行動経験に続いて脳試料からの転写動態の網羅的解析

Behavior

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Turm, H., Mukherjee, D., Haritan, D., Tahor, M., Citri, A. Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience. J. Vis. Exp. (90), e51642, doi:10.3791/51642 (2014).

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Abstract

脳と長期記憶の統合の経験の符号化は、遺伝子転写に依存する。経験をコード内の特定の遺伝子の機能を同定することは、分子神経科学の主な目的の一つである。さらに、特定の動作で定義された遺伝子の機能的関連は、精神神経疾患の基礎を理解するための意味を持っている。堅牢な転写プログラムの誘導は、さまざまな行動の操作後のマウスの脳で観察されている。いくつかの遺伝的要素が異なる行動の操作に従い、異なる脳核内に再帰的に利用されているが、転写プログラムは、全体的な誘導の刺激、彼らは1,2を研究されている構造に固有のものです。

この公報では、プロトコルは、行動操作に応じてマウスの脳の核から、堅牢で包括的な転写プロファイリングに記載されている。ザ·プロトコルは、急性コカイン経験以下の側坐核における遺伝子発現動態の分析の文脈において明らかにされる。 生体内での経験定義されているに続いて、標的神経組織が ​​解剖されている。 RNA精製に続いて​​、複数の標的遺伝子の総合的なqPCR分析のためのマイクロ流体アレイの転写と使用率を反転させます。このプロトコルは、このような小さな脳試料または単一の細胞のような出発物質の制限量を総合的に分析(50〜500の遺伝子をアドレッシング)を目指している。

プロトコルは、複数のサンプルの平行分析( 例えば単一細胞、製薬以下動的解析、ウイルスまたは行動摂動)が最も有利で ​​ある。ただし、プロトコルは、マイクロアレイまたはRNAseqによって全ゲノムの研究の前に、サンプルの特性評価および品質保証のために役立つだけでなく、全ゲノム研究から得られたデータの検証ができた。

Introduction

脳の動的な組織は、認知および行動の柔軟性を可能にします。経験は、脳3のニューロン間の接続の構造や強度の修飾を通してエンコードされます。この「経験依存可塑性」とは、シナプスの構造と強度4の修正のために必要なタンパク質を提供する遺伝子発現の特定のパターンの誘導の結果である。長期的な記憶の形成を仲介する遺伝子調節ネットワークの同定は、転写プログラムの主要な要素の識別のための記憶形成だけでなく、目標を規制する基本原則への洞察を提供することを期待して、分子神経科学の中心的信条です神経変性および神経精神障害の治療。転写プログラムは、Dのために重要である別の文字の遺伝子をコードし、それぞれが、時間的に定義された波のように展開シグナリング事象1,2の結果の実装にifferent段階。それは、誘発された遺伝子の完全な補完を識別し、それらの誘導の動態に応じてそれらの潜在的な機能への洞察を得るように、詳細な時間的な時間スケールでの転写ダイナミクスに対処することが重要である。

薬物中毒は脳の5,6における神経回路上の乱用薬物の長期的な効果によって引き起こされる経験依存可塑性の堅牢な形式です。薬への初期、急性暴露は、中毒の開発および慢性使用への移行につながる可能性がある。コンテキスト情報は、依存症の発達における重要な要素である。医薬品関連の環境手がかりは、薬物乱用者の心の中の重要な重要性が割り当てられます。過去の薬物経験の薬物乱用者に思い出させるコンテキスト情報があっても薬物暴露7,8から禁欲長期間以下の薬物渇望に再発を誘導することができる。したがって中毒に大きな臨床上の挑戦-禁断症状が9沈静化した後、中毒者の傾向があっても、長い再発する。

コカインへの行動感作は、薬物中毒のメカニズムの研究に有用コカインの経験を単純なモデルである。乱用薬物への慢性曝露によって誘発される長期的な感作のためのこの広く研究されたモデルでは、げっ歯類は、まず生理食塩水の注射(腹腔内; IP)に慣らしている小説の環境で(彼らの自発運動を監視されているオープンフィールドチャンバー) ;彼らの活動は10( 図1)をモニタしながら、その後、彼らはオープンフィールドチャンバー内のコカインの毎日の注射を受ける。この行動パラダイムは、典型的には、PERVの形成を示す、コカイン注射の停止を以下ヶ月間維持され、11(ベースライン活性を上記の8〜12倍)運動行動の堅牢感をもたらす薬物経験のasive記憶痕跡。

自然種( 例えば摂食、性別)の成功に不可欠な行動を強化にかかわる報酬の神経回路は、薬物関連行動12,13を補強するために乱用薬物によって利用されている。乱用薬物の経験が増強されることにより、分子·細胞メカニズムは、他の脳構造14内の宣言型または意味記憶の形成のメカニズムと類似していると思われる。そのため、行動感モデルの頑健性は経験依存可塑性のメカニズムを研究するための魅力的なモデル系になります。

側坐核(NAC)は、脳の報酬回路の中心積分器であり、広く中毒5,6の発症と関連している。中毒の形成は、側坐核における新規タンパク質の転写に依存し、ロバスト明確に構造化転写プログラムの生産は、コカインの経験15-19以下の側坐核において観察されるコカイン曝露に対する急性転写応答が強い誘導刺激に適応する、新たなタンパク質の産生を指示するために、複数のレベルで機能する可能性が高いこと薬剤6,19-22への曝露によって誘発される構造的および電気生理学的変化の原因である

脳における経験依存的可塑性の分子機構の研究を促進するために、プロトコルは、行動操作後の脳組織試料中の転写動態の包括的な分析のために記載されている。転写分析のためのマイクロ流体動的配列を用いて、コカインに対する行動感作 - プロトコルはミカンハダニ室で研究された行動の経験と関連して示されている。記載されているプロトコルは明らかにトンを研究に限定されるものではない彼は、行動感作のコンテキストで側坐核の核が、行動パラダイムと脳の多数の領域に適用することができる。実際に、このプロトコルは、脳の外側の身体組織に適用することができ、経験または生物の操作のさまざまな検討を行った。

プロトコルは、大きく4つの段階に分けられる。最初のステップでは、動物は、行動パラダイムに供される。第二工程において組織顕微解剖され;第三工程で - mRNAは、逆転写及びプローブし、精製し、そして最終工程でデータが分析される。

転写ダイナミクスを研究の文脈では、経験の正確なタイミングと定義は、おそらくコントロールする最も重要な実験パラメータである。このため、選択した私達の行動モデルは、の体験のパラメータに対する実験者の高レベルの制御を可能にするシステム、コカインに対する行動感作のものであるCE。経験依存可塑性や記憶形成の異なるモデルを正確なタイミングを有効にして対処する追加の行動パラダイムを利用できます。これらのモデルは、恐怖条件付け23、急性環境エンリッチメント24,25、新規オブジェクトの探査26と暗い飼育27以下の視覚体験が含まれています。それでも、コカインに対する行動感作は、コカインの経験28を次の数ヶ月続く非常に普及したメモリ·トレースの作成 ​​、一貫して強固な行動操作である。

脳は、側坐核の手動マイクロダイセクションが続き、区分されている。これは、急速に準備脳スライスからの手動マイクロダイセクションは、行動パラダイムに関連する組織を抽出する最も信頼性が高く迅速な方法を提供することが私たちの経験をされており、経験を、組織の境界が明らかになり、容易に認識した。代わりに、細かいスライスがprepar可能性レーザーキャプチャーマイクロダイセクションが続く編、。この方法は、関心領域の高度に規定された描写を可能にしますが、それは、(このように不安定なmRNAの損失を危険にさらして)遅く面倒でコストのかかる専用の機器(レーザーキャプチャーセットアップを装着し、顕微鏡)が必要です。ここに定義されたプロトコルはまた、パッチピペット29を使用して視覚的に同定された細胞の細胞質の手動吸引によって、単一細胞の転写分析に適合させることができる。それはほとんどの場合、組織内の細胞の亜集団のみが実際に経験に応答に関与している可能性が高いものの、記述されたプロトコルは、母集団平均を提供することに留意することが重要である。それは経験に応答する特定の細胞集団の中から選択的に転写をプロファイリングすることが重要であるが、これらのアプローチの議論は、現在の範囲を超えています。

mRNA精製のために、逆転写および定量PCR照会、組織を市販のキットを利用して、その後細い針、を通過させることにより破壊されている(詳細については、 表8を参照)。選択は、高品質のRNAと下流のアプリケーションから堅固な成果を保証抽出を確実にこれらの方法論、経験によって通知される。

プロトコルは、動的配列を用いたハイスループット定量PCRのために記載されているが、サンプルがエンドポイントPCR、低スループット定量PCR、遺伝子発現マイクロアレイまたは深いシーケンシングを使用して遺伝子発現についてプローブすることができる。ハイスループットqPCRには、動的配列を利用するための好みは、mRNAが行動パラダイムに従うことは、多くの場合、制限量のある脳核から得ているという事実によるものである。動的配列は、単一の実験で並列多数のサンプルからの転写物の効率的な総合的な分析を可能にするプラットフォームを提供します。マイクロ流体システム(一般機関投資PUの初期捕捉した後、rchase)、実験は実行することが比較的安価である。この分析に続いて、試料の更なる問い合わせは、品質保証のための総合的なリファレンスを提供する動的な配列で(マイクロアレイまたはRNAseqによって)は、新規転写産物を検索するために、より高価なプラットフォームを使用して実行することができた。最後に、データ分析のために、標準的なアプローチが利用される。発生する可能性がある問題について具体的なポインタはプロトコルの文章で説明します。

このプロトコルは、複数の条件との複製を研究、関心のある彼らのシステムの徹底的な調査に興味を持って研究者のために最も適しています。プロトコルは、すでに彼らは繰り返しクエリするに興味を持っている関心のある50〜500の遺伝子のサブセット(マイクロアレイまたはRNAseq実験により)で磨いてきた研究者に最適です。

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Protocol

注:プロトコルは、エルサレムのヘブライ大学の動物ケアのガイドラインに従っています。

ACSF溶液の調製

  1. 適切な水の添加またはNaClで〜300mOsmで/ Lに浸透圧をもたらし、 表1に記載したように、OのddH 2で1リットルを加えます。ACSF溶液を調製(> 18MΩ純度)。

2。機器とルームセットアップ

コカイン誘発自発運動行動の監視のための装置は、内部光源、ファンとカメラ(または赤外線センサ)で配線行動チャンバー(50×45センチ)で構成され、内側のパースペックスボックス(30×30cm)に中を搭載そのマウスは、それらの運動を監視しながら自由に移動することができる。行動試験は、通常の明/暗サイクルで、ライトの前に1時間に上のライトの後に1時間の間オフに実行する必要があります。動物は、毎日同じ時間に一貫して訓練されるべきである。

  1. 嗅覚キュー偏りを防ぐために、適切な消毒を確実にするために、マウス機能、および/または臭気の除去試薬が提供する消毒剤と各試行の後にチャンバーを清掃してください。

重要:取り扱い中にマウスは、静かで穏やかで、注意してください。

3動物の準備

  1. ハウス5 C57BL6雄マウス;規格や地元の動物の要件に応じて12時間の明/暗サイクルと食料と水を自由に部屋の中でケージ当たり(6-12週齢体重〜25〜35グラム)、、委員会の指導とプロトコルをケア。実験を開始する前に、マウスを計量し、データを記録します。コカインは、後にマウスの体重に応じて投与される。
  2. 最初のトライアルを開始する前に、行動の部屋に30分マウスを含むすべてのケージを転送します。
  3. すべてを慣らす実験に用いたマウスは、注射剤の取り扱いや行動のセットアップで監視する実験者。以下に説明するようにこれを250μlの生理食塩水の3つの連続した​​毎日の腹腔内注射によって達成される。
  4. 250μlの生理食塩水の腹腔内注射を管理します。すぐに注射した後、15分間の運動活性を監視するために行動チャンバー内にマウスを置きます。毎日同じ時間に、3日間連続してこのアクションを繰り返します。
  5. 4日目に、二つのグループにマウスを分ける。生理食塩水中の2mg / mlでコカインの原液を準備します。 ( - 30グラムのマウスが300μlのを受け取るのに対し、250μlのを注入する25グラムのマウス用など )、マウスの重量に応じて実験群にコカイン溶液(最終的に20mg / kg)を単回注射を管理します。対照群には生理食塩水を管理します。すぐに注射後、自発運動のモニタリング(typicための行動チャンバー内で20分間、マウスを置き同盟国は、最初の15分)を監視されている。
  6. コカイン注射の後、異なる時点(注射後0、1、2、4、8および24時間)で、マウスを屠殺。重要なことは、参照マウス(0時点)はこの日のいずれかの注射を受けることはありませんことを確認してください。 、その重要性は、参照グループの反復を含むことが必須である。

側坐核の4解剖

  1. コカイン/生理食塩水注射後の適当な時間にイソフルランでマウスを麻酔。イソフルランは、直接部屋から排気されなければならない。したがって、この手順は、化学ドラフト内で行われるべきである。
  2. 後足反射をテストすることによって麻酔深度を監視します。動物が引っ込め反応を誘発するために足をつまむ。反射を示している動物は、麻酔の外科的レベルではなく、安楽死させる状態ではありません。
  3. 脳の抽出:
    1. 断頭によりマウスを安楽死させる。
    2. <李>頭蓋骨の中心より肌を削除し、鋭いハサミで頭蓋骨を切った。
    3. 脊髄は、脳(大後頭孔)に入る時点でのはさみを挿入し、2本の横方向のカットを行う。
    4. 同じ観点から、矢状縫合に沿って長い矢状カットをする。嗅球に到達すると、左に右にクリップ。
    5. 鉗子を使用すると、しっかりと頭蓋骨の各半分を把握し、側に引いて、上に押すか、脳に損傷を与えないように注意しながら、慎重に頭蓋骨を削除します。
    6. 反転したマイクロスプーンへらを使って、脳神経を切断しながら、脳を除去します。
  4. 寒さと硬化する1〜2分間、氷冷ACSF溶液中で脳を置きます。
  5. ビブラトームステージに、ACSFから脳を取り外し、ペーパータオルで余分な水分を吸い上げ、小脳と脳の他の部分との間に冠状カットを作成して、脳を接着、上に向けて頭側の部分と。
  6. NACを切削: ビブラトームのスライスチャンバー内の氷のように冷たい温度でのACSFのソリューションを維持します。側坐核(NAC)まで、200μmの時のセクションが明確にパクシーノスフランクリンマウス脳アトラス(ブレグマから約1.8ミリメートルの前方に応じて識別され、脳梁、前交連の位置や形状の形状に注意を払い、心室だけでなく、脳切片の全体的な形態)。この時点では、NACは解剖され、そこから2400μmのセクションを作成します。
  7. ステレオスコープの下では、スライスから側坐核領域を切開する細かい刃を使用しています。側坐核の定義はパクシーノスフランクリンマウス脳アトラスに応じており、便利に組織上のブレードの4素早いパスで適切なセクションで解剖することができた。 ( 図2)。
  8. RNA EXTRまで-80℃でマイクロチューブや店舗で900μlのトリゾール溶解試薬ですぐに側坐核セクションを配置アクション。

5。RNA抽出およびcDNA逆転写

  1. 核を含むチューブは、室温でトリゾール溶解試薬のセクションを側坐核解凍し、組織が完全に均質化された(少なくとも15〜20倍)になるまで、25 G針に接続された1mlシリンジでライセートをホモジナイズする。最初の数ラウンドは困難であり、針の先端に入ることができる小さな断片にそれを打破するために、管の壁に対して組織を押して必要とする。
  2. 均質化を確実にするために、1分間12,000×gでQIA​​シュレッダーミニスピンカラムや遠心にライセートをピペット。
  3. ピペットでライセートを新しいマイクロチューブに、製造業者の指示に従ってRNAを抽出。使用するまで-80℃でRNAを保存してください。
  4. 、RNA濃度を測定するバイオアナライザまたは同等の装置を使用して整合性と品質を分析。 rのcDNA調製の各ラウンドのために100〜500 ngのRNAを使用してくださいandomのヘキサマープライマー。

6。プライマーデザインとプライマーのテスト

  1. mRNA転写物の定量PCRに最適なプライマー対は、( 図3)、これらの要件は、次のとおりです。良いプライマーの選択:
    1. デザインプライマーはもはや17-28塩基よりも含有していない。彼らはミスプライミングを促進するようにヌクレオチド反復を避けてください。
    2. 56-68°C(最適には60〜64℃)の間の融解温度(T m)を有する設計プライマー。プライマーペア内のT mは 、互いに1℃以内であるべきである。
    3. 製品サイズは、理想的には80〜150bpの間であるべきであることに注意してください。
    4. ゲノムDNAの汚染物質の増幅を避けるために、プライマーの少なくとも一つは、エクソン - エクソンジャンクショ​​ンをカバーしたり、アンプリコンは、大きなイントロン(イントロンスパニング)が含まれていることを確認してください。
    5. プライマーの設計を改善するために、(例については、表2を参照)プライマー3に基づいて信頼性の高いソフトウェアを使用してください。
  2. 広報のテストimers:プライマーの特異性および効率性を確保するために、制御のqPCR反応は行われるべきである。
    1. (関連するすべてのプライマー対のためのcDNAテンプレートを含む)は、正のサンプルを使用してcDNAを滴定( 例えば 、10 ngの〜の初期濃度からの8つの3倍希釈)、重複する並列反応で。反応に使用される溶液内の汚染のために制御し、無鋳型対照を含めます。
    2. 式を使用して、プライマー効率を計算する:(10( - 1 /勾配)-1)×100、最適な傾きの曲線となるように- 3.333( すなわち 、10(1 - / 3.333)= 2)( 図4)。
    3. 増幅の特異性を決定します。オフターゲット増幅が明らかな偏差frのように表示されます。一方、具体的な増幅は、増幅産物のすべての融解曲線に共通の単一の顕著なピークによって実証される単一の大きなピークがオム。

7 qPCR分析

  1. プリ増幅:
    1. 総合的qPCR分析は、プライマー対の多数のRNAの量を制限する並列クエリに基づいている。したがって、前増幅ステップが不可欠である。このステップでは、cDNAは、(800プライマー対まで)将来のサンプルを照会するために利用されるすべてのプライマーの混合物で予備増幅の14-18サイクルを受ける。
    2. 特定標的増幅(STA)のために50μMのTE(低いEDTA)内のすべてのプライマーを希釈する。
    3. プールは一緒に、50μMのプライマーの全てを1μlを800アッセイまで、STA反応に含まれるように設定します。
    4. 表3に記載したようにSTAのためのプレミックス及び試料を調製する。増幅される必要があるサンプル数の110%用のミックスを調製することにより、エラーを許可。
    5. 各サンプルのアリコート3.75μlのSTAプレミックス。 1.25μl添加各cDNAの。
    6. 10秒間の反応および遠心分離機を混合する渦。
    7. 表4に示されるように、サーマルサイクラーとサイクルのSTA反応を置きます。
  2. エキソヌクレアーゼI(ExoI)処理:
    1. 表5に示されるように、エキソIを希釈する。
    2. 各5μlのSTA反応に希釈しExoI(4 U /μl)を2μl加え、ボルテックス、スピンダウン(> 6,000×g)で、サーマルサイクラー内の場所37 °Cで30分間、次いで15分間80℃にて。
    3. テストのために適切な濃度に最終製品を希釈する。利用TEバッファー(7μlのTSAサンプルに43μlのTEバッファーを追加)。
    4. -20℃で希釈されたSTAの製品を保管したり、すぐに使用しています。
  3. 定量PCR用のプライマーとサンプルの設定:
    1. 表6に示すようにサンプルを調製します。実験のために選択されたチップに応じてミックスを調製し、必要に応じてサンプルを追加します。
    2. 阿木20秒以上のサンプルミックス·ソリューションをTATEと、少なくとも30秒間遠心(> 6,000×g)で。チップがローディングのための準備ができるまで準備反応は、4℃で短期間保存することができる。
    3. 表7に記載されるようなアッセイを準備します。
    4. すべてのコンポーネントをスピンダウンするために、少なくとも30秒間(> 6,000×g)で20秒遠心最低アッセイミックスを攪拌。
      重要:徹底的にボルテックスし、遠心分離チップインレットにピペッティングする前に、すべてのサンプルおよびアッセイ溶液は。そうしないと、データ品質の低下をもたらし得る。
      注:各プライマーの最終濃度は、入口において、5μM及び最終反応における500nmである。
  4. プライミングおよび動的配列IFC(集積流体回路)チップのロード。 IFCチップ( ふぃぎゅのマイクロ流体チャンバを加圧するために使用される制御線液(鉱油)のためのサンプルおよびアッセイのための入口、ならびに指定された注入口(アキュムレータ)を有している)4A再。
    1. チップ上の各アキュムレータに制御線流体を注入します。
    2. チップの下から青い保護フィルムを取り外し、廃棄します。
    3. 適切なIFCコントローラー(48.48ダイナミックアレイIFCまたは96.96ダイナミックアレイIFCのためのIFCコントローラHX用のコントローラMX)にチップを置き、その後48.48ダイナミックアレイIFCや総理(136X)のために総理(113X)スクリプトを実行するプライムチップへの順序で96.96ダイナミックアレイIFCのためのスクリプト。
    4. スクリプトが終了すると、IFCコントローラからプライミングチップを取り外します。
    5. ピペット各アッセイミックスを5μlとそれらの入口に各サンプルミックスを5μl。
    6. IFCコントローラにチップを返します。
    7. IFCコントローラソフトウェアを使用すると、48.48ダイナミックアレイIFCのロードミックス(113X)スクリプトを実行する)、または96.96ダイナミックアレイIFCはチップにサンプルおよびアッセイをロードするためのミックス(136X)スクリプトをロードします。ロードミックススクリプトが終了すると、負荷を取り除くIFCコントローラからエドチップ。
    8. 融解曲線分析を含めて、(製造業者のガイドラインに従って)新しいチップランを作成し、サーマルサイクラー上のチップをロードします。サーマルサイクラーソフトウェアを使用して、反応チャンバーが正しく認識されていることを確認し、反応が完了するまで実行することができます。

8。データ解析

  1. 品質保証:データ品質を確保するために、(上述のように)希釈曲線をアドレスすることによって、プライマーの品質を確認する。アンプリコンの融解曲線を見ることによって、増幅の特異性を監視し、のピークが最適にしっかりと29を一致させて下さい。
  2. 可視化:ハイスループット定量PCRにより得られた大量のデータの視覚化のために、使用するソフトウェアがその中で発現が色分けされた強度であり、ヒートマップを生成した。また、並んで散布図のような単一遺伝子の転写ダイナミクスを表示します。
  3. 出版:出版で遺伝子発現の結果は、それがその妥当性、正確性、正しい解釈、および再現性を確保するためのqPCR実験のために報告されなければならない最低限の情報を詳述し、定量的リアルタイムPCR実験の出版のためにMIQEガイドラインに従うことをお勧めします。

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Representative Results

このプロトコルを適用して得られた結果の質は、決定的なパラメータの数に依存する。適切な実験計画は経験がテストされるように、実験用マウスに最小限の妨害になります(この例では、コカインにさらされること)が彼らの最近の歴史の中で最も支配的な経験になりますので、堅牢で特異的転写になりますプログラム。 図1に、核はマウスから解剖され、分析される側坐核れるコカインの経験以下の時点を定義し、コカインへの行動感作のための実験計画を説明しています。次の重要なポイントは、分析のための適切な組織の切除のための正確な境界を定義することである。 図2は、冠状および矢状切片における側坐核の境界を説明しています。好ましくは、解剖は、NAC組織の薄いマージン領域徳から除外されるように行われるべきであるプロファイリングのための専用。これは変動性および周囲の組織を含めることから生じるアーチファクトの可能性を低減する、唯一の側坐核の一貫したプロファイリングを保証します。

小脳核の解剖のように、RNAの量を制限し増幅する場合、増幅の多数のサイクルが信号の適切な検出のために必要である。従って、出発材料の少量を扱うときさらに増幅任意の定量的PCR実験における重要な点は、増幅に用いたプライマーの特性であり、図3は 、最適なプライマーを定義する主要な機能について説明し、 図4は 、プライマーの増幅曲線が向け実証するのc-FosおよびFOSBに対して、これらのプライマー対は、すべてのサイクルで約100%の効率で、その標的転写物を増幅することが実証された。プライマーの検証と適切な実験パラダイムの確立に続いて、ターゲットTISSからの転写の明確な評価を可能にするUE、総合的な分析が(; 図5 96.96形式)9,216並列qPCR反応まで可能フリューBiomarkプラットフォーム上で実行できます。このハイスループットプラットフォームは、単一のチップ上に同一の実験条件を用いて、複数の実験的な繰返しの平行分析を可能にする。急性コカインの経験下記のc-FosおよびFOSBの転写誘導に取り組む四重実験の繰り返しのためのデータは、 図6に例示されています。

図1
コカインの経験次の動的転写解析については図1。実験パラダイム。 (A)実験プロトコール-音響減衰挙動チャンバ内のビデオトラッキングによって自発運動を監視しながらマウスは、3日間処理し、注射に慣らす。マウスその後コカインの経験の対象となります。単一露光=急性コカインの経験; 5つの連続注射は慢性暴露と呼ばれる。コカインから禁断の≥16日後に単回注射は、コカインのチャレンジと呼ばれる。生理食塩水注射の3日又は生理食塩水+の3日後に行動チャンバ内のマウス、トラックの転写ダイナミクスコカインの経験(1、2、4、8、24時間)以下の異なる実験の時点で対処される。(B)プロットシングル急性コカイン暴露。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
マウスの脳で側坐核の2場所図。太い白線は、Bを定義するカットの位置をマーク (B)矢状部と、側坐核(A)冠状断面のoundaries。 (写真は、アレン脳アトラスリファレンスアトラスから適合画像:。 のhttp://atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 ; のhttp://atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100883869 )。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3計画の定量PCRプライマー図 。特異性、安定性と互換性のための定義を、定量PCRプライマーを計画するためのガイドライン。 2fig3highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
プライマー効率の図4。評価。フリューIFCアレイを用いFos及びFOSBの増幅曲線の(A)の結果。標準曲線は、マウス側坐核から抽出し、Fos及びFOSBの発現についてプローブしたトータルRNA七連続3倍希釈を用いて生成した。(B)FosおよびFOSB用のプライマー対の効率は(サイクル閾値の値をプロットすることによって評価した。サンプルの倍希釈の対数に対して各希釈でのCt)。本文中で定義されたプライマーの効率は、標準曲線の傾きから計算される。希釈曲線上の増幅曲線とポイントがカラーマッチングです。51642 / 51642fig4highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
フリュープラットフォームを適用し、図5の包括的な定量PCRプロファイリング。リアルタイム定量PCRのための(A)96.96動的配列IFC。プライマーは、右側に位置し、入口にロードされ、サンプルがチップの左側に位置し、入口にロードされる。この図は、フリューリアルタイムPCR解析ユーザガイドから許可を得て変更されている。チップ上の各ウェルのCt値を表す定量PCR結果の(B)のヒートマップは、。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図急性コカイン暴露後の式ダイナミクスの6サンプルの結果 。のc-FosおよびFOSBのコカイン誘導発現は、時間の関数として表示されます。ここに定義されたプロトコルに従って行った実験四重反復の平均は、平均の標準誤差を描いたエラーバーと共に表示されます。

試薬 MW mMのグラム/ L
塩化ナトリウム(Sigma-Aldrich社、71376) 58.44 119 6.95
炭酸水素ナトリウム(Sigma-Aldrich社、S6014) 84.01 26 2.18
グルコース(Sigma-Aldrich社、G8270) 180.16 10 1.8
塩化カリウム(シグマアルドリッチ、P9541) D> 74.55 2.5 0.186
のNaH 2 PO 4(Sigma-Aldrich社、S9638) 137.99 1 0.138
硫酸マグネシウム⋅7H2 O(Sigma-Aldrich社、M1880) 246.5 4 0.99
塩化カルシウム(Sigma-Aldrich社、C3011) 147 4 0.59

表1 ACSFソリューション。

ソフトウェアの名称アプリケーション Web上の場所
ロシュProbeFinderソフトウェアプライマーの設計 http://qpcr.probefin​​der.com/organism.jsp
NCBIプライマーブラストプライマーの設計 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tool​​s/primer-blast/
ve_content ">、表2ソフトウェアのリスト。

試薬容量/反応(μL) + 10%超過48反応(μl)のための容積 + 10%超過96反応(μl)のための容積
2XのTaqMan PreAmpのマスターミックス(アプライドバイオシステムズ社製) 2.5 132 264
500 nMの(10X)をプールプライマー混合 1 52.8 105.6
0.25 13.2 26.4
cDNAを 1.25
全容積 5

表3のSTA反応液。

条件ホールド 10-14サイクルホールド
温度 95ºC 95ºC 60ºC 4ºC
時間 10分 15秒 4分

前増幅のための表4の熱サイクル条件。

コンポーネント 5μLのサンプルあたり(μL) 超過料金48サンプル(μL) 超過料金96サンプル(μL)
1.4 84 168
エキソヌクレアーゼI反応緩衝液 0.2 12 24
20単位/μlでのエキソヌクレアーゼI 0.4 24 48 </ TD>
全容積 2.0 120 240

表5 ExoI反応溶液。

</ TR>
サンプルMIX 入口あたりの成分容量(μL) 超過料金とインレットあたりの容量(μL) 48.48ダイナミックアレイIFC(μl)のための容積(120サンプル) 96.96ダイナミックアレイIFC(μl)のための容積(120サンプル)
2X SsoFast低ROXとEvaGreenスーパーミックス(Bio-Rad社、5211 PN 172-) 2.5 3 180 360
20X DNA結合色素サンプルローディング試薬(フリュー、3738 PN 100〜)緑キャップ 0.25 0.3 18 36
STAとExoI処理したサンプル 2.25 2.7
合計 5 6

表6サンプルプレミックスソリューション。

表7アッセイミックスソリューション。

コンポーネント入口あたりの容量(μL) 超過料金とインレットあたりの容量(μL) 48.48ダイナミックアレイIFC(μl)のための容積 96.96ダイナミックアレイIFC(μl)のための容積
2Xアッセイローディング試薬 2.5 3 180 360
1X DNA懸濁液バッファー(TE低いEDTA) 2 2.4 144 288
50μMの各混合フォワードおよびリバースプライマー 0.5 0.6
全容積 5 6
試薬/素材の名称会社カタログ番号
Virusol Oriek医療 J29D
イソフルラン、USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNイージープラスユニバーサルミニキット QIAGENE 73404
QIAシュレッダー QIAGENE 79654
大容量のcDNA逆転写キットインビトロジェン AB-4368814
TEバッファーインビトロジェン 1355656

化学物質/試薬の表8のリスト。

機器の名称会社カタログ番号
行動会議所(MDF; 50×45センチ) 自己組み立て
インナーパースペックスボックス(30×30cm)に自己組み立て
カメラやビデオレコーダーカムデン工大 CMD-80051
メディアレコーダーソフトウェア Noldus NDS-NMR3-00M
アイリスはさみ FST FST-14062から09
ビブラトームカムデン工大。 7000SMZ-2
バイオアナライザアジレント·テクノロジーアジレント2100バイオアナライザ
サーマルサイクラーバイオ·ラッド 1852048
反転microspunへら Bochemインストゥルメント社 3213
Biomark HDリADER フリュー BMHD-BMKHD
96.96遺伝子発現のためのダイナミックアレイチップフリュー BMK-M-96.96

表9機器のリスト。

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Discussion

行動パラダイム以下の脳組織からの遺伝子発現の特徴付けは、成功によって異なります。行動パラダイムの間のマウスの1)慎重な取り扱い;目的の組織の2)迅速かつ正確な解剖; RNAの完全性を確保するための3)RNAセーフ対策; 4)慎重なプライマーと実験レイアウトの計画だけでなく、qPCR分析の準備のために細部にまで精度と注意。

記載された手順の目的は、行動の経験によって誘導される転写事象のダイナミクスを特徴付けることである。そのため、細心の注意は確かに、マウスが経験した行動パラダイム研究者が意図した経験を表していることを確実にするために必要である。例えば、でもコカインに対する行動感作のような単純なパラダイムにおいて、マウスの経験は、多くの交絡因子の影響を受けることができます。元のホームケージでのマウスの経験の前periment;実験室への転送方法;実験室内の光、音や臭いの暴露;実験者の取り扱いの経験; IP注射による痛み/不快感;小説実験への暴露、および安楽死の時点までの指定された動作、次の経験。これらの経験のそれぞれは、単独で、マウスのさまざまな脳領域における転写プログラムの誘導を促進することができる。そのため、注意が転写プログラムが必要なパラダイムを計測するように注意する必要があり、付帯現象パラダイムに関連付けられていない。コカインの経験の場合、これは容易に、マウスではなく、コカインを注入する注意深い実験と注目細部への、ならびに全てのパラメータが一定に維持される単純な対照実験が、ビヒクル(生理食塩水)によって達成される。われわれの経験では、生理食塩水注入はと比較して非常に限られた規模の転写プログラムを誘導するコカイン暴露、パラダイムは圧倒的に関心のある現象の調査を可能にすることを実証している。

それがまだアクティブなときに最大限の注意をマウスの穏やかで、慎重な取り扱いが必要、マウスの経験の範囲を制限するように注意する必要があります。これとは対照的に、麻酔以下、高速かつ正確な作業は、潜在的に起因する細胞が破壊されると急速に分解することができた(分のタイムスケール上)、RNAの表現の急速な変化とRNAの固有不安定性の可能性に不可欠である経験によって誘導される転写プロファイルを乱す。それは、(1〜2​​分以内)に冷却した環境に迅速に頭蓋骨から脳を除去し、急速に氷のように冷たい状態でNACを解剖することが重要である。脳が冷却されると、転写変化またはRNA分解の可能性が大幅に低減されるが、関連するセクションをトリゾール試薬中に配置されている場合にのみ凍結、私sの組織の完全性および転写プロファイルの表現を確保。

この文脈では、刺激後の前に1時間をピークに、多くの場合、前初期遺伝子発現の転写ダイナミクスは急速時間スケールで起こることを言及する価値がある。記載された実験パラダイムの文脈において、転写ダイナミクスの呼び掛けは、サンプル間のばらつきを低減するために、時間のスケールに制限される。 1時間よりも短い時間のために、タイミングの小さな変動が観測され、転写変化の大きさが大きく変動する可能性があります。この時点は実験的に精密に行うことが容易であり、実験で数分差のレベルの変動の影響を受けにくいので、したがって、1時間の時点で、分析のために選択されている。

伝統的に、組織micropunchは、組織試料の解剖のための多くの研究室で使用されてきた。そこ組織の顕微解剖マニュアルを好む多くの理由である。パンチは、通常、ステンレス鋼製の透明ではない。そのため、正確で一貫性のある場所にパンチを配置することは難しいことができます。さらに、パンチが初期位置決めに誤りがあった場合、任意の補正が行われることはできません。最後に、パンチ内から組織の抽出は、時にはトリッキーな証明することができ、組織を失う可能性がありますが、またはキャリーオーバーサンプル間。細かいメスを用いて組織の顕微解剖は、実験者がより正確な制御を可能にし、サンプルの純度に関するセキュリティを提供します。

RNA抽出およびcDNA合成アップするまでの間に、作業環境のRNase汚染源から自由に保つ必要があり、作業がRNアーゼフリーのツール、消耗品および試薬を用いて行うべきである。この段階では、最小の汚染がRNAサンプルを簡単に破損して苦労して稼いだ可能性があります。サンプル私を維持CEの寒さは、転写の読み出しを変更する可能性がありますだけでなく、サンプルの完全性に影響を与える可能性が酵素活性を最小限にするために神経活動を最小化するために重要です。付加的な薬理学的阻害剤は、時には、神経の興奮性を低減するために添加されるが、多くの場合、これらは必須ではない。

cDNAに逆転写した後、重点は転写産物の包括的なプロファイリングから得られた結果の妥当性を確保することになります。最初のステップは、それが非常にRNAの定義されたソースの希釈曲線にプライマー効率および特異性を試験することが推奨されている、適切な定量PCRプライマーが利用されることを保証することである。最適なPCRプライマーは、標的の特異的かつ効率的な増幅を提供する。特異的増幅の効率的な増幅は、各サイクルにおいて、標的配列の量であることを意味しつつ増幅は、明らかな融解曲線分析で単一の個別のピークとして、唯一の標的配列であることを意味100%に近似する効率で、重複。なぜなら、マイクロ流体定量PCRチップのハイスループット性質のために、これらの実験は、陽性対照および陰性対照のかなりの数の包含を保証するために慎重な計画を必要とする。これは、対照および実験条件からの結果の直接比較を可能にする、チップ毎の実行で一貫性のあるコントロールを含むことが好ましい。実験のセットアップ中に、それはない、クロス汚染物ウェルに重要です。間違ってよくにおけるプライマーの小さな量は、望ましくない標的の増幅を引き起こす可能性があるためのプライマーをピペッティングする際、余分な注意が必要です。

脳からほとんどの組織試料のためには、解剖時に興味のある唯一の組織は、結果の分析を混乱させる可能性があり、無関係の脳領域の汚染を含んでいない、抽出されたことを確信することは困難である。この目的のために、重要な制御は、発現から除外されると予想される遺伝子についてプロービングされる目的の組織。遺伝子発現の空間パターンを同定するために有用なツールは、アレン脳アトラス(あるhttp://www.brain-map.org/ )。

データ分析の徹底的な議論は、このマニュアルの範囲を超えているが、それはその注意深い実験を保証慎重に分析を注意すべきである。これは、関連する参照遺伝子の数は、定量PCRの各ラウンドに含ま​​れることを保証することが重要である。これらの遺伝子は、RNAの類似の量がアッセイされていることを確実にするために正規化のために役立つ。正規化は、サンプル内の参照遺伝子を、次に「ΔΔCT法」を適用する実験(「時間0」)のための基準をマウスに最初に実行される。

この原稿に記載されているプロトコルは、マウスの側坐核におけるコカインの経験、次転写ダイナミクスを研究することを目的としている。しかし、それは非常に簡単であるadapteマウスの他の経験の研究のためのdは、限り、適切なコントロールが実装されているように、経験のタイミングは、十分に定義されている。明らかに、このプロトコルはまた、同様に神経系外の組織における転写のダイナミクスの研究のために実施することができる。

それは、マイクロ流体ベースのqPCRを使用して、包括的な転写プロファイリングは、転写事象プロファイリングの費用対効果の高い方法であるが、目的の標的遺伝子についての事前の知識に依存することが強調されるべきである。これらは通常、マイクロアレイと深いシーケンシングなどの公平なプロファイリング方法によって得られる。そのため、大規模なプロジェクトのワークフローで、総合的な定量PCRプロファイリングは、データの大部分を提供することもできますが、優先的にシステムの前に公平な特徴付けに従うべきである。

これは、組織サンプルを得るための本明細書に記載されるプロセスはまた、試験に向けて実装することができることを示すことも価値があるプロテオミクスとタンパク質修飾、メタボロミクス、リピドミクス、およびエピジェネティックマーク - 他の細胞事象のさまざまなる。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Virusol Oriek Medical J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit QIAGEN 73404
QIAshredder QIAGEN 79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit Invitrogen AB-4368814
TE Buffer Invitrogen 1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm) Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm) Self assembled
Camera and video recorder Campden Inst. CMD-80051
Media Recorder software Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Scissors FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler Bio-Rad 1852048
Inverted microspoon spatula Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD Reader Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression Fluidigm BMK-M-96.96

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References

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