عن 20 ثانية، وأجهزة الطرد المركزي (> 6،000 x ج) لمدة 30 ثانية على الأقل. ردود الفعل مستعدة يمكن تخزينها لفترات قصيرة في 4 درجات مئوية حتى رقاقة جاهز للتحميل.
    3. إعداد المقايسات كما هو موضح في الجدول رقم 7.
    4. تستنهض الهمم والفحص ميكس مدة لا تقل عن 20 ثانية وأجهزة الطرد المركزي (> 6،000 x ج) لمدة 30 ثانية على الأقل تدور أسفل كل المكونات.
      هام: دوامة جيدا والطرد المركزي كل عينة وفحص الحلول قبل pipetting لفي مداخل رقاقة. قد يؤدي عدم القيام بذلك سيؤدي إلى انخفاض في جودة البيانات.
      ملاحظة: تركيز النهائي لكل التمهيدي هو 5 ميكرومتر في مدخل و 500 نانومتر في رد الفعل النهائي.
  4. فتيلة وتحميل صفيف الديناميكي مؤسسة التمويل الدولية (الدوائر المتكاملة الموائعية) رقاقة. رقاقة مؤسسة التمويل الدولية لديها مداخل لعينات وفحوصات، فضلا عن منافذ محددة (بطاريات) للسوائل خط السيطرة (الزيوت المعدنية) كان يضغط غرف ميكروفلويديك (فيقوإعادة 4A).
    1. حقن السائل خط السيطرة في كل تراكم على الرقاقة.
    2. إزالة والتخلص من فيلم واقية زرقاء من أسفل الرقاقة.
    3. وضع رقاقة في وحدة تحكم IFC المناسب (MX تحكم ل48.48 الديناميكية IFC صفيف أو HX تحكم IFC ل96.96 صفيف حيوية IFC)، ثم تشغيل البرنامج النصي رئيس (113x) ل48.48 الديناميكية IFC صفيف أو رئيس (136x) النصي ل96.96 صفيف حيوية مؤسسة التمويل الدولية من أجل رئيس رقاقة.
    4. عند الانتهاء من السيناريو، وإزالة رقاقة معبي من وحدة تحكم IFC.
    5. ماصة 5 ميكرولتر من كل ميكس الفحص و 5 ميكرولتر من كل عينة في مزيج مداخل بهم.
    6. العودة رقاقة إلى وحدة تحكم IFC.
    7. باستخدام برنامج مؤسسة التمويل الدولية تحكم، قم بتشغيل ميكس (113x) النصي لتحميل 48.48 صفيف حيوية IFC) أو تحميل ميكس (136x) النصي للصفيف حيوية 96.96 IFC لتحميل العينات والمقايسات في رقاقة. عند انتهاء البرنامج النصي تحميل ميكس، وإزالة الحملإد رقاقة من وحدة تحكم IFC.
    8. تحميل رقاقة على cycler الحرارية، إنشاء المدى الجديد رقاقة (وفقا لإرشادات الشركة المصنعة)، بما في ذلك تحليل منحنى ذوبان. باستخدام برنامج cycler الحرارية، وضمان أن يتم التعرف على غرف رد فعل صحيح، والسماح للرد فعل لتشغيل على الانتهاء.

تحليل البيانات 8.

