Analisi completa di Trascrizione Dynamics da campioni di cervello seguito Behavioral Experience

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Turm, H., Mukherjee, D., Haritan, D., Tahor, M., Citri, A. Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience. J. Vis. Exp. (90), e51642, doi:10.3791/51642 (2014).

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Abstract

La codifica delle esperienze nel cervello e il consolidamento della memoria a lungo termine dipendono dalla trascrizione genica. Identificare la funzione di geni specifici in un'esperienza di codifica è uno dei principali obiettivi delle neuroscienze molecolare. Inoltre, l'associazione funzionale di geni definiti con comportamenti specifici ha implicazioni per la comprensione base dei disturbi neuropsichiatrici. Induzione di programmi di trascrizione robusti è stato osservato nel cervello dei topi seguenti varie manipolazioni comportamentali. Mentre alcuni elementi genetici sono utilizzati ripetutamente seguendo diverse manipolazioni comportamentali e in diversi nuclei cerebrali, programmi trascrizionali sono complessivamente unica agli stimoli che inducono e la struttura in cui sono studiati 1,2.

In questa pubblicazione, un protocollo è descritto per robusta e completa profilatura trascrizionale da nuclei cerebrali di topi in risposta alla manipolazione comportamentale. Ilprotocollo è dimostrata nel contesto di analisi delle dinamiche di espressione genica nel nucleo accumbens seguente esperienza cocaina acuta. A seguito di un definito nell'esperienza vivo, il tessuto neurale bersaglio è sezionato; seguita da purificazione dell'RNA, trascrizione inversa e l'utilizzo di array microfluidica per l'esauriente analisi qPCR di molteplici geni bersaglio. Questo protocollo è orientato verso un'analisi completa (indirizzamento 50-500 geni) di limitare le quantità di materiale di partenza, come ad esempio piccoli campioni di cervello o anche singole cellule.

Il protocollo è più vantaggiosa per l'analisi in parallelo di più campioni (ad esempio, singole cellule, analisi dinamica seguendo farmaceutica, virale o perturbazioni comportamentali). Tuttavia, il protocollo potrebbe anche servire per la caratterizzazione e garanzia di qualità dei campioni prima di studi intero genoma da microarray o RNAseq, nonché la validazione dei dati ottenuti da studi intero genoma.

Introduction

Organizzazione dinamica del cervello permette flessibilità cognitiva e comportamentale. Esperienze sono codificati mediante modifiche della struttura e la forza delle connessioni tra i neuroni nel cervello 3. Questa "plasticità esperienza-dipendente" è il risultato di induzione di specifici pattern di espressione genica che fornisce le proteine ​​necessarie per la modifica della struttura sinaptica e forza 4. L'identificazione di reti di regolazione genica mediare la formazione della memoria a lungo termine è un principio centrale della neuroscienza molecolare, con l'aspettativa che l'identificazione degli elementi dominanti di programmi trascrizionali sarà approfondire la conoscenza dei principi fondamentali che regolano la formazione della memoria, così come obiettivi per trattamento dei neurodegenerative e disturbi neuropsichiatrici. Programmi di trascrizione si svolgono in onde temporalmente definiti, ognuno dei quali codificano geni di carattere diverso, che sono importanti per dfasi ifferent in attuazione dei risultati della manifestazione di segnalazione 1,2. È quindi importante affrontare dinamiche trascrizionali su una scala temporale temporale dettagliata, in modo da identificare la serie completa di geni indotti, e ottenere informazioni sui loro funzione potenziale secondo la dinamica del loro induzione.

La tossicodipendenza è una forma solida di plasticità esperienza-dipendente causata dagli effetti di lunga durata delle sostanze d'abuso sui circuiti neurali nel cervello 5,6. L'esposizione iniziale, acuta ai farmaci può portare allo sviluppo di dipendenza e la transizione verso l'uso cronico. Informazione contestuale è un elemento cruciale nello sviluppo della dipendenza. Stimoli ambientali Drug-associati vengono assegnati notevole importanza nella mente dei tossicodipendenti. Informazioni contestuali ricordando un tossicodipendente di esperienza con la droga passato può indurre ricaduta al craving anche dopo lunghi periodi di astinenza da esposizione al farmaco 7,8.Di qui la grande sfida clinica nella dipendenza - la propensione dei tossicodipendenti della ricaduta anche molto tempo dopo che i sintomi di astinenza sono calmati 9.

Sensibilizzazione comportamentale alla cocaina è un semplice modello di esperienza cocaina utile nello studio dei meccanismi di tossicodipendenza. In questo modello ampiamente studiato per la sensibilizzazione di lunga durata indotta da esposizione cronica a sostanze d'abuso, roditori sono abituati prima a iniezioni di soluzione salina (intraperitoneale; IP) in un ambiente romanzo (una camera campo aperto in cui viene monitorata la loro attività locomotoria) ; poi, ricevono iniezioni giornaliere di cocaina nelle camere a campo aperto mentre la loro attività viene monitorata 10 (Figura 1). Questo paradigma comportamentale si traduce in genere in un robusto sensibilizzazione del comportamento locomotorio (8-12 volte superiori l'attività di base) 11, che viene mantenuto per un periodo di mesi dopo la cessazione delle iniezioni di cocaina, dimostrando la formazione di un pervtraccia di memoria asive di esperienza con la droga.

I circuiti neurali di ricompensa, naturalmente coinvolta nel rafforzare comportamenti essenziali per il successo di una specie (ad esempio, l'alimentazione, il sesso), viene sfruttata da sostanze d'abuso di rinforzare i comportamenti-droga associata 12,13. I meccanismi molecolari e cellulari con cui l'esperienza delle droghe d'abuso è esaltata sembrano essere simili ai meccanismi alla base della formazione dei ricordi dichiarativi o semantiche in altre strutture cerebrali 14. Pertanto, la robustezza del modello comportamentale di sensibilizzazione rende un sistema modello interessante per studiare i meccanismi di plasticità esperienza-dipendente.

Il nucleus accumbens (NAC) è un integratore centrale dei circuiti di ricompensa del cervello, ed è stato ampiamente associato con lo sviluppo di dipendenza 5,6. La formazione di dipendenza dipende trascrizione di nuove proteine ​​nel nucleo accumbens e robustaproduzione di programmi di trascrizione chiaramente strutturati si osserva nel NAc seguente esperienza cocaina 15-19. La risposta trascrizionale acuta all'esposizione cocaina è probabile per funzionare a più livelli per adattarsi alla forte stimolo induzione e per dirigere la produzione di nuove proteine ​​che sono responsabili per i cambiamenti strutturali ed elettrofisiologiche indotte da esposizione al farmaco 6,19-22.

Al fine di promuovere lo studio dei meccanismi molecolari della plasticità esperienza-dipendente nel cervello, un protocollo è descritto per l'analisi completa della dinamica di trascrizione in campioni di tessuto cerebrale a seguito di manipolazione comportamentale. Il protocollo è illustrato nel contesto dell'esperienza comportamentale studiata in laboratorio Citri - sensibilizzazione comportamentale alla cocaina, utilizzando matrici dinamiche microfluidici per analisi trascrizionale. Il protocollo descritto non è ovviamente limitato a studiare tegli nucleo accumbens nel contesto della sensibilizzazione comportamentale, ma potrebbe essere applicata ad un gran numero di paradigmi comportamentali e regioni del cervello. In realtà, questo protocollo potrebbe essere applicato a tessuti del corpo al di fuori del cervello, e una varietà di esperienze o manipolazioni dell'organismo studiato.

Il protocollo è divisa in quattro fasi. Nella prima fase, l'animale è sottoposto al paradigma comportamentale; nella seconda fase il tessuto è microdissezione; nella terza fase - mRNA viene purificato, retrotrascritto e sondato, e nella fase finale i dati vengono analizzati.

Nel contesto di studiare le dinamiche trascrizionali, la tempistica precisa e definizione di esperienza sono probabilmente i più importanti parametri sperimentali per il controllo. Per questo motivo, il nostro modello comportamentale di scelta è quella di sensibilizzazione comportamentale alla cocaina, un sistema che permette elevato livello di controllo sperimentatore sui parametri del experience. Paradigmi comportamentali aggiuntivi che consentono tempi precisi e affrontano diversi modelli di plasticità esperienza-dipendente o di formazione della memoria sono disponibili. Questi modelli includono paura condizionata 23, arricchimento ambientale acuta 24,25, romanzo esplorazione oggetto 26 e l'esperienza visiva in seguito allevamento buio 27. Eppure, sensibilizzazione comportamentale alla cocaina è una manipolazione comportamentale costantemente robusta, creando una traccia di memoria altamente pervasivo che dura da mesi successivi esperienza cocaina 28.

Il cervello è sezionato, seguita da microdissezione manuale nucleo accumbens. E 'stata la nostra esperienza che microdissezione manuale da fettine di cervello rapidamente preparati fornisce il metodo più affidabile e rapida estrazione del tessuto relativo al paradigma comportamentale, e con l'esperienza, i confini del tessuto diventato evidente e facilmente riconoscibile. In alternativa, fette sottili potrebbero essere preparEd, seguito da laser-capture microdissezione. Anche se questo metodo consente altamente definito delineazione della regione di interesse, è lento (rischiando così la perdita di mRNA labile), noioso e richiede costose attrezzature dedicate (un microscopio dotato di una messa a punto laser-capture). Il protocollo qui definita potrebbe anche essere adattato a cella singola analisi trascrizionale, mediante aspirazione manuale del citoplasma delle cellule individuati visivamente utilizzando pipette di patch 29. È importante notare che il protocollo descritto fornisce una media della popolazione, mentre è altamente probabile che nella maggior parte dei casi, solo una sottopopolazione di cellule all'interno del tessuto sono effettivamente coinvolti nella risposta all'esperienza. E 'di interesse al profilo trascrizione in maniera selettiva all'interno di specifiche popolazioni cellulari che rispondono all'esperienza, ma la discussione di questi approcci è oltre l'ambito corrente.

Per la purificazione di mRNA, reverse-trascrizione e qPCR interrogazione, il tessutoè interrotta da passare attraverso aghi sottili, seguita da l'utilizzo di kit disponibili in commercio (per ulteriori informazioni, vedere Tabella 8). La scelta è informato da esperienza con queste metodologie, che garantiscono l'estrazione affidabile di RNA di alta qualità e robusti risultati di applicazioni a valle.

Mentre il protocollo è descritto per high-throughput qPCR utilizzando array dinamici, i campioni possono essere sondati per l'espressione genica utilizzando end-point PCR, a bassa velocità qPCR, gene microarray di espressione o di sequenziamento profondo. La preferenza per high throughput qPCR utilizzando matrici dinamiche è dovuto al fatto che il mRNA ottenuto da nuclei cerebrali seguente paradigmi comportamentali è spesso di quantità limitanti. Gli array dinamici forniscono una piattaforma che consente efficiente un'analisi completa dei trascritti da un gran numero di campioni in parallelo in un singolo esperimento. Dopo l'acquisizione iniziale del sistema microfluidica (comunemente un pu istituzionalerchase), gli esperimenti sono relativamente poco costoso per funzionare. A seguito di questa analisi, un'ulteriore interrogazione dei campioni può essere eseguita utilizzando piattaforme più costose per la ricerca di nuove trascrizioni (di microarrays o RNAseq) con gli array dinamici fornendo un riferimento completo per la garanzia della qualità. Infine, per l'analisi dei dati, approcci standard sono utilizzati. Indicazioni specifiche riguardanti questioni che potrebbero sorgere saranno discusse nel testo del protocollo.

Questo protocollo è più appropriato per i ricercatori interessati a un'indagine approfondita del loro sistema di interesse, studiando più condizioni e replicati. Il protocollo è più adatto per gli investigatori che hanno già affinato in (attraverso microarray o RNAseq esperimenti) su un sottoinsieme di 50-500 geni di interesse, che sono interessati a interrogare ripetutamente.

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Protocol

NOTA: Il protocollo segue le linee guida per la cura degli animali della Hebrew University di Gerusalemme.

1 Preparazione della soluzione ACSF

  1. Preparare la soluzione ACSF come descritto nella Tabella 1. Fare 1 L in DDH 2 O (> 18 MW purezza), portando osmolarità a ~ 300 mOsm / L con adeguata aggiunta di acqua o di NaCl.

2 Attrezzature e Camera Set Up

L'attrezzatura per il monitoraggio del comportamento motorio indotta dalla cocaina è composto da camere di comportamento (50 x 45 cm) cablati con una fonte di luce interiore, ventilatore e la macchina fotografica (o sensori a infrarossi), e dotato di una scatola di plexiglas interna (30 x 30 cm) in che i topi possono muoversi liberamente, mentre la loro locomozione è monitorato. Il test comportamentali deve essere effettuata tra 1 ora dopo luci per 1 ora prima luci spente, su un normale ciclo luce / buio. Gli animali devono essere formati in modo coerente alla stessa ora ogni giorno.

  1. Pulire le camere dopo ogni prova con disinfettante fornito da impianto di mouse e / o la rimozione di odori reagente, al fine di evitare pregiudizi spunto olfattiva e per garantire la corretta disinfezione.

IMPORTANTE: Durante la manipolazione i topi essere tranquillo, calmo e attento.

3 Preparazione degli animali

  1. Casa 5 C57BL6 topi maschi (6-12 settimane; ~ 25-35 g di peso) per gabbia, in una stanza con una luce di 12 ore / ciclo scuro e libero accesso a cibo e acqua, secondo le norme e requisiti di Animal locale Cura guida e protocolli Comitato. Prima di iniziare l'esperimento, pesare i topi e registrare i dati. La cocaina viene successivamente somministrato in base al peso dei topi.
  2. Trasferire tutte le gabbie contenenti topi nella comportamentale stanza 30 minuti prima di iniziare la prima prova.
  3. Abituare tutti itopi utilizzati nell'esperimento di sperimentatore manipolazione, iniezioni e monitoraggio nel setup comportamento. Ciò si ottiene 3 consecutivi iniezioni intraperitoneali giornaliere di 250 microlitri di soluzione salina come descritto di seguito.
  4. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di soluzione fisiologica 250 ml. Subito dopo l'iniezione, posizionare il mouse in una camera di comportamento per monitorare l'attività locomotoria per 15 min. Ripetere questa operazione per 3 giorni consecutivi, alla stessa ora ogni giorno.
  5. Il quarto giorno, dividere i topi in due gruppi. Preparare una soluzione stock di cocaina a 2 mg / ml in soluzione fisiologica. Somministrare una singola iniezione di soluzione di cocaina (finale 20 mg / kg) al gruppo sperimentale in base al peso del mouse (ad esempio per un 25 g topo - iniettare 250 ml, mentre un 30 g topo riceverà 300 microlitri). Somministrare soluzione salina al gruppo di controllo. Subito dopo l'iniezione, posizionare il mouse per 20 minuti in una camera di comportamento per il monitoraggio delle attività locomotoria (typicalleato, i primi 15 minuti sono monitorati).
  6. Dopo l'iniezione di cocaina, sacrificare i topi a diversi intervalli di tempo (0, 1, 2, 4, 8 e 24 ore dopo l'iniezione). Soprattutto, assicurarsi che i topi di riferimento (0 virgola tempo) non riceveranno alcuna iniezione in questo giorno. Per la sua importanza, è indispensabile includere repliche del gruppo di riferimento.

4 dissezione del nucleo accumbens

  1. Anestetizzare i topi con isoflurano al momento opportuno dopo l'iniezione di cocaina / soluzione salina. L'isoflurano deve essere ventilato direttamente fuori dalla stanza. Pertanto, la procedura deve essere eseguita in una cappa.
  2. Monitorare la profondità dell'anestesia testando il riflesso del piede posteriore. Pizzica la zampa di ottenere una risposta recesso da parte degli animali. Un animale che mostra un riflesso non è a un livello di anestesia chirurgica e non in uno stato di eutanasia.
  3. Estrazione del cervello:
    1. Euthanize il mouse per decapitazione.
    2. <li> Togliere la pelle sopra il centro del cranio e tagliare il cranio con le forbici affilate.
    3. Inserire le forbici nel punto in cui il midollo spinale entra nel cervello (forame magnum) e fare due tagli laterali.
    4. Dallo stesso punto, fare un lungo taglio sagittale lungo la sutura sagittale. Giunti al bulbo olfattivo, clip a sinistra ea destra.
    5. Con una pinza, rimuovere il cranio con attenzione, cogliendo ogni metà del cranio saldamente e tirando di lato, facendo attenzione a non premere sul o danneggiare il cervello.
    6. Rimuovere il cervello mentre recidere i nervi cranici utilizzando un cucchiaio rovesciato micro spatola.
  4. Mettere il cervello in una soluzione ACSF ghiacciata per 1-2 minuti per raffreddare e indurire.
  5. Rimuovere cervello dal ACSF, dello stoppino liquido in eccesso con un tovagliolo di carta, di creare un taglio coronale tra il cervelletto e il resto del cervello e incollare il cervello, con la parte rostrale rivolta verso l'alto, sul palco vibratome.
  6. Taglio del NAc: Mantenere soluzioni ACSF a temperature gelide nella camera di taglio del vibratome. Sezione a 200 micron fino a quando il nucleo accumbens (NAc) è chiaramente identificato in base alla Paxinos e Franklin mouse cervello Atlas (circa 1,8 mm anteriormente al bregma, prestare attenzione alla forma del corpo calloso, la posizione e la forma della commessura anteriore e i ventricoli, così come la morfologia complessiva della sezione cervello). A questo punto, creare due 400 micron sezioni, da cui il NAc verrà sezionato.
  7. Sotto uno stereoscopio, usare una lama di sezionare l'area NAc fuori dalle fette. La definizione del NAc corrisponde alle Paxinos e Franklin atlante cervello di topo, e potrebbe essere convenientemente sezionato in apposite sezioni da quattro passaggi veloci della lama sul tessuto. (Figura 2).
  8. Posizionare le sezioni NAc immediatamente in 900 microlitri Trizol reagente di lisi in una provetta e conservare a -80 ° C fino a RNA estrazione.

5. RNA Estrazione e cDNA Reverse Transcription

  1. Scongelare le provette contenenti nucleo accumbens sezioni Trizol lisi reagente a temperatura ambiente ed omogeneizzare il lisato con una siringa da 1 ml connesso al 25 ago G finché il tessuto è interamente omogeneizzato (almeno 15-20 volte). I primi colpi sono difficili, e richiedono spingendo il tessuto contro la parete del tubo in modo da rompere a piccoli pezzi che potrebbero entrare la punta dell'ago.
  2. Per garantire omogeneizzazione, pipettare il lisato in una mini colonna di spin QIAshredder e centrifugare a 12.000 xg per 1 min.
  3. Pipettare il lisato in una nuova provetta e estrarre l'RNA secondo le istruzioni del produttore. Conservare l'RNA a -80 ° C fino all'utilizzo.
  4. Misurare la concentrazione di RNA, analizzare l'integrità e la qualità utilizzando un Bioanalyzer o apparecchiatura equivalente. Utilizzare 100-500 ng di RNA per ogni turno di preparazione cDNA con rAndom primer esameriche.

6. Primer Progettazione e Testing Primer

  1. La scelta di buoni primer: Per una coppia di primer ottimale per qPCR di trascritti di mRNA, seguire questi requisiti (Figura 3):
    1. Primer design non più di 17-28, contenenti basi. Evitare ripetizioni nucleotidiche in quanto promuovono mispriming.
    2. Primer design con temperatura di fusione (Tm) tra 56-68 ° C (ottimale 60-64 ° C). La T m all'interno della coppia di primer dovrebbe essere entro 1 ° C di ogni altra.
    3. Essere consapevoli del fatto che le dimensioni del prodotto dovrebbe idealmente essere compresa tra 80 e 150bp.
    4. Assicurarsi che almeno uno dei primer si estende su una giunzione esone-esone, o all'amplicon contiene una grande introne (introne-spanning), al fine di evitare l'amplificazione dei contaminanti di DNA genomico.
    5. Utilizzare un software affidabile basata su Primer3 (per esempio vedi tabella 2), al fine di migliorare la progettazione primer.
  2. Test del prIMers: Al fine di garantire la specificità e l'efficienza dei primer, una reazione qPCR controllo devono essere eseguite:
    1. Utilizzare un campione positivo (contenente cDNA modello per tutte le coppie di primer rilevanti) e titolare del cDNA (ad esempio otto diluizioni tre volte, passando da una concentrazione iniziale di ~ 10 ng) in reazioni parallele duplicati. Include un controllo senza mascherina, che controlla per contaminazione all'interno delle soluzioni utilizzate per la reazione.
    2. Calcola efficienza Primer utilizzando la formula: (10 (- 1 / pendenza) -1) × 100, tale che la curva della pendenza ottimale è - 3,333 (cioè 10 (- 1 / 3,333) = 2) (Figura 4).
    3. Determinare la specificità dell'amplificazione. L'amplificazione specifica è dimostrato da un unico picco significativo comune a tutte le curve di fusione dei prodotti amplificati, mentre fuori porta amplificazione apparirebbe come una deviazione evidente from l'unico grande picco.

7 Analisi qPCR

  1. Pre-amplificazione:
    1. Analisi completa qPCR si riferiscono interrogazione parallela di limitare le quantità di RNA con un gran numero di coppie di primer. Pertanto, una fase di pre-amplificazione è essenziale. In questo passaggio, il cDNA subisce 14-18 cicli di pre-amplificazione con una miscela di tutti i primers che verranno utilizzati per interrogare il campione in futuro (fino a 800 coppie di primer).
    2. Diluire tutti i primer di TE (basso EDTA) a 50 micron per specifica per un determinato Amplification (STA).
    3. Pool insieme 1 microlitri aliquote di tutti primer 50 micron imposta da includere nella reazione STA, fino a 800 test.
    4. Preparare pre-mix e campioni per STA come descritto nella Tabella 3. Consentire errore preparando miscela per il 110% del numero di campioni che devono essere amplificato.
    5. Aliquota 3,75 ml STA pre-mix per ogni campione. Aggiungere 1,25 mldi cDNA a ciascuno.
    6. Vortex per miscelare le reazioni e centrifugare per 10 sec.
    7. Posizionare le reazioni STA in un termociclatore e il ciclo come indicato in Tabella 4.
  2. Exonuclease I (ExoI) trattamento:
    1. Diluire il Exo io, come indicato nella tabella 5.
    2. Aggiungere 2 ml di ExoI diluito (4 U / ml) per ogni reazione STA 5 microlitri, vortice, spin down (> 6.000 xg) e posto in un termociclatore a 37 ° C per 30 min e poi a 80 ° C per 15 min.
    3. Diluire i prodotti finali ad una concentrazione adeguata per il test. Usa TE Buffer (aggiungere 43 microlitri di buffer TE al campione TSA 7 ml).
    4. Conservare i prodotti STA diluiti a -20 ° C o usare immediatamente.
  3. Primer e la configurazione di esempio per qPCR:
    1. Preparare campioni come mostrato in Tabella 6. Preparare miscela secondo il chip scelto per l'esperimento, e aggiungere campioni come appropriato.
    2. Agitate le soluzioni Mescolare il campione per un minimo di 20 secondi e centrifugare (> 6.000 xg) per almeno 30 sec. Reazioni preparati possono essere conservati per brevi periodi a 4 ° C fino al chip è pronto per il caricamento.
    3. Preparare i saggi come descritto nella Tabella 7.
    4. Agitare la Assay Mix per un minimo di 20 secondi e centrifugare (> 6.000 xg) per almeno 30 secondi a girare giù tutti i componenti.
      IMPORTANTE: Vortex e centrifugare a fondo tutte le soluzioni campione e test prima di pipettaggio nelle insenature di chip. In caso contrario si potrebbe causare una diminuzione della qualità dei dati.
      NOTA: La concentrazione finale di ogni primer è 5 micron in ingresso e 500 nM nella reazione finale.
  4. Adescamento e caricamento Array dinamico IFC (circuito fluidico integrato) chip. Il chip IFC ha ingressi per campioni e analisi, così come ingressi specificati (accumulatori) per il fluido di linea di controllo (olio minerale) utilizzati per pressurizzare le camere di microfluidica (Figure 4A).
    1. Iniettare liquido linea di controllo in ogni accumulatore sul chip.
    2. Rimuovere ed eliminare la pellicola protettiva azzurra dal fondo del chip.
    3. Posizionare il chip nel controller IFC appropriata (Controller MX per il 48.48 Dinamica IFC Array o il controller HX IFC per il 96,96 Array Dinamico IFC), quindi eseguire lo script Prime (113x) per il 48.48 Dinamica IFC Array o il primo (136x) script per il 96,96 matrice dinamica IFC per primo il chip.
    4. Quando lo script ha finito, rimuovere il chip innescata dal controller IFC.
    5. Pipettare 5 ml di ogni Assay Mix e 5 ml di ogni Mescolare il campione nelle loro insenature.
    6. Ritorna il chip al controller IFC.
    7. Utilizzando il software del controller IFC, eseguire il carico Mix (113x) script per il 48.48 Array Dinamico IFC) o caricare Mix (136x) script per il 96,96 Array dinamico IFC per caricare i campioni e saggi nel chip. Quando lo script di Load Mix ha finito, rimuovere il caricoEd circuito integrato dal controller IFC.
    8. Caricare il chip sulla termociclatore, creare una nuova corsa circuito integrato (secondo le linee guida del produttore), inclusa l'analisi della curva di melting. Utilizzando il software termociclatore, assicurarsi che le camere di reazione vengono riconosciuti correttamente, e permettono la reazione di eseguire fino al completamento.

Analisi dei dati 8.

  1. Garanzia di qualità: Al fine di garantire la qualità dei dati, verificare la qualità dei primer affrontando curve di diluizione (come descritto sopra). Monitorare la specificità dell'amplificazione visualizzando le curve di melting degli ampliconi, i picchi di quali dovrebbero essere strettamente allineati in modo ottimale 29.
  2. Visualizzazione: Per la visualizzazione di grandi quantità di dati ottenuti da high-throughput qPCR, uso di software generato heatmaps, in cui l'espressione è color-coded per intensità. Inoltre, potrai vedere le dinamiche trascrizionali di geni singoli come grafici a dispersione allineati.
  3. Pubblicazione: In publishingi risultati di espressione genica, si consiglia di seguire le linee guida MIQE per la pubblicazione dei quantitativi in ​​tempo reale PCR esperimenti, dettagliando le informazioni minime che devono essere segnalati per un esperimento qPCR per garantire la sua rilevanza, accuratezza, la corretta interpretazione e la riproducibilità.

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Representative Results

La qualità dei risultati ottenuti applicando questo protocollo dipende essenzialmente da una serie di parametri. Pianificazione sperimentale corretta comporterà minimo disturbo ai topi sperimentali, tale che l'esperienza testato (in questo esempio, che l'esposizione alla cocaina) sarà l'esperienza più dominante nella loro storia recente, e quindi si tradurrà in una trascrizionale robusto e specifico programma. Figura 1 descrive il piano sperimentale per la sensibilizzazione comportamentale alla cocaina, definire i punti di tempo dopo l'esperienza di cocaina in cui il nucleo accumbens è sezionato da topi e analizzato. Il prossimo punto cruciale è quello di definire i limiti precisi per l'asportazione del tessuto adeguato per l'analisi. Figura 2 descrive i confini del nucleo accumbens in sezioni coronali e sagittali. Preferibilmente la dissezione deve essere eseguita in modo tale che un margine sottile di tessuto NAc è escluso dalla regione takit per la profilazione. Questo assicura profiling coerente solo del NAc, riducendo la variabilità e il potenziale di artefatti derivanti dalla inclusione di tessuto circostante.

Quando amplificando limitando quantità di RNA, come nella dissezione di piccoli nuclei cerebrali, sono necessarie per una corretta rilevazione del segnale di molti cicli di amplificazione. Pertanto un punto cruciale in ogni esperimento PCR quantitativa, ulteriormente amplificato quando si lavora con piccole quantità di materiale di partenza, è la caratterizzazione dei primer utilizzati per l'amplificazione. Figura 3 descrive caratteristiche fondamentali nel definire primer ottimali, e la figura 4 dimostra le curve di amplificazione di primer diretti contro c-Fos e FosB, dimostrando che queste coppie di primer amplificano la loro trascrizione bersaglio con efficienza ~ 100% in ogni ciclo. Dopo la convalida primer e istituzione del corretto paradigma sperimentale per consentire chiara valutazione della trascrizione dai tiss bersaglioue, un'analisi completa può essere eseguita sulla piattaforma Fluidigm BioMark, consentendo fino a 9.216 reazioni parallele qPCR (nel formato 96.96; Figura 5). Questa piattaforma high throughput permette analisi in parallelo di più ripetizioni sperimentali, utilizzando condizioni sperimentali identiche su un singolo chip. I dati per ripetizioni sperimentali quadruple, affrontando l'induzione trascrizionale di c-Fos e FosB seguente esperienza cocaina acuta, sono dimostrati nella Figura 6.

Figura 1
Figura 1 paradigma sperimentale per l'analisi trascrizionale dinamica seguente esperienza cocaina. (A) Protocollo sperimentale - i topi sono abituati alla manipolazione e iniezione per 3 giorni, monitorando l'attività locomotoria da video tracking in un suono attenuazione camera di comportamento. Micesono poi oggetto di esperienza cocaina; una singola esposizione = esperienza cocaina acute; 5 iniezioni consecutive sono denominate esposizione cronica. Una singola iniezione seguente ≥16 giorni di astinenza da cocaina è definita una sfida cocaina. Dinamiche trascrizionali sono indirizzati a differenti tempi sperimentali seguenti esperienze cocaina (1, 2, 4, 8, 24 ore). (B) Trama del brano mouse all'interno della camera di comportamento seguente 3 giorni di iniezione salina o 3 giorni di soluzione fisiologica + un singola esposizione acuta di cocaina. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2 Ubicazione del nucleo accumbens nel cervello di topo. Linee bianche spesse segnano la posizione dei tagli definire il b oundaries del NAc (A) Sezione coronale;. (B) sezione sagittale. (Foto adattato da Allen cervello Atlas Riferimento Atlas Immagini:. http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 ; http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100.883.869 ). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3 primer Pianificazione qPCR. Linee guida per la pianificazione primer qPCR, con definizioni per specificità, stabilità e compatibilità. 2fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4 Valutazione dell'efficienza primer. (a) Risultati delle curve di amplificazione di Fos e FosB utilizzando gli array Fluidigm IFC. Una curva standard è stata generata utilizzando sette diluizioni di 3 volte seriali di RNA totale estratto da topo NAc e sondato per l'espressione di Fos e FosB. (B) L'efficienza della coppia di primer per Fos e FosB è stata valutata tracciando il valore di soglia ciclo ( Ct) ad ogni diluizione contro il logaritmo della piega diluizione del campione. L'efficienza dei primer sono calcolati dalla pendenza della curva standard, come definito nel testo. Le curve di amplificazione e punti sulla curva di diluizione sono in tinta.51642 / 51642fig4highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5 Comprehensive qPCR profiling applicando la piattaforma Fluidigm. (A) 96.96 Array dinamico IFC per Real-Time PCR quantitativa. I primer sono caricati nelle insenature situate sul lato destro, ed i campioni vengono caricati nelle insenature situate nella parte sinistra del chip. Questo dato è stato modificato con il permesso di Fluidigm Real Time PCR Analisi Guida per l'utente. Mappa (B) Il calore dei risultati qPCR, rappresenta i valori Ct per ogni bene sul chip. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6 risultati dei campioni delle dinamiche di espressione a seguito di un esposizione acuta di cocaina. Cocaina espressione indotta di c-Fos e FosB vengono visualizzati come una funzione del tempo. Medie di ripetizioni sperimentali quadruple, eseguiti secondo il protocollo definito nel presente documento, vengono visualizzate, insieme con barre di errore raffiguranti errore standard della media.

Reagente MW mM g / L
NaCl (Sigma-Aldrich, 71376) 58,44 119 6.95
NaHCO3 (Sigma-Aldrich, S6014) 84.01 26 2.18
Glucosio (Sigma-Aldrich, G8270) 180,16 10 1.8
KCl (Sigma-Aldrich, P9541) d> 74.55 2.5 0,186
NaH 2 PO 4 (Sigma-Aldrich, S9638) 137.99 1 0.138
MgSO 4 ⋅7H 2 O (Sigma-Aldrich, M1880) 246.5 4 0.99
CaCl 2 (Sigma-Aldrich, C3011) 147 4 0.59

Tabella 1 soluzione ACSF.

Nome del Software Applicazione posizione web
Roche Probefinder primer disegno http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
NCBI Primer-blast primer disegno http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
ve_content "> Tabella 2 Lista Software.

Reagente Volume / reazione (ml) Volume per 48 reazioni + 10% di eccedenza (microlitri) Volume per 96 reazioni + 10% di eccedenza (microlitri)
2X TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) 2.5 132 264
500 Nm (10 volte) miscela di primer in pool 1 52.8 105.6
Acqua 0.25 13.2 26.4
cDNA 1.25
Volume totale 5

Tabella 3 soluzione di reazione STA.

Condizione Tenere 10-14 Cicli Tenere
Temperatura 95 ° C 95 ° C 60 ° C 4 ° C
Tempo 10 min 15 sec 4 min

Tabella 4. condizioni di ciclo termico per la pre-amplificazione.

componente Per 5 microlitri del campione (ml) 48 campioni con Overage (ml) 96 campioni con Overage (ml)
Acqua 1.4 84 168
Exonuclease I Reaction Buffer 0.2 12 24
Exonuclease I a 20 unità / ml 0.4 24 48 </ Td>
Volume totale 2.0 120 240

Tabella 5 soluzione di reazione ExoI.

</ Tr>
CAMPIONE MIX Componente Volume per Inlet (ml) Volume per ingresso con Overage (ml) Volume per 48.48 Array dinamico IFC (ml) (120 campioni) Volume di 96,96 Array dinamico IFC (ml) (120 campioni)
2X SsoFast EvaGreen Supermix con bassa ROX (Bio-Rad, PN 172- 5211) 2.5 3 180 360
20X DNA Binding Dye Sample Loading reagente (Fluidigm, PN 100- 3738) tappo verde 0.25 0.3 18 36
Campione STA e ExoI trattati 2.25 2.7
Totale 5 6

Tabella soluzione Pre-Mix 6 Sample.

Tabella 7 soluzione Assay Mix.

Componente Volume per Inlet (ml) Volume per ingresso con Overage (ml) Volume per 48.48 Array dinamico IFC (ml) Volume di 96,96 Array dinamico IFC (pl)
2X Assay Loading reagente 2.5 3 180 360
Sospensione DNA 1X tampone (TE basso EDTA) 2 2.4 144 288
50 mM ciascuno mista avanti e retromarcia Primer 0.5 0.6
Volume totale 5 6
Nome del reagente / materiale Azienda Numero di catalogo
Virusol Oriek Medical J29D
Isoflurano, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy più universale Mini Kit QIAGENE 73.404
QIAshredder QIAGENE 79.654
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Invitrogene AB-4368814
TE Buffer Invitrogene 1355656

Tabella 8 Elenco dei reagenti chimici /.

Nome di attrezzature Azienda Numero di catalogo
Comportamento Camera (MDF; 50 x 45 cm) Auto assemblato
Scatola di Perspex interna (30 x 30 cm) Auto assemblato
Fotocamera e videoregistratore Campden Inst CMD-80051
Software registratore multimediale Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Forbici FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies L'Agilent 2100 Bioanalyzer
Termociclatore Bio-Rad 1852048
Spatola microspun invertito Bochem Instrument GmbH 3213
BioMark HD ReAder Fluidigm BMHD-BMKHD
Chip array dinamico per l'espressione genica 96.96 Fluidigm BMK-M-96.96

Tabella 9 Elenco delle apparecchiature.

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Discussion

Caratterizzazione di successo di espressione genica da tessuto cerebrale a seguito paradigmi comportamentali dipende da: 1) la gestione attenta dei topi durante il paradigma comportamentale; 2) dissezione rapida e precisa del tessuto di interesse; 3) misure di RNA-safe per assicurare l'integrità dell'RNA; e 4) Un'attenta pianificazione di primer e il layout sperimentale, così come la precisione e l'attenzione al dettaglio nella preparazione per l'analisi qPCR.

Lo scopo del procedimento descritto è quello di caratterizzare dinamica degli eventi trascrizionali indotti da un'esperienza comportamentale; Pertanto, particolare attenzione è necessaria per garantire che il paradigma comportamentale sperimentato dal mouse rappresenta infatti l'esperienza voluta dal ricercatore. Ad esempio, anche in un semplice paradigma come sensibilizzazione comportamentale alla cocaina, l'esperienza del mouse potrebbe essere influenzato da molti fattori confondenti: la precedente esperienza del mouse nella casa-gabbia prima della exsperi-; il metodo di trasferimento alla sala sperimentale; la luce, suono e odore esposizione nella camera sperimentale; l'esperienza di gestire dallo sperimentatore; il dolore / disagio causato dall'iniezione IP; esposizione ad un nuovo esperimento, e l'esperienza seguendo il comportamento specificato fino al punto di eutanasia. Ognuna di queste esperienze possono, in isolamento, favorire l'induzione di programmi trascrizionali in varie regioni del cervello del topo. Pertanto, la cura deve essere presa per assicurare che il programma trascrizionale misura il paradigma desiderato, e non epifenomeni associato con il paradigma. Nel caso dell'esperienza cocaina, questo è facilmente ottenibile accurata sperimentazione e attenzione al dettaglio, così come un esperimento di controllo semplice, in cui tutti i parametri sono mantenuti costanti, ma veicolo (soluzione fisiologica) viene iniettato al mouse piuttosto che cocaina. Nella nostra esperienza, l'iniezione di soluzione salina induce un programma trascrizionale di portata molto limitata in confronto aL'esposizione di cocaina, a dimostrazione che il paradigma consente schiacciante indagine dei fenomeni di interesse.

Massima cura dovrebbe essere presa per limitare la gamma delle esperienze del mouse mentre è ancora attiva, che richiede calma e attenta gestione dei topi. Al contrario, dopo l'anestesia, lavoro veloce e preciso è essenziale a causa del potenziale di rapidi cambiamenti nella rappresentazione di RNA (sulla scala temporale di minuti) e la labilità intrinseca di RNA, che potrebbe essere degradato rapidamente una volta che le cellule sono interrotti, potenzialmente interrompendo il profilo trascrizionale indotto da esperienza. E 'quindi importante rimuovere il cervello dal cranio rapidamente ad un ambiente refrigerato (entro 1-2 minuti) e rapidamente sezionare NAc in condizioni ghiacciate. Una volta che il cervello è stato raffreddato, il potenziale di cambiamenti trascrizionali o la degradazione dell'RNA sono notevolmente ridotti, ma solo quando le sezioni pertinenti sono posti in reagente Trizol e congelato, is l'integrità del tessuto e la rappresentazione del profilo trascrizionale assicurato.

In questo contesto, è opportuno ricordare che la dinamica trascrizionali di espressione immediata-precoce gene si verifica su un rapido time-scala, spesso con un picco prima di 1 ora dopo stimolazione. Nel contesto del paradigma sperimentale descritto, l'interrogazione delle dinamiche trascrizionali è limitato alla scala di ore al fine di ridurre la variabilità tra i campioni. Per tempi più breve di 1 ora, piccole variazioni della tempistica potrebbe risultare in grande variazione nella grandezza dei cambiamenti trascrizionali osservate. Pertanto il punto di tempo di 1 ora è stato scelto per l'analisi, poiché questo punto il tempo è sperimentalmente più facile da eseguire con precisione, ed è meno suscettibile di variazione a livello di una differenza di pochi minuti nell'esperimento.

Tradizionalmente, un micropunch tessuto è stato utilizzato da molti laboratori per la dissezione dei campioni di tessuto. Cisono un certo numero di motivi per preferire microdissezione manuale del tessuto. Il punzone è normalmente realizzato in acciaio inox e non è trasparente. Quindi posizionare il pugno in una posizione precisa e coerente può essere difficile. Inoltre, il punzone non consente alcuna correzione da apportare se c'era un errore nel posizionamento iniziale. Infine, l'estrazione di tessuto all'interno del punzone può a volte rivelarsi difficile, e non vi è possibilità di perdere tessuto, o trasportare-over tra i campioni. Microdissezione del tessuto utilizzando una multa bisturi permette sperimentatore controllo più preciso e fornisce sicurezza riguardanti la purezza dei campioni.

Durante l'estrazione di RNA e fino sintesi di cDNA, l'ambiente di lavoro deve essere mantenuto libero da fonti di contaminanti RNasi, e il lavoro deve essere eseguito utilizzando RNase strumenti gratuiti, monouso e reagenti. In questa fase, la più piccola contaminazione potrebbe facilmente corrompere sudati campioni di RNA. Mantenere i campioni ice freddo è fondamentale per ridurre al minimo l'attività neurale che potrebbe modificare la lettura trascrizionale, così da minimizzare l'attività enzimatica che potrebbe influenzare l'integrità del campione. Altri inibitori farmacologici sono talvolta aggiunte per ridurre l'eccitabilità neurale, ma spesso questi non sono essenziali.

In seguito a trascrizione inversa a cDNA, l'enfasi gira a garantire la validità dei risultati ottenuti dalla profilatura completa dei trascritti. Il primo passo è quello di garantire che adeguati primer qPCR sono utilizzati, per cui si consiglia vivamente di verificare l'efficienza di fondo e specificità sulle curve di diluizione di una determinata sorgente di RNA. Ottimali primer PCR forniscono amplificazione specifica ed efficiente del bersaglio. Amplificazione specifica implica che l'amplificazione è soltanto della sequenza bersaglio, evidente come picco singolo discreto in analisi della curva di fusione, mentre l'amplificazione efficiente implica che in ogni ciclo, la quantità di sequenza bersaglio èduplicato, con un'efficienza ravvicinamento 100%. A causa della natura high-throughput dei chip microfluidici qPCR, questi esperimenti richiedono un'attenta pianificazione per garantire l'inclusione di un numero significativo di controlli positivi e negativi. È preferibile includere controlli coerenti in ogni corsa di chip, consentendo confronto diretto dei risultati di controllo e alle condizioni sperimentali. Durante l'installazione dell'esperimento, è fondamentale per non contaminare i pozzi. Da piccola quantità di primer in ben sbagliata potrebbe causare l'amplificazione del target indesiderato, la cura dovrebbe essere presa quando pipettaggio primer.

Per la maggior parte dei campioni di tessuti del cervello è difficile essere certi che durante la dissezione solo il tessuto di interesse è stato estratto, senza contaminazione di regioni cerebrali irrilevanti, che potrebbe confondere l'analisi dei risultati. A tal fine, un controllo importante sta sondando per i geni la cui espressione è previsto per essere esclusi dallail tessuto di interesse. Uno strumento utile per identificare i modelli spaziali di espressione genica è l'Allen cervello Atlas ( http://www.brain-map.org/ ).

Mentre una discussione approfondita di analisi dei dati è oltre lo scopo di questa pubblicazione, si deve rilevare che un'attenta sperimentazione garantisce un'attenta analisi. È importante assicurare che un certo numero di geni di riferimento pertinenti sono incluse in ogni turno di qPCR. Questi geni serviranno per la normalizzazione al fine di garantire che i quantitativi simili di RNA sono stati dosati. La normalizzazione viene eseguita prima ai geni di riferimento all'interno del campione, e quindi ai topi di riferimento per l'esperimento ("tempo 0"), applicando il "metodo ΔΔCt".

Il protocollo descritto in questo manoscritto si propone di studiare le dinamiche di trascrizione seguente esperienza cocaina nel nucleo accumbens dei topi. Tuttavia, è molto facilmente adapted per lo studio di qualsiasi altra esperienza del mouse, finché opportuni controlli sono implementati, e la tempistica dell'esperienza è ben definito. Ovviamente, questo protocollo potrebbe anche essere attuato per lo studio della dinamica di trascrizione nei tessuti al di fuori del sistema nervoso pure.

Va sottolineato che la completa profilatura trascrizionale con sede a microfluidica qPCR è un metodo conveniente di profiling eventi trascrizionali, ma dipende dalla previa conoscenza dei geni target di interesse. Questi sono normalmente ottenuti attraverso metodi di profiling imparziali, quali microarray e sequenziamento profondo. Pertanto, nel flusso di lavoro di un grande progetto, completo di profili qPCR potrebbe fornire la maggior parte dei dati, ma preferibilmente dovrebbe seguire una preventiva caratterizzazione imparziale del sistema.

Vale anche la pena affermando che il processo descritto nel presente documento per ottenere campioni di tessuto potrebbe anche essere attuata nei confronti dello studiozione di una serie di altri eventi cellulari - proteomica e modifiche proteine, metabolomica, lipidomica e segni epigenetici.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Virusol Oriek Medical J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit QIAGEN 73404
QIAshredder QIAGEN 79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit Invitrogen AB-4368814
TE Buffer Invitrogen 1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm) Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm) Self assembled
Camera and video recorder Campden Inst. CMD-80051
Media Recorder software Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Scissors FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler Bio-Rad 1852048
Inverted microspoon spatula Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD Reader Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression Fluidigm BMK-M-96.96

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