설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화
1Institute of Biology, Leiden University, 2ZF-screens BV, 3Life Science Methods BV
* These authors contributed equally

Immunology and Infection
 

Summary

이 비디오 기사는 성공적으로 전체 동물의 척추 생물을 사용하여 복합 검사 및 약물 발견을위한 새로운 강력한 도구를 제공하는 제브라 피쉬 배아 많은 수의 감염 및 분석하기 위해 설립 된 높은 처리 파이프 라인에 대해 설명합니다.

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Veneman, W. J., Marín-Juez, R., de Sonneville, J., Ordas, A., Jong-Raadsen, S., Meijer, A. H., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), e51649, doi:10.3791/51649 (2014).

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Abstract

제브라 피쉬는 높은 처리량 검사의 가능성이있는 전체 동물 모델로 약물 발견 검사의 전임상 단계에서 유용한 도구가되고있다. 그들은 이러한 방식으로, 감소, 포유 동물 모델에서 초기 단계에서 세포 기반 분석법 간의 갭 및 생체 유효성에 해소하는 데 사용될 수 있으며, 훨씬 더 고가의 설치류 모델에서 시험에 통과하는 화합물의 개수. 이러한 관점에서, 본 원고의 표피 포도 구균의 연구와 Mycobacterium의 박테 감염에 대한 생체 내 모델 시스템으로 제브라 피쉬를 사용하여 새로운 높은 처리 파이프 라인을 설명한다. 이 설정은 동기 배아의 많은 수의 생성과 분석이 균일하게 감염 수 있습니다. 또한 파이프 라인의 유연성은 사용자가 쉽게 필요한 경우 분석의 해상도를 향상시키기 위해 다른 플랫폼을 구현할 수있다. 함께 혁신적인 높은 처리량 테와 제브라 피쉬의 조합chnologies 때문에 새로운 화합물들의 작용 모드를 해독하는데 이용 될 수있는 사용 가능한 트랜스 제닉 라인의 수가 많기 때문에 전체 동물 모델을 사용하지만의 강도뿐만 아니라 약물 테스트와 새로운 가능성을 발견의 필드를 연다.

Introduction

제브라 피쉬를 날짜에 (다니오 rerio)는 성공적으로 전염성 질환 1의 다양한 공부를 할 수있는 효율적인 모델로 설립되었습니다. 제브라 피쉬 배아는 그들의 투명성 및 형광 단백질을 발현하는 트랜스 제닉 리포터 기존 라인의 다수의 생체 촬상 가능성에 고유 구비. 이 강력한 조합은 Mycobacterium의 박테, M.의 가장 가까운 상대와 같은 병원체와 상호 작용하면서 가능한 시간에 다른 면역 세포 유형을 추적 할 수 있습니다 결핵이, 또는 표피 포도 구균, 생체 물질 관련 감염 3-5의 주요 원인. 감염의 다른 경로를 조사 (6)의 용도에 따라서는 제브라 피쉬 배아에서 사용될 수있다.

이러한 감염 경로 중 하나는 박테리아의 노른자 주입이다. 다른 사람에 비해이 방법의 주요 이점은 난황 infecti이며에 크게 분사 시간을 감소시키고 감염 7, 8의 높은 재현성있게 로봇 분사를 통해 자동으로 수행 될 수있다.

이전 작업, S.의 연구에 대한 생체 내 모델 시스템에서 높은 처리량으로 제브라 피쉬를 사용하여 표피와 M. 박테 감염은 7, 8, 성공을 보여 주었다. 이 시스템은 로봇 노른자 초기 배아의 주입 및 세균 부하 측정으로 형광 판독을 사용을 통해 질병의 진행을 선별 할 수있다. 이 개념에 동의,이 설정은 최적화 된 균일 감염된 태아의 큰 숫자를 생성 및 화합물의 번호와 치료 후 시간 동안 감염의 진행을 추적 할 수있는 잠재력을 가진 고효율의 높은 처리량의 파이프 라인을 설립되었습니다. 기존 설정으로는 화면에 8,000 동기 배아까지 생성 할 수있다질병의 진행을 위해, 시간 당 2,500 배아까지이 방식으로 처리. 태아는 감염된 유충의 동질 그룹을 확보, 자동화 된 시스템을 사용하여 세균의 부하에 따라 분류되어 있습니다. 또한, 설정을 확인하는, 포유 동물에서 결핵의 진행을 방지하는 것으로 알려져 기준의 효과는 M.에 감염된 태아에서 테스트되었습니다 박테 E11 변형 또는 더 많은 악성 M 변형 9.

이 연구는 상세히 감염된 배아 다수 개발 중에 화합물과 처리 후의 세균 진행의 후속 분석을 생성 할 수 있도록 설치되었다 높은 처리 파이프 라인을 설명한다.

Protocol

1. 균주 및 성장 조건

  1. S.에게 준비 표피 접종
    1. S.에서 여러 개의 개별 식민지를 가지고 표피의 변형 O-47, pWVW189을 함유하는 루리아 베르 타니 (LB) 25 ㎖의 LB 배지에서 37 ° C에서 밤새 10 ㎍ / ㎖의 클로람페니콜과 문화 보충 한천 플레이트 보충에서 mCherry 발현 벡터 (드 보어 L.되지 않은)을 유도 무대를 midlog에 10 ㎍ / ㎖의 클로람페니콜.
    2. 1 분 12,000 XG에이어서 문화의 원심 분리기 1 ㎖ 그들을 0.3 % (V / V) 트윈 (80) 1 ㎖ 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 3 배 씻는다.
    3. 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도를 측정하고, (W / V) 폴리 비닐 피 롤리 돈 (40) (전투 40) PBS에 2 %에서 0.3 OD 600에 세균 현탁액을 희석. 참고 : OD 600 × 108 1.0 대응 0.3의 식민지 단위 / ㎖ (CFU / ㎖)을 형성한다.
    4. M.에게 준비 박테 접종
      1. M.에서 여러 개의 개별 식민지를 가지고 박테 변형 M 또는 안정 (V / V) 미들 OADC 농축은 50 μg로 보충 / 10 ㎖의 28 ° C에서 하룻밤을 하이 그로 마이신과 문화 밀리리터 10 % 미들 7H10 한천 플레이트에서 mCherry 10을 표현 pSMT3 - mCherry 벡터를 포함 E11 50 ㎍ / ㎖의의 하이 그로 마이신과 보충 10 % (V / V) 미들 ADC 농축와 미들 7H9 국물.
      2. 1 분 12,000 XG에이어서 문화의 원심 분리기 1 ㎖는 0.3 % (V / V) 트윈 (80)와 1 ㎖ 멸균 PBS로 3 배 씻는다.
      3. OD 600을 측정하고, PBS에서 (w / v)의 전투 (40) 2 %에 OD 0.3의 600 세균 현탁액을 희석. 참고 : OD 1 대응 600 8 10 × 1.0 CFU / ㎖를.

    2. Zebrafish의 계란에게 준비

    1. 70 남성 50 여성 야생 타이의 최대 배치대형 사육 용기에 별도로 제브라 피쉬를 퍼가기. 참고 : 큰 사육 용기의 하부에 여성 물고기를 놓습니다.
    2. 제브라 피쉬의 번식을 시작할 수 있도록, 아침에 다음날 구분 기호를 제거합니다.
    3. 계란 물 (60 ㎍ / ㎖의 인스턴트 바다 소금)로 가득 찬 50 ㎖ 튜브에 계란 수집기를 통해 대규모 사육 용기의 바닥에 계란을 수집합니다.

    3. 주사 바늘

    1. 10 ㎛의 내부 지름이 상업적으로 이용 가능한 맞춤 제작 한 유리 모세관 바늘을 얻습니다.

    주입 4. 실험 개요

    1. 약 40 º C.까지 100 1 %의 ML 계란 물 (w / v) 아가로 오스, 멋진 삶아 자동 microinjectors 판에 아가로 오스 붓고 아가로 오스에 1,024 잘 스탬프를 배치합니다. 참고 : 판 냉각 할 때 사용할 수 있습니다.
    2. 에 자동 microinjector 운영 소프트웨어 클릭에 '무대를 보정',다음, '1024 '잘 그리드를 클릭하고 microinjector의 아가로 오스 플레이트를 배치하고 잘의 중심 위치에서 화면을 클릭하여 판을 보정합니다.
    3. '바늘 메뉴'로 이동하여 '보정 바늘 홀더'를 클릭합니다.
    4. 100 CFU / NL S.를 함유하는 10 ㎕의 PVP를 40도 함께 microloader 팁을 사용하는 주사 바늘을 ​​채우기 표피 또는 30 CFU / NL M. 박테, 또는 모의 주사로 사용 전투 40.
    5. 자동화 된 마이크로 인젝터에 바늘을 놓고 낮추거나 바늘을 위로 이동하고 바늘의 위치에서 화면을 클릭하여, y 위치를 X를 보정합니다. 이어서 바늘 끝의 위치에서 화면을 클릭하여 바늘의 Z 위치를 조정.
    6. 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 아가로 오스 그리드 위에 계란을 배포 및 초과 계란 물을 제거합니다. 자동 microinjector의 아가로 오스 그리드를 배치합니다.
    7. '사출 성형 및 직접 성형으로 이동N 메뉴 '와 조정'Femtojet 설정 메뉴에서, 1 NL과 상관 '200 고전력 증폭기로 설정,'사출 압력 사출 시간 '0.2 초와 보상 압력'15 고전력 증폭기를,.
    8. 전체 판을 삽입하는 '모두를 주입'을 클릭합니다.
    9. 계란을 수집 페트리 접시 당 70 배아의 최대, 페트리 접시 (92 × 16 ㎜)에 그 (것)들을 세척하고 28 ℃에서 배양하여 주입 후

    5. 플로우 사이토 분석

    1. 제조업체의 지침에 따라 사이토 큰 입자의 흐름을 준비하고 계란 물을 샘플 컵과 칼집 유체 컨테이너를 채 웁니다.
    2. 운영 소프트웨어에서, 'PMT'메뉴로 이동하여 다음과 같은 설정 사용 '녹색'과 '노란색'채널 650 '레드'채널 V와 0 V를. 그런 다음 '임계'메뉴로 이동하여 다음과 같은 설정 사용 '하기 Optica을파편의 영향을 줄이기 위해 L 밀도 '임계 신호 : 975 MV (COPAS XL 값 : 50)하고'320 마이크로 초 (800 COPAS XL 값)에 비행의 시간 '(TOF) 최소.
    3. 배아 분석을 위해, 5.4 단계로 이동 정렬과 페트리 접시에 배아를 정렬 5.5 분석 단계로 이동하고 96 - 웰 플레이트에 배아를 선별하지 않고 분석을 위해 5.6 단계로 이동합니다.
    4. 샘플 컵에 배아를 놓고 분석을 시작하려면 '시작'을 클릭합니다. 모든 배아를 분석하는 경우는 '정지'를 클릭하여 분석을 중지합니다. '모두 저장'을 클릭하여 데이터를 저장합니다. 참고 : 모든 데이터가 TXT, LMD, DAT, CSV 및 BSRT 파일로 저장됩니다. 단계 5.7 프로토콜을 따릅니다.
    5. 샘플 컵에 배아를 놓고 '정렬'메뉴에서 70를 입력하여 정렬 할 판 당 70 배아의 최대 값을 정의합니다. 분류기 아래 빈 페트리 접시를 놓고 '수동 정렬'을 클릭합니다. 때 페트리 디 쉬가 가득, '모두 저장'을 클릭하여 데이터를 저장합니다. 참고 : 모든 데이터가 TXT, LMD, DAT, CSV 및 BSRT 파일로 저장됩니다. 단계 5.7 프로토콜을 따릅니다.
    6. 샘플 컵에 배아를 놓고 '정렬'메뉴에서 1을 입력하여 정렬 할뿐만 당 1 배아의 최대 값을 정의합니다. 왼쪽 접시 홀더에 빈 96 - 웰 플레이트를 놓고 '판을 채우기'를 클릭합니다. 96 - 웰 플레이트가 작성되면, '모든 판매자'를 클릭하여 데이터를 저장한다. 참고 : 모든 데이터가 TXT, LMD, DAT, CSV 및 BSRT 파일로 저장됩니다. 단계 5.7 프로토콜을 따릅니다.
    7. '상태 선택': 다음 데이터 필터 설정을 사용하여 원시 데이터를 처리 할 수​​ TXT 파일을 받으세요. 6 그런 다음 '레드에서 총 형광 신호의 숫자를 사용합니다 (40), 및 정렬 모듈'상태 정렬 '을 사용하는 경우 평균, 평균의 표준 오차를 계산하는 '채널. 막대 또는 분산 그래프로 이러한 데이터 세트를 플롯.
    ve_title "> 6. 약물 치료

    1. 분석 및 종류의 3 일 후 분사 수 (dpi), M. 박테는 큰 입자 (단계 5.5)의 유동 세포 계측기에 동일한 두 개의 그룹으로 배아를 감염. 하나의 캐리어 용매에 대한 관심의 화합물과 그룹과 단독 용매 캐리어 (제어) 다른 치료. 항생제의 부작용에 ​​대한 테스트에 주입 제어를 조롱 비슷한 치료를 적용합니다.
    2. 4, 5 dpi로의 분석을 반복 (5.5 단계)와 달걀 물 또는 화합물을 함유 계란 물을 새로 고칩니다.

    7. 높은 해상도의 영상

    1. 0.02 %로 배아를 마취 (w / v) 분석 전에 달걀 물에 10 분 동안 3 - 아미노 벤조산 에틸 에스터 (Tricaine)을 버퍼링.
    2. 제조업체의 지침에 따라 척추 자동 선별 기술 시스템과 큰 입자 샘플러를 준비합니다.
    3. 개체 - '영상에서 배아의 나이에 해당하는 참조 이미지를 선택211; 감지 설정 '메뉴를 선택합니다.
    4. 메뉴 - '자동 저장 이미지 영상'에서 척추 자동 선별 기술 시스템에 의해 할 수있는 사진의 크기와 방향을 선택합니다.
    5. 큰 입자 샘플러의 왼쪽 플레이트 홀더에 (단계 5.6에서) 배아로 가득 찬 96 - 웰 플레이트를 배치하고 '실행 판'을 클릭합니다.
    6. 배아가 감지하고 올바르게 놓은 경우; 이미지 머리와 CLSM은 10X 일반 건조 목적을 사용하여 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 나중에 이미지를 스티치와 별도로 꼬리.

Representative Results

본 결과는 높은 처리량의 파이프 라인은 S.을 연구하는 것을 보여 표피와 M. 박테 감염이 성공적으로 설립되었습니다하고 다른 감염 모델로 확장 할 수있다. 첫째, Adatto 의해 발행 시스템에 기초 큰 사육 용기 (도 1a). (2011) (11)의 사용은, 산란 과정의 높은 제어를 수득 한 이벤트에 동기 계란의 큰 숫자를 생성 할 수있다. 이전에 개발 한 자동화 된 마이크로 분사 장치 (7)의 향상된 버전 (도 1a)를 사용하고, 단기간에 많은 수의 배아를 주입 할 수있을 다음. 노른자 감염에 대한 가장 발달 단계, S.로 주사되는 당나귀하려면 표피와 M. 박테는 킴멜 등에 의해 제 설명에있어서, (1) 및 (512) 세포 단계 사이의 모든 다른 단계에서 수행되었다. (1995) 12

100 CFU S.와 주사 표피는 16과 128 세포 단계 사이에 가장 감염 패턴 (그림 2)을 제공했다. 박테리아는 3 일 동안 노른자 내부 확산 및 이후 3 dpi로부터 몸에 퍼졌다. 256 세포 단계의 배아의 체내 확산 거의 모든 박테리아와 노른자 내에서 주로 세균의 성장을 보여준 후 16 세포 단계 전에 주사를 수행하면 4 dpi로, 사출에서 높은 사망률했다. 세균 부담 정량 비네 등에 의해 설명 된 큰 입자는 유동 세포 계측기 형광 강도 분석에 의해 수행되었다. (2013) 13 (도 3).

관찰 보여 주었다 (30) CFU M.의 주입을위한 최적의 발달 단계 박테 주입 E11 변형 (그림 4A)과 더 많은 악성 M의 strai와 16-64 세포 단계 사이에 16-128 세포 단계 사이N (그림 4B). 이 단계에서 주입 된 배아는 노른자 내부의 박테리아의 성장을 보여 배아 (그림 7)을 통해 박테리아의 확산. 이전 단계에서 두 균주 감염은 4 dpi로 후 죽을 배아를 선도하는 특이 현상이 일반화 된 박테리아의 성장을 제시했다. 한편, 이후 단계에서 주입 된 배아 세균 부담 노른자위로 제한 하였다.

다음으로, 큰 입자와 사전 정렬 (그림 1B)은 비 또는 높은 감염 배아 (도 5A6A)을 제외하고 감염된 물고기의 큰 동질 그룹을 생성 흐름 cytometer. 사전 정렬 한 후, M. 박테 감염된 태아는 리팜피신, 첫 번째 줄의 항결핵제로 치료했다. 이전 연구는 200 μM의 복용량에서 리팜피신과 치료가 효율적으로 M.를 감소 시킨다는 것을 보여 주었다 제브라 피쉬의 7, 13 박테 감염. advantag를 촬영다른 용량이 수행 된과 높은 처리량을 설치, 치료 생성 균일하게 감염 배아의 많은 수의 전자. M.에 감염된 태아 박테 M의 긴장과 12, 24, 48 시간 동안 처리하고, 200 μM 리팜피신은 용량 의존적으로 (그림 5B)에 효율적으로 마이코 박테리아 감염을 줄일 수 있었다. 이 농도는 실험에 미래에 사용 된 200 μM의 용량으로 리팜피신을 이용한 감염의 효과적인 저감의 관점에서. 이전 결과와 일치, 세균 부담의 진행을 공부하는 것은 M.를 사용하여 박테 E11 변형은 크게 감소 24 시간 이후부터는 200 μM 리팜피신과 치료 후 (그림 6B)이 관찰되었다.

고배율 촬상 이들 배아 필요한 경우 또한, 이들은 샘플 사용하여 분석 할 수있는 96 - 웰 플레이트 (도 1C)에 자동으로 표시 할 수있다큰 입자 샘플러와 척추 자동 선별 기술 시스템은 CLSM에 장착.

큰 입자 샘플러와 척추 자동 선별 기술 시스템은 하나 CLSM 또는 스테레오 현미경에 장착 할 수있는 시스템입니다. 이 장치는 자동 유리 모세관을 통해 96 - 웰 플레이트 또는 벌크 컨테이너로부터 라이브 또는 고정 배아의 로딩을 허용하고, 원하는 각도 (예를 들면, 등쪽 또는 측 방향)에서 카메라 앞에서 그것을 놓고 방향. 모든 방향에서 배아의 이미지는 보드에 카메라 또는 외부 CLSM (그림 7)로 할 수있다. 배아는 이후 수집 또는 폐기물 용기에 전송됩니다.

그림 1
그림 1. 메인 스트림 실험 어서 나와이네. 큰 별) 성인 물고기는 계란, 수집 아가 플레이트에 정렬 및 주입, 짝짓기를 함께 넣어. B)가 주입 된 계란 28 ° C에서 배양하고 가능한 약물 치료에 대한 사전 정렬됩니다. C) 후속 분석 입자가 CLSM으로 세포 계수기 및 / 또는 큰 입자 샘플러 / 척추 자동 선별 기술 흐름. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
S. 가장 세포 단계의 2. 설립도 표피 주입 노른자. 제브라 피쉬 배아 S. 100 CFU로 1 512 세포 단계에서 서로 다른 발달 단계에서 노른자에 주입했다 표피. 1 사이에 주입 배아ND 8 세포 단계 4 dpi로의 노른자와 높은 사망률에 박테리아의 성장을 보였다. 16 128 세포 단계 사이에 주입 배아는 노른자와 3 dpi로 시작되는 몸 안에 박테리아의 성장을 보였다. 256 및 512 세포 단계 사이에 주입 배아는 노른자 안에 많은 박테리아의 성장을 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
S.의 사이토 큰 입자의 흐름을 이용하여 세균 부담의 그림 3. 정량화. 100 CFU 표피는 제브라 피쉬 배아의 노른자에 주입 하였다.) 5 dpi의, 매일, 10 배아의 그룹이 두 생물 복제 (오차 막대를 기준으로 평균 기하 급수적 인 성장을 보여, 균질화 직접 도금했다분석 사이토 = SEM). B) 큰 입자의 흐름은 비 - 주입 S.에서 평균 형광 신호를 도시 표피는 배아를 주입했다. .하지 유의 한 차이 C) CFU 사이의 상관 관계 : 조건 당 30-160 배아 (오차 막대는 = SEM), 다른 문자는 ANOVA는 Tukey의 사후 테스트 (P <0.001), NS 뒤에 하나의 방법으로 통계 학적으로 유의 한 차이를 나타냅니다 분석 하였다 (10) S. 그룹의 평균 형광 신호 표피는 (오차 막대 = SEM) 배아를 감염. 이 그림은 비네 등에서 수정되었습니다. (2013) 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. EstablisM.에 가장 적합한 세포 단계의 hment 박테 노른자 주입. 제브라 피쉬 배아 M. 30 CFU로 1 512 세포 단계에서 모든 다른 발달 단계에 주입 하였다 박테 E11와 M의 변형.는, B) 배아 보여 1-8 세포 단계에서 주입 유사한 확산과 사람들은 주사하는 동안 E11 균주 육아종 및 전신 감염의 형성을 보여 주었다으로 두 균주 사망.) 태아는 16-128 세포 단계 사이에 주입 256 ~ 512 세포 단계가. B) 노른자로 세균의 부담을 보관에서 태아 512 세포 단계 128에서 분사 사람들은 노른자로 세균의 부담을 유지하면서 구조 및 전신 감염 등 육아종의 형성을 보여 주었다 M 변형으로 16-64 세포 단계 사이에 주입 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 그림 5. M. 치료 박테 급성 감염은 첫줄 항 결핵 약물. 배아 M. 30 CFU로 16-64 세포 단계 사이에 주입 박테 M의 변형은 두 그룹에서 개별 배아의 비 및 / 또는 높은 감염 배아.) ​​형광을 폐기 한 후 두 그룹으로 분류 될 수있는 3 dpi로에서의 유동 세포 계측기에 큰 입자를 통해 실행했다. B) 태아는 리팜피신 (RIF로 치료 ) 12, 24, 200 μM이 4 dpi로에서 분석 하였다 투여 48 시간 동안; 자신의 세균 부하가 크게. C에게) 대표 COPAS (12), (24)의 복용에 DMSO와 리팜피신 처리 배아의 프로필 및 24 시간 200 μM을 줄일 수있다. 세균 하중 분포는 빨간색 피크로 표시됩니다. 블루 라인은 제브라 피쉬 전자 DPF 정렬 된 요소의 프로필 (4를 나타냅니다mbryo) COPAS로. 조건 당 60 ~ 90 배아를 분석 하였다. 각 데이터 포인트는 개별 배아를 나타낸다. ± SEM 의미로 값이 표시됩니다. NS : 유의하지 차이. 차이의 통계적 유의성 분석은 ANOVA는 Tukey의 posthoc 테스트 뒤에 하나의 방법에 의해 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6. M. 치료 박테 만성 감염은 첫 번째 줄의 결핵 약물. 배아 M. 30 CFU로 16-64 세포 단계 사이에 주입 박테 E11 균주 비 및 / 또는 높은 감염 배아를 폐기 한 후 두 그룹으로 분류 될 수있는 3 dpi 해상도에서 사이토 큰 입자의 흐름을 통해 실행되었습니다. A) 두 그룹에서 개별 배아의 형광. B) 사일 동안 200 μM에서 리팜피신 (RIF)으로 처리 태아가 치료의 일일 후 세균 부하의 상당한 감소를 보여 분석 하였다. 조건 당 90 배아를 분석 하였다. ± SEM 의미로 값이 표시됩니다. 다른 문자는 같은 치료의 시점 사이에 유의 한 차이를 나타냅니다. * 대조군과 유의 한 차이를 나타냅니다. NS : 유의하지 차이. 차이의 통계적 유의성 분석은 ANOVA는 Tukey의 posthoc 테스트 뒤에 하나의 방법에 의해 수행되었다. (P <0.05). 그림 B)가 Spaink 등에서 수정되었습니다. (2013) 13. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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M.의 그림 7. 결과 박테 E11 노른자 주입 척추 자동 선별 기술 및 CLSM을 사용하여 몇 군데. 5 dpi로 fli1-EGFP 14 배 (3 이미지를 손바느질) 공 촛점 Z 스택을. M.의) 라이브 배아 보여주는 확산 몸. B에 걸쳐 박테 E11 박테리아 (빨간색)) M.를 나타내는 고정 5 dpi로 FLI-EGFP 배아 몸 전체 박테 E11 박테리아 (빨간색) 백혈구 L-plastin 15을 면역 염색에 의해 감지 (밝은 파란색)와 공동 지역화.

Discussion

이 문서에 설명 된 처리량이 방법은 감염의 다른 종류의 물고기 배아 및 유충의 높은 숫자를 화면에 빠르고 비용 효율적인 파이프 라인을 제공합니다. 대신 기존의 단일 또는 가족 사육 탱크의 대규모 사육 용기를 사용하여 산란 과정의 제어와 동기 계란의 많은 수의 생성을 촉진. 자동화 된 마이크로 주입 시스템 (7)의 향상된 버전으로, 1 시간 이내에 동일 세포 단계에서 거의 모든 2500 알을 주입하는 것이 가능하다. 이러한 업데이트와 향상된 소프트웨어와 읽기 아웃으로 세균의 증식에 큰 마약 스크린을 수행 할 수 있습니다 이전보다 더 많은 알을 주입 가능하다. 그러나이 방법은 여전히 주입, 버나드 등으로 설명 예를 들어, 다른 주사 경로를 노른자로 제한됩니다. (2012) 6, 잘하면 조만간 자동화 마이크로 주입 시스템에 통합 될 것이다.

<이러한 방법은 제브라 피쉬를 스크리닝 벤치마킹하고 있지만 P 클래스 = "jove_content">, 그것은뿐만 아니라 다른 물고기 종의 응용 프로그램에 유용 할 것이다. 예를 들어, 잉어 약물 스크린의 장점을 갖도록 지시되었다. 제브라 피쉬와 마찬가지로, 계란, 잉어에서 초기 단계의 배아는 투명하지만 백 계란의 수천보다 일정한 유전 적 배경 (16)를 제공 근친 라인의 가용성의 대형 알 크기의 주요 이점이다.

감염된 태아의 많은 양의 분석은 사이토 높은 처리량 큰 입자의 흐름으로 이루어집니다. 이 장치는 종류의 멀티 웰 플레이트 또는 화합물의 큰 숫자를 테스트하기에 특히 적합하다 페트리 접시에 배아를 분석 할 수 있습니다. 높은 영상 해상도가 필요한 경우, 셋업이 기술 사이토 큰 입자 흐름이 사전 스크리닝에 사용될 수있는 방식으로 구성된 연속적 통해 매체에서 샘플을 분석하는 것보다높은 해상도로했습니다. 이것은 척추 자동 스크리닝 기술 (17, 18)을 사용하여 수행 할 수있다. 이 장치는 자동으로 멀티 웰 플레이트 또는 대량 컨테이너, 이미지 CLSM 또는 스테레오 현미경을 사용하여 모세 혈관을 통해 360 °에서 2 7 일 포스트 수정과 라이브 또는 고정 배아를 수집하고 기반 배아의 수동 분류를 허용하는 2 벌크 용기에 다시 처리 할 수​​ 있습니다 현미경 이미지에. 미래의 개선 때문에 가능 CLSM으로 시간이 지남에 따라 개별 배아의 자동 다수의 화면으로 만들기, 멀티 웰 플레이트에 이미징 후 배아의 선별을 허용합니다. 미래의 응용 프로그램에서 척추 자동 선별 기술 또한이 시스템은 멀티 웰 플레이트에 앞서 분배 애벌레의 필요없이 기술 사이토 큰 입자의 흐름으로 연결될 수 있다고 가정하면, 더 고급 정렬로 이어​​질 것입니다.

이 논문은 설립에 대해 설명합니다S.을 연구하는 높은 처리량 설정의 D 최적화 표피와 M. 약물 발견을위한 모델로 박테 감염. 그것은 노른자 주입이 박테리아의 결과가 사출시 계란의 발달 단계에 의존한다는 것을 보여준다. M. 주입 16-128 세포 단계 또는 16-64 세포 단계에서의 M의 변형에서 박테 E11는 꼬리 정맥 주사 2, 6과 같은 감염 패턴에 이르게한다. 그러나 이러한 설정은 세균성 병원균의 증식에 한정되지 않는다. 그것은 그것이 로봇을 각각 13 일, 과다 발현과 유전자 노크 다운 연구를 형질 전환을위한 DNA, RNA 또는 morpholinos와 포함 된 용액을 주입하는 것이 가능하다는 것을 이전에 표시했다. 또한,이 설정은 또한 암 세포의 증식과 이동의 연구에 유용 것으로 나타났다. 따라서이 파이프 라인은 컨텍스트 신호 다양한 메커니즘의 높은 처리량 스크린을위한 다양한 방법을 제시선천성 면역의, 전염성 질환과 암의 개발에 적용. 이 화면은 약 발견을위한 다른 사람과뿐만 아니라 확인 된 해당 약물의 가능한 독성 효과의 분석과 결합 될 수있다.

Disclosures

JS는이 문서에서 사용되는 악기를 생산하는 생명 과학 방법 BV의 소유자입니다.

Acknowledgements

우리는 S. 우리를 제공 레오니 드 보어와 바스 Zaat (대학 의료 센터)에 감사드립니다 표피 O-47의 변형. 우리는 COPAS XL과 VAST BioImager 분석에 대한 도움과 조언 리코 Bongaarts, 프랜시스 멧 안젤라 코마스 (연합 Biometrica을) 감사합니다. 우리는 물고기 보살 피는, 그리고 도움이 토론 라이덴 대학에서 다른 동료 데이비 드 위트, 울리 케 Nehrdich, 로라 반 Hulst에서 감사합니다. 이 연구는 생물 의학 재료 연구소, 경제 업무의 네덜란드 교육부가 공동으로 재정 지원의 연구 프로그램의 프로젝트 P5.03 IBIZA의 일부를 형성하고, 경제 업무의 네덜란드 내각의 스마트 믹스 프로그램 (NWOA_6QY9BM)과의 교육, 문화, 과학의 네덜란드 교육부. 추가 지원은 유럽 연합 (EU) 프로젝트 ZF-건강 (FP7 - 건강 - 2009-242048)에서 얻은 및 RMJ는 유럽 연합 (EU) 초기 교육 네트워크 FishForPharma (PITN-GA-201의 숙련 된 연구원으로 마리 퀴리 친교​​에 의해 지원되었다1-289209). SJR은 115337 ° 부여 계약 N에서 혁신적인 의약품 이니셔티브 공동 Undertaking에 자금 지원을받은 자원있는 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013) 및 종류 contribution.The 저자의 EFPIA 회사 추가 인정의 재정적 기여로 구성되어 있습니다 로봇 공학의 라이덴 대학 기금 (LUF)로부터 Cyttron에서 재정 지원을 차례로 재정적 이미징 시설에 대한 과학적 연구에 대한 네덜란드기구에 의해 지원되는 Besluit 보조금 Investeringen Kennisinfrastructuur 프로그램에서. COPAS 시스템 인수는 부분적으로 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO, 834.10.004)에서 재정 지원과 함께 지구와 생명 과학 (ALW)의 구분에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Middlebrook 7H10 agar BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 262710
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 271310
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211886
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211887
LB agar Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L5542 Multiple suppliers
LB broth Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L3022 Multiple suppliers
Chloramphenicol Bio-connect, Huissen, the Netherlands 16785.03 Multiple suppliers
Hygromycin Bio-connect, Huissen, the Netherlands 25966.01 Multiple suppliers
Tween-80 Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA P1754 Multiple suppliers
Polyvinylpyrrolidone40 Calbiochem, San Diego, California, USA 529504 Multiple suppliers
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA A5040
Agarose Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands S103 Multiple suppliers
Instant ocean sea salt Sera Marin, Heinsberg, Germany 5460
iSPAWN Techniplast, Buguggiate, Italy iSPAWN
Automated microinjection system Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands Automated microinjection system
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA COPAS XL
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA VAST BioImager
LP Sampler Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA LP Sampler
Confocal laser scanning microscope Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SL
Injection needle 10 µm inner diameter Qvotek, Mississauga, Canada

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References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
  3. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
  4. Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
  5. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
  6. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (2012).
  7. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  8. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  9. Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
  10. Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
  11. Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
  12. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  13. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  14. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
  15. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  16. Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
  17. Chang, T. -Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
  18. Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).

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