  1. ضمان الجودة: من أجل ضمان جودة البيانات، تحقق من نوعية الاشعال من خلال معالجة المنحنيات تخفيف (كما هو موضح أعلاه). مراقبة خصوصية من التضخيم عن طريق عرض منحنيات ذوبان amplicons، قمم النحو الأمثل الذي ينبغي أن تكون محاذاة بإحكام 29.
  2. التصور: التصور لكميات كبيرة من البيانات التي حصلت عليها عالية الخرج QPCR، واستخدام البرمجيات ولدت heatmaps، الذي هو تعبير من شدة مرمزة. بالإضافة إلى ذلك، عرض ديناميكية النسخي الجينات واحدة كما المؤامرات مبعثر اصطف.
  3. نشر: في النشرنتائج التعبير الجيني، ينصح اتباع المبادئ التوجيهية MIQE لنشر الكمية في الوقت الحقيقي PCR التجارب، بالتفصيل الحد الأدنى من المعلومات التي يجب الإبلاغ عن تجربة QPCR لضمان أهميتها ودقتها والتفسير الصحيح، والتكاثر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نوعية النتائج التي تم الحصول عليها من خلال تطبيق هذا البروتوكول يعتمد بشكل حاسم على عدد من المعلمات. والتخطيط السليم التجريبي يؤدي إلى اضطراب الحد الأدنى للفئران التجارب، مثل أن تجربة اختبار (في هذا المثال، أن التعرض للكوكايين) ستكون التجربة الأبرز في تاريخهم الحديث، وبالتالي سيؤدي إلى النسخي قوي ومحدد البرنامج. يصف الشكل 1 الخطة التجريبية لتوعية السلوكية على الكوكايين، وتحديد النقاط الزمنية التالية تجربة الكوكايين الذي النواة المتكئة يتم تشريح من الفئران وتحليلها. النقطة الحاسمة التالية هي أن تحديد حدود دقيقة لاستئصال الأنسجة المناسبة لتحليل الشكل 2 يصف حدود النواة المتكئة في أقسام الاكليلية والسهمي. ويفضل تشريح يجب أن يتم تنفيذ مثل هذا أن هامش رقيقة من الأنسجة رنا يستثنى من المنطقة تاكأون لالتنميط. وهذا يضمن التنميط يتفق فقط من حلف شمال الأطلسي، والحد من التباين إمكانية القطع الأثرية الناتجة عن إدراج الأنسجة المحيطة.

عندما تضخيم الحد من كميات من الحمض النووي الريبي، كما في تشريح نوى الدماغ الصغيرة، والعديد من الدورات من التضخيم ضرورية للكشف السليم للإشارة. بالتالي النقطة الحاسمة في أي تجربة PCR الكمي، مما زاد من تضخيم عند العمل مع كميات صغيرة من المواد ابتداء، هو توصيف الاشعال تستخدم لتضخيم الشكل 3 يصف الملامح الرئيسية في تحديد الاشعال المثلى، ويبين الشكل 4 منحنيات التضخيم من الاشعال الموجهة ضد ج فو وFosB، مما يدل على أن هذه الأزواج التمهيدي تضخيم نسخة هدفهم بكفاءة ~ 100٪ في كل دورة. وبعد التحقق من صحة التمهيدي وإنشاء النموذج التجريبي المناسب لتمكين تقييم واضح من النسخ من TISS الهدفرق، وتحليل شامل يمكن أن يؤديها على منصة Fluidigm Biomark ويمكن ان تصل إلى 9،216 ردود فعل موازية QPCR (في الشكل 96.96. الشكل 5). هذه منصة عالية الإنتاجية تحليل مواز تمكن من التكرار تجريبية متعددة، وذلك باستخدام الظروف التجريبية متطابقة على شريحة واحدة. بيانات عن التكرار التجريبية رباعية، ومعالجة تحريض النسخي من ج فو وFosB التالية تجربة الكوكايين الحادة، وتبين في الشكل 6.

الشكل 1
الرقم 1. التجريبية نموذج للتحليل الديناميكي النسخي التالية تجربة الكوكايين. (A) البروتوكول التجريبي - واعتادوا الفئران لمعالجة وحقن لمدة 3 أيام، في حين رصد النشاط الحركي من خلال تتبع الفيديو في الصوت المخففة غرفة السلوك. الفئرانثم يتعرض لتجربة الكوكايين؛ التعرض مرة واحدة = تجربة الكوكايين الحادة؛ ويطلق على 5 حقن متتالية التعرض المزمن. ويطلق حقنة واحدة بعد ≥16 أيام من الامتناع عن الكوكايين تحديا الكوكايين. وتعالج ديناميات النسخي على مختلف نقاط زمنية التجريبية التالية تجربة الكوكايين (1، 2، 4، 8، 24 ساعة). (B) مؤامرة من المسار الماوس داخل غرفة السلوك التالي 3 أيام من الحقن بالمحلول الملحي أو 3 أيام من المياه المالحة + و واحد التعرض الكوكايين الحاد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الرقم 2. الموقع من النواة المتكئة في مخ الفأر. خطوط بيضاء سميكة تشير إلى موقع تخفيضات تعريف ب oundaries من رنا (A) القسم الاكليل؛ (B) مقطع سهمي. (صور مقتبسة من ألين المخ أطلس المرجعي أطلس الصور: HTTP: //atlas.brain- map.org/atlas؟atlas=1&plate=100960352 ، HTTP: //atlas.brain- map.org/atlas؟atlas=2&plate = 100883869 ). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. الاشعال التخطيط QPCR. المبادئ التوجيهية للتخطيط التمهيدي QPCR، مع التعاريف للخصوصية والاستقرار والتوافق. 2fig3highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. تقييم كفاءة التمهيدي. (A) نتائج منحنيات التضخيم من فوس وFosB باستخدام صفائف Fluidigm مؤسسة التمويل الدولية. تم إنشاء منحنى قياسي باستخدام سبع مسلسل التخفيفات 3 أضعاف من الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من الماوس رنا وبحث للتعبير عن فوس وFosB. (B) تم تقييم كفاءة الزوج التمهيدي للفوس وFosB من قبل المتهم بالتآمر في قيمة عتبة دورة ( ط) في كل تخفيف ضد لوغاريتم التخفيف أضعاف من العينة. يتم حساب كفاءة الاشعال من ميل المنحنى القياسي، على النحو المحدد في النص. منحنيات التضخيم ونقطة على منحنى التخفيف هي مطابقة اللون.51642 / 51642fig4highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. الشامل QPCR التنميط تطبيق منصة Fluidigm. (A) 96.96 صفيف حيوية لمؤسسة التمويل الدولية في الوقت الحقيقي PCR الكمي. يتم تحميل الاشعال في مداخل تقع في الجانب الأيمن، ويتم تحميل العينات في مداخل تقع في الجانب الأيسر من الشريحة. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Fluidigm الوقت الحقيقي تحليل PCR دليل المستخدم. خريطة (B) حرارة النتائج QPCR، تمثل القيم ط م لكل بئر على الرقاقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6. عينة نتائج ديناميات التعبير بعد التعرض الحاد الكوكايين. يتم عرض يسببها الكوكايين التعبير عن ج فو وFosB بوصفها وظيفة من الزمن. متوسطات التكرار التجريبية رباعية، يقوم وفقا لبروتوكول محدد في هذه الوثيقة، يتم عرض، جنبا إلى جنب مع أشرطة الخطأ تصور الخطأ المعياري للمتوسط.

كاشف MW ملي ز / L
كلوريد الصوديوم (سيغما الدريخ، 71376) 58.44 119 6.95
NaHCO 3 (سيغما الدريخ، S6014) 84.01 26 2.18
الجلوكوز (سيغما الدريخ، G8270) 180.16 10 1.8
بوكل (سيغما الدريخ، P9541) د> 74.55 2.5 0.186
ناه 2 ص 4 (سيغما الدريخ، S9638) 137.99 1 0.138
MgSO 4 ⋅7H 2 O (سيغما الدريخ، M1880) 246.5 4 0.99
CaCl 2 (سيغما الدريخ، C3011) 147 4 0.59

الجدول 1. حل ACSF.

اسم البرنامج تطبيق موقع على شبكة الإنترنت
روش Probefinder تصميم الاشعال http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
NCBI التمهيدي الانفجار تصميم الاشعال http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
ve_content "> الجدول 2. قائمة البرامج.

كاشف حجم / رد الفعل (ميكرولتر) حجم ردود الفعل لمدة 48 + 10٪ الفائض (ميكرولتر) حجم ردود الفعل ل96 + 10٪ الفائض (ميكرولتر)
2X TaqMan preamp وميكس ماجستير (النظم البيولوجية التطبيقية) 2.5 132 264
500 نانومتر (10X) تجميع خليط التمهيدي 1 52.8 105.6
المياه 0.25 13.2 26.4
[كدنا] 1.25
إجمالي حجم التداول 5

الجدول 3. STA محلول التفاعل.

حالة عقد 10-14 دورات عقد
درجات الحرارة 95 درجة مئوية 95 درجة مئوية 60 درجة مئوية 4 ºC
الوقت 10 دقيقة ثانية 15 4 دقيقة

الجدول 4. الظروف دورة الحرارية لمرحلة ما قبل التضخيم.

عنصر لكل 5 نموذج ميكرولتر (ميكرولتر) 48 مع عينات أوفيراج (ميكرولتر) 96 عينات مع أوفيراج (ميكرولتر)
المياه 1.4 84 168
نوكلياز خارجية I الاحتياطي الرد 0.2 12 24
أنا نوكلياز خارجية في 20 وحدة / ميكرولتر 0.4 24 48 </ td>
إجمالي حجم التداول 2.0 120 240

الجدول 5. ExoI محلول التفاعل.

<$ / TR>
SAMPLE MIX حجم المكون في مدخل (ميكرولتر) حجم لكل مدخل مع أوفيراج (ميكرولتر) حجم ل48.48 صفيف حيوية IFC (ميكرولتر) (120 عينة) حجم للصفيف حيوية 96.96 IFC (ميكرولتر () 120 عينة)
2X SsoFast EvaGreen Supermix مع انخفاض ROX (بيو راد، PN 172- 5211) 2.5 3 180 360
20X DNA ملزم الكاشف صبغ عينة التحميل (Fluidigm، PN 100- 3738) سقف أخضر 0.25 0.3 18 36
عينة STA وتعامل ExoI 2.25 2.7
إجمالي 5 6

الجدول 6. عينة حل قبل ميكس.

>
عنصر حجم في مدخل (ميكرولتر) حجم لكل مدخل مع أوفيراج (ميكرولتر) حجم ل48.48 صفيف حيوية IFC (ميكرولتر) حجم ل96.96 صفيف حيوية IFC (ميكرولتر)
2X الفحص الكاشف التحميل 2.5 3 180 360
1X العازلة تعليق الحمض النووي (TE المنخفض EDTA) 2 2.4 144 288
50 ميكرومتر كل الأمام المختلط والاشعال عكس 0.5 0.6
إجمالي حجم التداول 5 6

الجدول 7. حل الفحص ميكس.

اسم الكاشف / مواد شركة عدد كتالوج
Virusol Oriek الطبية J29D
الأيزوفلورين، USP 100٪ MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy كيت زائد العالمي البسيطة QIAGENE 73404
QIAshredder QIAGENE 79654
عالية السعة عكس النسخ [كدنا] عدة Invitrogene AB-4368814
TE العازلة Invitrogene 1355656

الجدول 8. قائمة المواد الكيميائية / الكواشف.

ح = "389">
اسم معدات شركة عدد كتالوج
السلوك الغرفة (MDF و 50 × 45 سم) تجميعها النفس
مربع البرسبيكس الداخلي (30 × 30 سم) تجميعها النفس
كاميرا ومسجل فيديو كامبدين انست CMD-80051
البرنامج مسجل وسائل الإعلام Noldus NDS-NMR3-00M
مقص القزحية FST FST-14062-09
Vibratome كامبدين انست. 7000SMZ-2
Bioanalyzer اجيلنت تكنولوجيز وBioanalyzer 2100 اجيلنت
cycler الحرارية الحيوي راد 1852048
ملعقة microspun مقلوب Bochem صك GmbH المزيد 3213
Biomark إعادة HDادير Fluidigm BMHD-BMKHD
رقاقة مجموعة ديناميكية للتعبير الجين 96.96 Fluidigm BMK-M-96.96

الجدول 9. قائمة المعدات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توصيف ناجح في التعبير الجيني من أنسجة المخ التالية النماذج السلوكية يعتمد على: 1) التعامل مع الحذر من الفئران خلال النموذج السلوكي. 2) تشريح سريع ودقيق للأنسجة المصالح؛ 3) تدابير RNA آمن لضمان سلامة RNA. و4) التخطيط الدقيق الاشعال وتخطيط التجريبي وكذلك الدقة والاهتمام بالتفاصيل في التحضير للتحليل QPCR.

الهدف من الإجراء هو وصف لوصف ديناميات الأحداث النسخي الناجم عن تجربة السلوكية. لذا الاهتمام الدقيق ضروري لضمان أن النموذج السلوكي التي يمر بها الماوس يمثل في الواقع تجربة المقصود من قبل الباحث. على سبيل المثال، حتى في مثل نموذج بسيط عن التوعية السلوكية لالكوكايين، يمكن أن تتأثر تجربة الماوس عن طريق العديد من العوامل المربكة: تجربة مسبقة من الماوس في قفص المنزل قبل السابقينملصقة. طريقة نقل إلى غرفة التجريبية. التعرض للضوء والصوت والرائحة في غرفة تجريبية. تجربة المناولة من قبل المجرب. الألم / الانزعاج الناجم عن حقن الملكية الفكرية؛ التعرض لتجربة جديدة، وتجربة التالي سلوك محدد يصل إلى درجة القتل الرحيم. يجوز لكل واحد من هذه التجارب، في العزلة، وتعزيز تحريض برامج النسخ في مناطق الدماغ المختلفة من الفأرة. لذا، يجب توخي الحذر لضمان أن البرنامج النسخي يقيس النموذج المطلوب، وليس مرتبطا epiphenomena مع النموذج. في حالة تجربة الكوكايين، وهذا يتحقق بسهولة عن طريق التجريب الدقيق والاهتمام بالتفاصيل، وكذلك تجربة تحكم بسيطة، حيث يتم الحفاظ على جميع المعلمات المستمر، ولكن سيارة (المالحة) يتم حقن على الماوس بدلا من الكوكايين. في تجربتنا، وحقن المالحة يدفع برنامج النسخي على نطاق محدود جدا بالمقارنة معتعرض الكوكايين، مما يدل على أن النموذج تمكن ساحقة التحقيق في الظواهر المثيرة للاهتمام.

وينبغي إيلاء عناية قصوى للحد من مجموعة من الخبرات من الفأرة حين انها لا تزال نشطة، مما يستلزم معالجة هادئة ومتأنية من الفئران. في المقابل، وبعد التخدير، والعمل السريع والدقيق أمر ضروري نظرا لاحتمال التغيرات السريعة في تمثيل RNA (على الجدول الزمني دقائق) وتقلقل لا يتجزأ من الحمض النووي الريبي، والتي يمكن أن يتحلل سريعا بمجرد تعطل الخلايا، ويحتمل تعطيل النسخي الناجمة عن الخبرة. ولذلك فمن المهم لإزالة الدماغ من الجمجمة بسرعة إلى بيئة المبرد (في غضون 1-2 دقيقة) وبسرعة تشريح رنا في ظروف الجليد الباردة. بمجرد المبردة الدماغ، وتخفض من احتمالات التغييرات النسخي أو RNA تدهور بشكل ملحوظ، ولكن فقط عندما يتم وضع الأقسام ذات الصلة في trizol الكاشف وتجميد، طق ضمنت سلامة الأنسجة وتمثيل النسخي.

في هذا السياق، من الجدير بالذكر أن ديناميات النسخي فوري في وقت مبكر من التعبير الجيني يحدث على نطاق والوقت السريع، وغالبا ما تبلغ ذروتها قبل 1 ساعة بعد التحفيز. في سياق النموذج التجريبي وصفها، استجواب ديناميات النسخي يقتصر على نطاق وساعات من أجل الحد من التباين بين العينات. للمرة أقصر من 1 ساعة، يمكن أن الاختلافات الصغيرة في توقيت يؤدي إلى تفاوت كبير في حجم التغييرات النسخي ملاحظتها. ولذلك فقد تم اختيار نقطة زمنية 1 ساعة لتحليلها، حيث أن هذه هي نقطة زمنية تجريبيا أسهل لأداء بدقة، وأقل عرضة للتباين على مستوى فرق دقائق قليلة في التجربة.

تقليديا، تم استخدام micropunch الأنسجة من قبل العديد من مختبرات للتشريح عينات الأنسجة. هناكهناك عدد من الأسباب لتفضيل تسليخ مجهري اليدوي للأنسجة. عادة يتم إجراء كمة من الفولاذ المقاوم للصدأ وغير شفافة. وبالتالي تحديد المواقع لكمة في موقع دقيق وثابت يمكن أن تكون خادعة. وعلاوة على ذلك، لا يسمح لكمة أي تصحيح لبذل إذا كان هناك خطأ في تحديد المواقع الأولي. أخيرا، يمكن استخراج أنسجة من داخل لكمة يثبت أحيانا صعبة، وهناك احتمال لفقدان الأنسجة، أو ترحيل بين العينات. تسليخ مجهري للأنسجة باستخدام مشرط غرامة يمكن المجرب تحكم أكثر دقة ويوفر الأمن فيما يتعلق نقاء العينات.

أثناء استخراج الحمض النووي الريبي والتوليف حتى كدنا]، تحتاج بيئة العمل إلى أن تبقى خالية من مصادر الملوثات ريبونوكلياز، ويجب أن يتم تنفيذ العمل باستخدام ريبونوكلياز تحصل على أدوات مجانية والمستهلكات والكواشف. في هذه المرحلة، يمكن للتلوث أصغر الفاسدين بسهولة بشق الانفس عينات الحمض النووي الريبي. حفظ العينات طم البرد أمر حاسم للحد من النشاط العصبي التي يمكن تعديل قراءات النسخي، وكذلك للحد من النشاط الأنزيمي والتي قد تؤثر على سلامة العينة. يتم إضافة مثبطات الدوائية إضافية في بعض الأحيان للحد من استثارة العصبية، ولكن غالبا ما تكون هذه ليست أساسية.

بعد النسخ العكسي ل[كدنا]، يتحول التركيز إلى ضمان صحة النتائج التي تم الحصول عليها من التنميط شاملة من النصوص. وتتمثل الخطوة الأولى لضمان الاشعال QPCR المناسبة تستخدم، والتي ينصح بشدة لاختبار كفاءة التمهيدي وخصوصية على المنحنيات التخفيف من مصدر محددة من الحمض النووي الريبي. توفر الاشعال PCR الأمثل التضخيم محددة وفعالة من الهدف. التضخيم محددة يعني أن التضخيم هو فقط من تسلسل الهدف، كما يتضح ذروة منفصلة واحدة في تحليل منحنى الذوبان، بينما يعني التضخيم كفاءة أنه في كل دورة، وكمية من تسلسل المستهدفة هيتتكرر، مع كفاءة تقارب 100٪. نظرا لطبيعة الإنتاجية العالية من QPCR رقائق ميكروفلويديك، هذه التجارب تتطلب التخطيط الدقيق لضمان إدراج عدد كبير من الضوابط الإيجابية والسلبية. فمن الأفضل أن تشمل ضوابط متسقة في كل شوط رقاقة، مما يتيح المقارنة المباشرة للنتائج من السيطرة والظروف التجريبية. أثناء الإعداد للتجربة، من الأهمية بمكان ألا عبر تلويث الآبار. منذ كمية ضئيلة من الاشعال في البئر خطأ قد يتسبب في التضخيم من الهدف غير المرغوب فيه، وينبغي اتخاذ مزيد من الحذر عند pipetting لالاشعال.

بالنسبة لمعظم عينات الأنسجة من المخ فمن الصعب أن تكون على يقين أنه خلال تشريح تم استخراج فقط الأنسجة من الاهتمام، مع عدم وجود تلوث من مناطق الدماغ غير ذات صلة، والتي يمكن أن يتغلب على تحليل النتائج. ولهذه الغاية، عنصر تحكم الهامة وسبر للجينات ومن المتوقع التعبير الذي سيتم استبعادها منالأنسجة من الاهتمام. وهناك أداة مفيدة لتحديد الأنماط المكانية في التعبير الجيني هو ألين المخ أطلس ( http://www.brain-map.org/ ).

في حين مناقشة مستفيضة لتحليل البيانات هي خارج نطاق هذا المنشور، فإنه تجدر الإشارة إلى أن مذكرات التجريب متأنية تحليل دقيق. فمن المهم لضمان أن عددا من الجينات المرجعية ذات الصلة مدرجة في كل جولة من QPCR. سوف تخدم هذه الجينات للتطبيع من أجل ضمان أن كميات مماثلة من الحمض النووي الريبي يجري يعاير. يتم تنفيذ التطبيع الأول إلى جينات مرجعية داخل العينة، ومن ثم إلى إشارة الفئران للتجربة ("الوقت 0")، تطبيق "طريقة ΔΔCt".

ويهدف البروتوكول وصفها في هذه المخطوطة إلى دراسة ديناميات النسخي التالية تجربة الكوكايين في النواة المتكئة من الفئران. ومع ذلك، فمن السهل جدا adapteد لدراسة أي تجربة أخرى من الفأرة، طالما يتم تنفيذ ضوابط سليمة، وتوقيت تجربة واضحة المعالم. من الواضح، ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذا البروتوكول لدراسة ديناميات النسخ في أنسجة خارج الجهاز العصبي أيضا.

وينبغي التأكيد على أن النسخي شامل باستخدام QPCR استنادا ميكروفلويديك هو طريقة فعالة من حيث التكلفة من التنميط الأحداث النسخي، ولكن يعتمد على معرفة مسبقة من الجينات المستهدفة من الفائدة. ويتم الحصول على هذه العادة من خلال أساليب التنميط مشاركات ومثل ميكروأرس وتسلسل عميق. لذلك، في سير العمل لمشروع كبير، يمكن أن التنميط QPCR شامل يوفر الجزء الأكبر من البيانات، ولكن يجب أن يتبعوا تفضيلي توصيف مسبق متحيز للنظام.

ومن الجدير مشيرا إلى أن العملية الموضحة في هذه الوثيقة للحصول على عينات من الأنسجة ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ نحو الدراسةجي مجموعة متنوعة من غيرها من الأحداث الخلوية - البروتينات والتعديلات البروتين، الايض، lipidomics وعلامات جينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Virusol Oriek Medical J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit QIAGEN 73404
QIAshredder QIAGEN 79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit Invitrogen AB-4368814
TE Buffer Invitrogen 1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm) Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm) Self assembled
Camera and video recorder Campden Inst. CMD-80051
Media Recorder software Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Scissors FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler Bio-Rad 1852048
Inverted microspoon spatula Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD Reader Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression Fluidigm BMK-M-96.96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amit, I., et al. A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling. Nature genetics. 39, 503-512 (2007).
  2. Citri, A., Yarden, Y. EGF-ERBB signalling: towards the systems level. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).
  3. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  4. Kleim, J. A., Jones, T. A. Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage. Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).
  5. Kauer, J. A., Malenka, R. C. Synaptic plasticity and addiction. Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).
  6. Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction. Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).
  7. Robinson, T. E., Kolb, B. Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse. Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).
  8. Koob, G. F., et al. Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence. Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).
  9. Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).
  10. Beurrier, C., Malenka, R. C. Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine. The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).
  11. Robinson, T. E., Berridge, K. C. The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view. Addiction. 95, Suppl 2. S91-S117 (2000).
  12. Boening, J. A. Neurobiology of an addiction memory. Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).
  13. Everitt, B. J., Robbins, T. W. Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion. Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).
  14. Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. The addicted human brain: insights from imaging studies. The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).
  15. Carlezon, W. A. Jr, et al. Regulation of cocaine reward by CREB. Science. 282, 2272-2275 (1998).
  16. Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).
  17. Hope, B. T., et al. Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments. Neuron. 13, 1235-1244 (1994).
  18. Pulipparacharuvil, S., et al. Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity. Neuron. 59, 621-633 (2008).
  19. Robison, A. J., Nestler, E. J. Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction. Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).
  20. Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence. Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).
  21. Nestler, E. J. The neurobiology of cocaine addiction. Science & practice perspectives / a publication of the. National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).
  22. Robbins, T. W., Everitt, B. J. Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation. Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).
  23. Kaplan, G. B., Moore, K. A. The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction. Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).
  24. Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving. Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).
  25. Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
  26. Silingardi, D., et al. ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex. Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84 (2011).
  27. Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex. The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).
  28. Steketee, J. D., Kalivas, P. W. Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior. Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).
  29. Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells. Nature protocols. 7, 118-127 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics