הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד * These authors contributed equally

Immunology and Infection
 

Summary

מאמר וידאו זה מתאר את צינור התפוקה הגבוה שכבר נקבע בהצלחה להדביק ולנתח מספר גדול של עוברי דג הזברה מתן כלי רב עוצמה חדש לבדיקת מתחם וגילוי סמים באמצעות האורגניזם חוליות בעלי החיים כולה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Veneman, W. J., Marín-Juez, R., de Sonneville, J., Ordas, A., Jong-Raadsen, S., Meijer, A. H., Spaink, H. P. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), e51649, doi:10.3791/51649 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

דג הזברה הופך כלי רב ערך בשלב קליני של הקרנות גילוי סמים כמודל חיה שלמה עם אפשרויות הקרנת תפוקה גבוהה. הם יכולים לשמש כדי לגשר על הפער בין מבחני תא מבוסס בשלבים מוקדמים יותר ובאימות vivo במודלים של יונקים, צמצום, בדרך זו, מספר התרכובות שעברו לבדיקות במודלים של מכרסמים הרבה יותר יקר. לאור זאת, בכתב היד הנוכחי מתואר צינור תפוקה גבוהה חדש באמצעות דג הזברה כמערכת מודל בvivo לחקר Staphylococcus epidermidis וזיהום marinum Mycobacterium. הגדרה זו מאפשרת לדור והניתוח של מספר הגדול של עוברי סינכרוני נגוע homogenously. יתר על כן הגמישות של הצינור מאפשרת למשתמש ליישם פלטפורמות אחרות כדי לשפר את הרזולוציה של הניתוח בעת הצורך בקלות. שילוב של דג הזברה יחד עם te תפוקה גבוה החדשניchnologies פותח את תחום בדיקות סמים וגילוי לאפשרויות חדשות לא רק בגלל כוחו של שימוש במודל של בעלי חיים כולו, אלא גם בגלל המספר הגדול של קווים זמינים מהונדסים שניתן להשתמש בם כדי לפענח את אופן פעולה של תרכובות חדשות.

Introduction

עד כה דג הזברה (Danio rerio) כבר נקבע בהצלחה כמודל יעיל ללמוד מגוון רחב של מחלות זיהומיות 1. עובר דג הזברה מציע ייחודי באפשרויות ההדמיה vivo בשל השקיפות והמספר הגדול של קווי כתב מהונדסים קיימים לבטא חלבוני ניאון שלהם. שילוב רב עוצמה זה מאפשר לעקוב אחר סוגי תאים חיסוניים שונים בזמן תוך אינטראקציה עם גורמי מחלה כגון Mycobacterium marinum, יחסית הקרובים ביותר של מ ' שחפת 2, או סטפילוקוקוס epidermidis, סיבתי העיקרית לזיהום קשור ביולוגי 3-5. מסלולים שונים של זיהום ניתן להשתמש בעוברי דג הזברה בהתאם למטרות של המחקר 6.

אחד ממסלולי זיהום אלה הוא הזרקת חלמון של החיידקים. היתרון העיקרי של שיטה זו בהשוואה לאחרים הוא שinfecti החלמוןיכול להתבצע באופן אוטומטי באמצעות הזרקה רובוטית, צמצום משמעותי של זמן ההזרקה ומאפשר שחזור גבוה של הזיהום 7, 8.

עבודה קודמת, תוך שימוש בדג הזברה כתפוקה גבוהה במערכת מודל vivo ללימוד ס epidermidis ומ ' זיהום marinum הראה כדי להצליח 7, 8. מערכת זו היא מסוגלת להקרין להתקדמות מחלה באמצעות הזרקה רובוטית חלמון של עוברים מוקדמים ושימוש בקריאת נתוני הקרינה כאמצעי לעומס החיידקים. בהסכם עם הרעיון הזה, התקנה זה כבר מותאם והקימה צינור תפוקה גבוהה יעיל ביותר עם הפוטנציאל ליצירת מספר גדול של עוברים נגועים homogenously ולעקוב אחר ההתקדמות של הזיהום במהלך הזמן לאחר טיפול עם מספר רב של תרכובות. עם ההתקנה הוקמה זה אפשרי לייצר עד 8,000 עוברי סינכרוני למסךלהתקדמות מחלה, עיבוד בדרך עד 2,500 עוברים לשעה זו. עוברים מסודרים מבוססים על עומס החיידקים שלהם באמצעות מערכת אוטומטית, מה שמבטיח קבוצות הומוגניות של זחלים נגועים. יתר על כן, כדי לאמת את ההתקנה, השפעות של התייחסות הידועה כדי למנוע את התקדמות מחלת השחפת ביונקים נבדקו על עוברים נגועים במ ' זן marinum E11 או זן M הארסי יותר 9.

מחקר זה מתאר בפירוט את צינור התפוקה הגבוה שהוקם כדי להיות מסוגל לייצר מספר גדול של עוברים נגועים וניתוח בדיעבד של התקדמות החיידקים במהלך פיתוח ולאחר טיפול מתחם.

Protocol

1. זני חיידקים ותנאי גידול

  1. הכן ס epidermidis הבידוד
    1. קח כמה מושבות בודדות מס O-47 מתח epidermidis, המכיל pWVW189 נגזר וקטור mCherry ביטוי (דה בור ל 'לא פורסם) מBertani לוריא (LB) צלחת אגר בתוספת 10 מיקרוגרם / כלורמפניקול ותרבות מיליליטר הלילה בשעה 37 מעלות צלזיוס ב25 מיליליטר מדיום LB בתוספת 10 כלורמפניקול מיקרוגרם / מיליליטר לmidlog במה.
    2. צנטריפוגה 1 מיליליטר של התרבות ב12,000 XG במשך 1 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם 3x עם מי מלח 1 מיליליטר סטרילי פוספט (PBS) עם 0.3% (v / v) Tween-80.
    3. מדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD 600), ולדלל את ההשעיה החיידקים לOD 600 של 0.3 ב2% (w / v) polyvinylpyrrolidone 40 (PvP 40) ב-PBS. הערה: OD 600 של 0.3 מקבילה 1.0 x 10 8 מושבה להרכיב יחידות / מיליליטר (CFU / מיליליטר).
    4. הכן מ ' marinum הבידוד
      1. קח כמה מושבות בודדות ממ ' M זן marinum או E11 המכיל את וקטור pSMT3-mCherry יציבות להביע mCherry 10 מצלחת אגר מידלברוק 7H10 עם 10% (v / v) העשרת מידלברוק OADC תוספת 50 מיקרוגרם עם / מיליליטר hygromycin ותרבות לילה על 28 מעלות צלזיוס ב10 מיליליטר של מרק מידלברוק 7H9 עם 10% (v / v) העשרת מידלברוק ADC בתוספת hygromycin 50 מיקרוגרם / מיליליטר.
      2. צנטריפוגה 1 מיליליטר של התרבות ב12,000 XG במשך 1 דקות ולאחר מכן לשטוף אותו 3x עם 1 מיליליטר סטרילי PBS עם 0.3% (v / v) Tween-80.
      3. מדוד את OD 600, ולדלל את ההשעיה החיידקים לOD 600 של 0.3 ב2% PvP (w / v) 40 ב-PBS. הערה: OD 600 של 1 מקבילה x ל1.0 10 8 CFU / מיליליטר.

    2. הכן את דג הזברה ביצים

    1. הנח מרבי של 70 זכר ו50 ty הפראי הנשיpe דג הזברה בנפרד לתוך כלי גידול הגדול. הערה: הנח את נקבת הדג בחלקו התחתון של כלי גידול הגדול.
    2. הסר את המפריד למחרת בבוקר, כדי לאפשר לדג הזברה להתחיל רבייה.
    3. לאסוף את הביצים בחלק התחתון של כלי הרבייה הגדול באמצעות אספן הביצה בצינור 50 מיליליטר מלא במי ביצה (60 מיקרוגרם / מלח ים אוקיינוס ​​מיידי מיליליטר).

    3. מחטי הזרקה

    1. השג מחטים זמינות מסחרי מחוייט נימי זכוכית עם קוטר פנימי של 10 מיקרומטר.

    4. מתאר ניסיוני של הזרקה

    1. מרתיחים של 1% 100 מיליליטר (w / v) agarose במי ביצה, וקריר עד כ 40 º C. יוצקים agarose לתוך צלחת microinjectors האוטומטית ולמקם את חותמת 1,024 היטב לתוך agarose. הערה: הצלחת מוכנה לשימוש כאשר התקררו.
    2. בלחיצה האוטומטית microinjector ההפעלה תוכנה על 'כיול שלב',לאחר מכן לחץ על הרשת גם ''1024 ומניח את צלחת agarose בmicroinjector ולכייל את הצלחת על ידי לחיצה על המסך במיקום מרכז הבאר.
    3. עבור אל 'תפריט מחט' ולחץ על "בעל מחט לכייל".
    4. מלא את מחט הזריקה באמצעות קצה microloader עם או PvP μl 10 40 המכיל ס 100 CFU / NL epidermidis או 30 CFU / מ NL marinum, או שימוש PvP 40 כמו הזרקה מדומה.
    5. מניחים את המחט במייקרו ההזרקה האוטומטית ולכייל את x, y עמדה על ידי הפחתה או הזזת המחט והלחיצה על המסך במיקום של המחט. ואז לכייל את עמדת z של המחט על ידי לחיצה על המסך במיקום של קצה המחט.
    6. הפץ את הביצים מעל רשת agarose באמצעות pipet העברת פלסטיק, ולהסיר מים ביצה עודפים. הנח את רשת agarose בmicroinjector האוטומטי.
    7. עבור אל 'injectioתפריט n 'ולהתאים את' לחץ הזרקה 'הגדרת 200 hPa, "זמן הזרקה" 0.2 שניות ו'לחץ פיצויים 15 hPa, אשר עולה בקנה עם NL 1, בתפריט הגדרות Femtojet.
    8. לחץ על "להזריק כל 'להזריק כל הצלחת.
    9. לאסוף את הביצים לאחר הזרקה על ידי שטיפתם לתוך צלחת פטרי (92 x 16 מ"מ), עם מקסימום של 70 עובר לכל צלחת פטרי, ולדגור על 28 ° C.

    5. ניתוח זרימת cytometer

    1. הכן את זרימת חלקיקים הגדולה cytometer על פי הוראות היצרן ולמלא את הכוס מדגם ומכל נוזל נדן עם מים ביצה.
    2. בתוכנת ההפעלה, ללכת לתפריט "PMT 'ולהשתמש בהגדרות הבאות: 650 V עבור הערוץ' האדום 'ו0 V עבור' הירוק 'והערוצים' הצהוב '. ואז ללכת לתפריט "הספים 'ולהשתמש בהגדרות הבאות:' אופטיקהצפיפות l 'אות סף: 975 mV (ערך Copas XL: 50) ו'זמן מעוף של' מינימום (TOF) ל320 μsec (ערך Copas XL: 800) על מנת לצמצם את ההשפעה של פסולת.
    3. לניתוח ללא מיון העוברים עבור לשלב 5.4, לניתוח ומיון העוברים לתוך צלחת פטרי עבור לשלב 5.5 או לצורך הניתוח ומיון העוברים לתוך צלחת 96 היטב עבור לשלב 5.6.
    4. מניחים את העוברים בגביע לדוגמא ולחץ על "התחל" כדי להתחיל את הניתוח. כאשר כל העוברים מנותחים לעצור את הניתוח על ידי לחיצה על 'עצור'. לשמור את הנתונים על ידי לחיצה על 'חנות כל'. הערה: כל הנתונים מאוחסנים כקבצי TXT BSRT, LMD, DAT, CSV ו. בצע את הפרוטוקול בכל צעד של 5.7.
    5. מניחים את העוברים בגביע לדוגמא ולהגדיר את המקסימום של 70 עובר לכל צלחת להיות מסודרת על ידי הזנת 70 בתפריט 'מיון'. מניחים צלחת פטרי ריקה מתחת לסדרן ולחץ על "מיין ידני '. כאשר די פטרי sh מלא, לשמור את הנתונים על ידי לחיצה על 'חנות כל'. הערה: כל הנתונים מאוחסנים כקבצי TXT BSRT, LMD, DAT, CSV ו. בצע את הפרוטוקול בכל צעד של 5.7.
    6. מניחים את העוברים בגביע לדוגמא ולהגדיר את המקסימום של עובר 1 לכל גם להיות מסודרת על ידי הזנת 1 בתפריט 'מיון'. מניחים צלחת 96 היטב ריקה לבעל צלחת השמאל ולחץ על "מלא את הצלחת". כאשר צלחת 96 היטב מלאה, לשמור את הנתונים על ידי לחיצה על 'חנות כל'. הערה: כל הנתונים מאוחסנים כקבצי TXT BSRT, LMD, DAT, CSV ו. בצע את הפרוטוקול בכל צעד של 5.7.
    7. קבל את קובץ TXT כדי לעבד את הנתונים הגולמיים, להשתמש בהגדרות סינון הנתונים הבאות: 'מצב בחר': 40, ואם שימוש במודול מהסוג "סוג הסטטוס ':. 6 ואז להשתמש במספרים מסך הכל אות הקרינה מ'האדום 'ערוץ כדי לחשב את הממוצע וסטיית ההתקן של הממוצע. עלילה ערכות נתונים אלה לתוך גרף עמודות או פיזור.
    ve_title "> 6. טיפול התרופתי

    1. לנתח והודעה מסוג ב 3 ימי הזרקה (dpi), מ ' marinum נגוע עוברים בשתי קבוצות שווה שימוש בחלקיקים הגדולים cytometer זרימה (שלב 5.5). טיפול בקבוצה אחת עם תרכובת של עניין בממס המוביל שלה ואחרת עם ספק ממס לבד (שליטה). החל טיפולים דומים ללעוג שליטה הזריק לבדיקה לתופעות לוואי של אנטיביוטיקה.
    2. חזור על 4 ו -5 dpi הניתוח (שלב 5.5) ולרענן את המים ביצה או מים ביצה המכילים את התרכובת.

    7. הדמיה ברזולוציה גבוהה

    1. הרדימי את העוברים עם 0.02% (w / v) שנאגרו אסתר 3-aminobenzoic אתיל החומצה (Tricaine) במי ביצה 10 דקות לפני הניתוח.
    2. הכן את מערכת טכנולוגיית הקרנת חוליות אוטומטית וסמפלר החלקיקים גדול פי הוראות היצרן.
    3. בחר את תמונות ההתייחסות המתאימות לגיל של העוברים מ'הדמיה - האובייקט211; תפריט הגדרות איתור '.
    4. בחר את כמות תמונות וכיוון שבוצע במערכת הטכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית מ'הדמיה - תמונות חנות אוטומטית 'בתפריט.
    5. מניחים צלחת 96 היטב מלא בעוברים (משלב 5.6) לבעל הצלחת השמאלי של החלקיקים הדגם גדול, ולחץ על "צלחת הפעל '.
    6. כאשר עובר הוא זוהה כראוי ומיקומו; תמונת הראש והזנב בנפרד עם CLSM באמצעות מטרה רגילות יבשה 10X ולתפור את התמונות לאחר מכן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.

Representative Results

התוצאות הנוכחיות מראות כי צינור העברת נתונים הגבוה ללימודי ס epidermidis ומ ' זיהום marinum כבר נקבע בהצלחה ושניתן להארכה לדגמי זיהום אחרים. ראשית, השימוש בכלי הגדול רבייה (איור 1 א), המבוסס על המערכת שפורסמה על ידי אדטו et al. (2011) 11, מאפשר לייצר כמויות גדולות של ביצי סינכרוני באירועים בודדים והנותן שליטה גבוהה של תהליך ההשרצה. הבא כדי להיות מסוגל להזריק מספר גדול של עוברים בתקופה קצרה של זמן, גרסה משופרת של המערכת שפותחה בעבר מיקרו ההזרקה האוטומטית 7 הייתה בשימוש (איור 1 א). כדי להעריך שהיא שלב התפתחותי הטוב ביותר לזיהום חלמון, הזריקות עם ס ' epidermidis ומ ' marinum בוצע בכל השלבים השונים בין שלב תא 1 ו512, על פי התיאור שנעשה על ידי קימל et al. (1995) 12

זריקות עם 100 CFU ס epidermidis בין שלב 16 ו128 תא סיפק את דפוס הזיהום הטוב ביותר (איור 2). החיידקים התרבו בתוך החלמון במשך 3 ימים והתפשטו לתוך הגוף מ3 dpi ואילך. ביצוע זריקות לפני שלב 16 התא הוביל לתמותה גבוהה מ4 dpi, והזרקה לאחר שלב תא 256 הראה צמיחה בעיקר חיידקים בתוך החלמון עם כמעט כל חיידקים מתפשטים בתוך הגוף של העובר. כימות של נטל חיידקים בוצעה על ידי ניתוח עוצמת הקרינה באמצעות החלקיקים הגדולים cytometer זרימה כפי שתוארו על ידי ונמן et al. 8 (איור 3) (2013).

תצפיות הראו כי שלב ההתפתחות האופטימלי לזריקה של 30 מ 'CFU הזרקת marinum היא בין 16-128 שלב תא למתח E11 (איור 4 א) ובין שלב תא 16-64 עם strai M האלים יותרn (איור 4). עוברים מוזרקים בשלבים אלה הראו התפתחות חיידקים בתוך החלמון והתפשטות החיידקים דרך העובר (איור 7). הידבקות בשני הזנים בשלבים מוקדמים יותר הציגה צמיחת חיידקים כללית ספציפיות מובילה את העוברים למות אחרי 4 dpi. מצד השני, בעוברים שהוחדרו בשלבים מאוחר יותר נטל חיידקים הוגבל לחלמון.

בשלב הבא, presorting עם חלקיקים גדולים cytometer זרימה (איור 1) שנוצר קבוצות הומוגניות גדולות של דגים נגועים לא כולל עוברים שאינם נגועים או גבוה (5A דמויות ו6A). לאחר presorting, מ ' טופלו עוברים נגועים marinum עם ריפאמפיצין, תרופה נגד שחפת השורה ראשונה. מחקרים קודמים הראו כי טיפול עם ריפאמפיצין במינון של 200 מיקרומטר ביעילות מפחית מ ' זיהום marinum בדג הזברה 7, 13. לקחת advantagדואר של המספר הגדול של עוברים נגועים homogenously שנוצרו עם קצב העברת נתונים הגבוה התקנה, הטיפול עם מינונים שונים בוצעו. עוברים נגועים במ ' זן marinum M והתייחס ל48 שעות עם 12, 24, ו200 מיקרומטר ריפאמפיצין הראו כדי להפחית את הזיהום ביעילות mycobacterial באופן תלוי מינון (איור 5). לאור ההפחתה היעילה של הזיהום באמצעות ריפאמפיצין במינון של 200 מיקרומטר ריכוז זה שימש לניסויים העתידיים. בקנה אחד עם התוצאה הקודמת, לומד התקדמות נטל חיידקים באמצעות מ ' זן marinum E11 שעה הפחתת 24 משמעותית ואילך לאחר טיפול עם 200 מיקרומטר ריפאמפיצין נצפה (איור 6).

יתר על כן, אם נדרש הדמיה בהגדלה גבוהה של עוברים אלה, הם יכולים להיות מוצג באופן אוטומטי בלוחות 96 היטב (איור 1 ג), ממקום שבי ניתן לנתח הדגימות באמצעותמערכת הטכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית עם החלקיקים הדגם גדול רכוב על גבי CLSM.

מערכת הטכנולוגיה הקרנת החוליות אוטומטית עם סמפלר החלקיקים גדול היא מערכת שיכול להיות מותקן על גבי CLSM או מיקרוסקופ סטריאו. מכשיר זה מאפשר הטעינה של עובר לחיות או קבוע מצלחת 96 היטב או מיכל בתפזורת באופן אוטומטי דרך נימי זכוכית, וorientates את זה מול המצלמה בזווית הרצויה (למשל, גב או לרוחב). תמונות של העובר בכל האוריינטציות יכולות להתבצע עם המצלמה הלוח או עם CLSM חיצוני (איור 7). עוברים יהיו בהמשך הועברו במכלים המיוחדים לאיסוף או פסולת.

איור 1
איור 1. Outl ניסיוני הרגילהine. א) דגים בוגרים הם ביחד להזדווג, ביצים נאספות, מיושרת לתוך צלחת agarose ומוזרקת. ב ') הביצים מוזרקות מודגרת על 28 מעלות צלזיוס ותהיה מראש מסודרים לטיפול תרופתי אפשרי. ג) ניתוח לאחר על ידי גדול חלקיקים לזרום cytometer ו / או דגם / חוליות טכנולוגיה חלקיקים גדולות אוטומטית הקרנה עם CLSM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. הקמת שלב התא הטוב ביותר עבור ס epidermidis חלמון הזרקה. עוברי דג הזברה הוזרקו בחלמון בשלבי התפתחותיים שונים 1-512 שלב תא עימו של ס '100 CFU epidermidis. עוברים מוזרק בין 1nd 8 שלב תא הראה התפתחות חיידקים בחלמון ותמותה גבוהה מ4 dpi. עוברים מוזרק בין 16 ו128 שלב תא הראה התפתחות חיידקים בחלמון ובתוך הגוף החל מהשעה 3 dpi. עוברים מוזרק בין שלב 256 ו512 תא הראה הרבה התפתחות חיידקים בתוך החלמון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. כימות של נטל חיידקים באמצעות זרימת חלקיקים גדולה cytometer. 100 של ס 'CFU epidermidis הוזרק לתוך החלמון של עוברי דג הזברה.) עד 5 dpi, בכל יום, קבוצות של 10 עוברים היו הומוגני ומצופים באופן ישיר, המציגות את הצמיחה המעריכית הממוצעת מבוססת על שני העתקים ביולוגיים (ברים שגיאה= SEM). ב ') זרימת חלקיקים גדולה cytometer הניתוח מראה אותות הקרינה הממוצע מאינם מוזרק וס epidermidis הזריק עוברים. 30-160 עובר לכל מצב נותחו (סורגי שגיאה = SEM), אותיות שונות מצביעים על הבדלים משמעותיים סטטיסטיים בדרך אחד ANOVA ואחרי הבדיקה של Tukey שלאחר מעשה (P <0.001), NS: מתאם לא הבדלים משמעותיים C) בין CFU ו. אות הקרינה ממוצעת של קבוצות של 10 ס epidermidis נגוע עוברים (ברים שגיאה = SEM). נתון זה שונה מנמן et al. (2013) 8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. Establishment של שלב התא הטוב ביותר עבור מ ' marinum חלמון הזרקה. עוברי דג הזברה הוזרקו בכל שלבי ההתפתחות השונים 1-512 שלב תא עם 30 CFU של מ ' marinum E11 ומתח M., B) עוברים מוזרק משלב תא 1-8 הראו דומה מתפשט ותמותה עם שני הזנים.) עוברים מוזרקת בין שלב תא 16-128 עם זן E11 הראה היווצרות של גרנולומות וזיהום מערכתי תוך הזריקו אלה 256-512 שלב תא המשיך נטל חיידקים לתוך החלמון. ב ') עוברים מוזרקים בין שלב תא 16-64 עם זן M הראה היווצרות גרנולומה כמו מבנים וזיהום מערכתי ואילו אלה שהוחדרו מ128 לשלב תא 512 המשיכו נטל חיידקים לתוך החלמון . אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5 איור 5. טיפול של מ ' זיהום חריף marinum עם תרופה נגד שחפת קו ראשון. עוברים מוזרקים בין שלב תא 16-64 עם 30 CFU של מ ' זן marinum M היה לרוץ דרך החלקיקים הגדולים לזרום cytometer ב3 dpi להיות מסודר בשתי קבוצות לאחר השלכת שאינה ו / או העוברים נגועים מאוד.) הקרינה של עוברי אדם בשני הקבוצות. עוברי B) שטופלו עם ריפאמפיצין (RIF ) ל48 שעות במינונים של 12, 24, ו200 מיקרומטר נותח ב 4 dpi; עומס החיידקים שלהם מצטמצם באופן משמעותי. C) פרופילי נציג Copas של עוברי מטופלים עם DMSO וריפאמפיצין במינונים של 12, 24, ו200 מיקרומטר ל24 שעות. עומס והפצת חיידקים מצויינים על ידי הפסגות האדומות. קו כחול מייצג את הפרופיל של האלמנט מסודרים (DPF 4 דואר דג הזברהmbryo) על ידי Copas. 60-90 עובר לכל מצב נותחו. כל נקודת נתונים מייצגת עובר בודד. ערכים הם ציינו ממוצע ± SEM. NS: הבדלים לא משמעותיים. ניתוח המובהקות סטטיסטיות של הבדלים בוצע על ידי דרך אחת ANOVA ואחריו מבחן posthoc של Tukey. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. טיפול של מ ' זיהום כרוני marinum עם תרופה נגד שחפת השורה ראשונה. עוברים מוזרקים בין שלב תא 16-64 עם 30 CFU של מ ' זן marinum E11 היה לרוץ דרך זרימת חלקיקים הגדולה cytometer ב3 dpi להיות מסודר בשתי קבוצות לאחר השלכת העוברים נגועים מאוד לא ו / או. א) הקרינה של עוברי אדם בשתי הקבוצות. ב ') עוברים מטופלים עם ריפאמפיצין (RIF) ב200 מיקרומטר במהלך 4 ימים נותחו מראה הפחתה משמעותית של עומס החיידקים לאחר יום 1 של טיפול. 90 עובר לכל מצב נותחו. ערכים הם ציינו ממוצע ± SEM. אותיות שונות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין נקודות של אותו הטיפול בזמן. * מצביע על הבדלים משמעותיים בקבוצת ביקורת. NS: הבדלים לא משמעותיים. ניתוח המובהקות סטטיסטיות של הבדלים בוצע על ידי דרך אחת ANOVA ואחריו מבחן posthoc של Tukey. (P <0.05). איור ב ') שונה מSpaink et al. (2013) 13. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Src =" hres.jpg / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg "/>
איור 7. תוצאה של מ ' הזרקת חלמון marinum E11 הדמיה באמצעות טכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית וCLSM. ערימת Confocal Z (תפרה 3 תמונות) של עובר 14 5 fli1-egfp dpi. התפשטות מראה עובר בשידור חי) של מ ' חיידקי marinum E11 (אדום) בכל גוף. B) עובר fli-egfp 5 dpi קבוע מראה M. חיידקי marinum E11 (אדום) בכל הגוף שיתוף לוקליזציה עם leucocytes (תכלת) זוהה על ידי L-plastin immunostaining 15.

Discussion

המתודולוגיה התפוקה הגבוהה שתוארה במאמר זה מספקת צינור יעיל מהיר ועלות למסך מספר גבוה של עוברי דגים וזחלים עם סוגים שונים של זיהומים. שימוש בכלי הגידול הגדול במקום טנקי גידול בודדים או משפחה מסורתיים הקל על שליטה בתהליך ההשרצה ודור של מספר גדול יותר של ביצי סינכרוני. עם גרסה משופרת של מערכת מיקרו ההזרקה האוטומטית 7, ניתן להזריק עד 2,500 ביצים כמעט כולם באותו שלב התאים בתוך שעה 1. עם עדכונים אלה ותוכנה משופרת זה אפשרי להזריק יותר ביצים מאשר היה אפשרי בעבר שבו ניתן להשתמש כדי לבצע מסכי סמים גדולים עם התפשטות חיידקים כהקריאו. אולם שיטה זו עדיין מוגבלת לחלמון הזרקה, מסלולי הזרקה אחרים לדוגמא שתוארו על ידי ברנארד ואח'. (2012) 6, יהיו בתקווה להיות משולבים במערכת מיקרו ההזרקה האוטומטית בעתיד הקרוב.

<כיתת p = "jove_content"> למרות שהשיטות אלה השוותה להקרנת דג הזברה, שזה יהיה שימושי עבור יישומים עם מיני דגים אחרים גם כן. לדוגמא, קרפיון הנפוץ כבר ציין שיש יתרונות למסכים בסמים. כמו דג הזברה, ביצים ועוברים בשלב מוקדם מקרפיון הנפוץ הם שקופות, אבל עם היתרון העיקרי של גודל שרצים הגדול של מאה אלפי ביצים ואת הזמינות של קווים טהורים המציעים רקע גנטי קבוע יותר 16.

הניתוח של כמויות גדולות של עוברים נגועים נעשה עם זרם חלקיקים גדול תפוקה הגבוהה cytometer. מכשיר זה יכול למיין ניתח עוברים לתוך צלחות גם רב או צלחת פטרי שהופך אותו מתאים במיוחד לבדיקת מספרים גדולים של תרכובות. אם יש צורך בהדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, מאשר ההתקנה מותאמת באופן שזרימת חלקיקים הגדול cytometer הטכנולוגיה יכולה לשמש לטרום הקרנה ולאחר מכן לנתח את הדגימות במדיום שדרךלשים ברזולוציה גבוהה יותר. ניתן לעשות זאת באמצעות הטכנולוגיה חוליות אוטומטי הקרנת 17, 18. מכשיר זה יכול באופן אוטומטי לאסוף עובר חי או קבוע בין הודעה 2 ו -7 ימי הפריה מצלחת רב גם מיכל או בתפזורת, תמונה 360 ° דרך נימים באמצעות CLSM או מיקרוסקופ סטריאו ולהשליך שוב ב2 מכולות בתפזורת המאפשרות מיון ידני של העוברים מבוססים על התמונות מיקרוסקופיות. שיפורים עתידיים יאפשר המיון של העובר לאחר ההדמיה לתוך הצלחת גם רב, ולכן מה שמאפשר למסך באופן אוטומטי מספר הגדול של עוברים בודדים לאורך זמן עם CLSM. בהנחה שביישומים עתידיים במערכת הטכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית יכולה גם להיות מחוברת לזרימה הגדולה של חלקיקי cytometer הטכנולוגיה ללא הצורך של זחלים מחלק לפני לתוך צלחות גם רב, יוביל למיון מתקדם יותר.

מאמר זה מתאר את הקמתהאופטימיזציה של ד של התקנת תפוקה גבוהה ללמוד ס epidermidis ומ ' זיהום marinum כמודל לגילוי סמים. זה מוכיח שהתוצאה של חיידקים אלו מוזרקים לתוך החלמון תלוי בשלב ההתפתחותי של הביצים בזמן הזרקה. הזרקה מ ' marinum E11 בשלב תא 16-128 או זן M בשלב תא 16-64 מוביל לאותו דפוס הזיהום כזריקת הזנב וריד 2, 6. עם זאת הגדרה זו אינה מוגבלת להתפשטות של חיידקים פתוגנים בלבד. היא הוצגה לפני שניתן להזריק רובוט פתרונות המכילים DNA, RNA או morpholinos לtransgenesis, מחקרים על ביטוי גנים ולדפוק למטה, בהתאמה 13. יתר על כן, זה היה הראה כי התקנה זו היא גם שימושית לחקר התפשטות תאי הסרטן והגירה. לכן צינור זה מציג שיטה תכליתית למסכי תפוקה גבוהה של מגוון רחב של מנגנוני איתות בהקשרשל חסינות מולדת, הוחל למחלות זיהומיות והתפתחות הסרטן. ניתן לשלב במסכים אלה עם אחרים לגילוי תרופה אבל גם עם ניתוח של השפעות רעילות אפשריות של תרופות החלים מזוהות.

Disclosures

JS הוא הבעלים של מדעי החיים שיטות BV שמייצר מכשירים המשמשים במאמר זה.

Acknowledgements

אנו מודים ליאוני דה בור והבס Zaat (מרכז רפואי אקדמי) שספק לנו ש ' זן epidermidis O-47. אנו מודים לריקו Bongaarts, פרנסיס סמט ואנג'לה Comas (איחוד Biometrica) לעזרה וייעוץ עם XL Copas וניתוח BioImager עצום. אנו מודים לדייוי דה ויט, אולריקה Nehrdich, ולורה ואן הולסט למטפל דגים, ועמיתים אחרים מאוניברסיטת ליידן לדיונים מועילים. מחקר זה מהווה חלק מפרויקט P5.03 IBIZA של תכנית המחקר של המכון ביו חומרים, שיתוף במימון המשרד ההולנדי לענייני כלכלה, ושל התכנית החכמה המיקס (NWOA_6QY9BM) של המשרד ההולנדי לענייני כלכלה ושל משרד הולנד חינוך, תרבות והמדע. תמיכה נוספות התקבלה מהפרויקט של האיחוד האירופי ZF-בריאות (FP7-בריאות 2009-242,048), וRMJ נתמכה על ידי מלגת מארי קירי כחוקר מנוסה באיחוד האירופי ההדרכה הרשת FishForPharma (PITN-GA-201 הראשוני1-289,209). SJR זכה למימון של תרופות היוזמה המשותפת ההתחייבות חדשנית תחת n הסכם מענק ° 115337, משאבים אשר מורכבים מתרומה כספית מהתכנית של האיחוד האירופי מסגרת השביעית (FP7/2007-2013) וחברות EFPIA במחברי contribution.The סוג להכיר נוסף תמיכה כספית מקרן אוניברסיטת ליידן (LUF) לרובוטיקה ומCyttron, בסבסוד תכנית Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit, אשר בתורו נתמך כלכלית על ידי ארגון הולנד למחקר מדעי למתקני הדמיה. רכישת מערכת Copas נתמכה באופן חלקי על ידי האגף לכדור הארץ ומדעי חיים (alw) עם סיוע כספי מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO, 834.10.004).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Middlebrook 7H10 agar BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 262710
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 271310
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211886
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211887
LB agar Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L5542 Multiple suppliers
LB broth Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L3022 Multiple suppliers
Chloramphenicol Bio-connect, Huissen, the Netherlands 16785.03 Multiple suppliers
Hygromycin Bio-connect, Huissen, the Netherlands 25966.01 Multiple suppliers
Tween-80 Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA P1754 Multiple suppliers
Polyvinylpyrrolidone40 Calbiochem, San Diego, California, USA 529504 Multiple suppliers
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA A5040
Agarose Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands S103 Multiple suppliers
Instant ocean sea salt Sera Marin, Heinsberg, Germany 5460
iSPAWN Techniplast, Buguggiate, Italy iSPAWN
Automated microinjection system Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands Automated microinjection system
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA COPAS XL
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA VAST BioImager
LP Sampler Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA LP Sampler
Confocal laser scanning microscope Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SL
Injection needle 10 µm inner diameter Qvotek, Mississauga, Canada

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
  3. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
  4. Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
  5. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
  6. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (2012).
  7. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  8. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  9. Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
  10. Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
  11. Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
  12. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  13. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  14. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
  15. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  16. Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
  17. Chang, T. -Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
  18. Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics