الناجم عن العلاج الكيميائي الأوعية الدموية سمية - في الوقت الحقيقي

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bar-Joseph, H., Stemmer, S. M., Tsarfaty, I., Shalgi, R., Ben-Aharon, I. Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment. J. Vis. Exp. (95), e51650, doi:10.3791/51650 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

فئات معينة من العلاجات الكيميائية قد تمارس التغيرات الوعائية الحادة التي قد تقدم في الظروف الطويلة الأجل التي قد يؤهب للمريض إلى زيادة خطر الإصابة بالأمراض الوعائية. بعد، وإن كانت الأدلة السريرية تصاعد، وهناك ندرة في الدراسات واضحة من سمية الأوعية الدموية، وبالتالي فإن مسببات مجموعة غير متجانسة من الأوعية الدموية / اضطرابات القلب والأوعية الدموية ويبقى أن توضيح. وعلاوة على ذلك، يمكن للآلية التي قد تكمن وراء سمية الوعائية تختلف تماما عن المبادئ التي يسببها العلاج الكيميائي عضلة القلب، والذي يرتبط لتوجيه الإصابة العضلية. أنشأنا في الوقت الحقيقي، في الجسم الحي منصة التصوير الجزيئي لتقييم سمية الوعائية الحادة المحتملة من العلاجات المضادة للسرطان.

أنشأنا منصة للفي الجسم الحي، وارتفاع القرار التصوير الجزيئي في الفئران، ومناسبة لتصور الأوعية الدموية داخل أجهزة المحصورة وBLO المرجعيةسفن التطوير التنظيمي داخل نفس الأفراد في حين أن كل فرد بمثابة سيطرتها. وقد ضعف جدران الأوعية الدموية بعد تناوله دوكسوروبيسين، وهو ما يمثل آلية فريدة من سمية الأوعية الدموية التي قد يكون الحدث في وقت مبكر من الإصابة نهاية الجهاز. هنا، يتم وصف طريقة فيبيريد متحد البؤر المجهري الفلورسنت (FCFM) التصوير مقرها، والذي يوفر طريقة مبتكرة لفهم الظواهر الفسيولوجية على الصعيدين الخلوية وشبه الخلوية في المواد الحيوانية.

Introduction

الأدلة السريرية تشير إلى أن عدة أصناف من العلاجات الكيميائية تثير مجموعة متنوعة من أمراض الأوعية الدموية يتجلى في ظاهرة رينو، ارتفاع ضغط الدم، myocardialinfarction، هجوم الدماغية، والكبد VENO-occlusivedisease 1،2. "المخدرات" العرضي "المضادة للعائية" هو مصطلح جديد إلى حد ما، والذي يصف وكلاء العلاج الكيميائي التقليدي التي تكون بمثابة مثبطات تكوين الأوعية الدموية الممكنة، على الرغم من أنها لم توضع أصلا لهذا الغرض 3-5 ولكن تهدف إلى القضاء على الخلايا السرطانية عن طريق فرض اقل من "الضمانات الضرر "للخلايا الطبيعية ممكن 3. وقد تضمنت عدة الكيميائي كما vasculo-المواد السامة كما لوحظ في الدراسات السريرية باستخدام المؤشرات الحيوية في الدم. ومن بين هذه مؤلكل وكلاء (مثل سيكلوفوسفاميد)، ومركبات البلاتين (مثل السيسبلاتين) وanthracyclines 1،2،5-7.

قد تحدث مضاعفات القلب والأوعية الدموية الحادة باعتباره بالنتيجهر سمية الأوعية الدموية الناجم عن العلاج الكيميائي. ويجوز لهم التقدم في الحالات المزمنة مثل تصلب الشرايين والحساب لزيادة خطر الإصابة بالأمراض أواخر الأوعية الدموية. ومع ذلك، ورغم تزايد الأدلة السريرية، هناك ندرة في الدراسات المعينة التأكيد على آلية السمية الأوعية الدموية، وبالتالي، هناك ما يبرر المزيد من التوضيح من التسبب المحدد الذي تخلفه.

ويتمثل التحدي الرئيسي في الكشف عن آلية الناجم عن العلاج الكيميائي سمية الأوعية الدموية مستمد من تعقيد التحقيق وظيفة الأوعية الدموية في الجسم الحي. وصفنا هنا منصة عالية الدقة في الجسم الحي التصوير الجزيئي في الفئران التي تمكن من التقاط تدفق الدم وخصائص السفن. هذه المنصة تسهل الكشف عن الآثار التي يسببها العلاج الأوعية الدموية المباشرة: في الوقت الحقيقي، وكذلك الالتزام بالتعليمات على مدى فترة من الوقت داخل نفس الأفراد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي. وكانت رعاية الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. وتم إيواء في مكيفة الهواء، وعلى ضوء سيطرة مرافق الحيوان كلية ساكلر للطب في جامعة تل أبيب، ICR إناث الفئران (30 ز - - 25 7 8 أسابيع من العمر). في المدى، الموت الرحيم كانت الحيوانات مع جرعة زائدة من التخدير.

1. Fibred متحد البؤر مضان المجهر (FCFM) معايرة

  1. تشغيل الجهاز ON.
  2. ربط مجهري (mini0 / 30).
  3. معايرة الجهاز وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

2. الفئران التحضير للتصوير

  1. تخدير عن طريق حقن تحت الجلد كل Ketaset (100 ملغ / كلغ) وXYL-M2 (6 ملغ / كلغ). تأكيد التخدير المناسبة التي تجاوب إلى أخمص القدمين قرصة.
  2. شق الجلد تحت الفخذ وذلك ل تكشف الأوعية الشريانية الفخذ. الحفاظ على موقع شق رطبة مع المياه المالحة التالية شق.
  3. تسخين ذيل باستخدام حقيبة (أو قفاز) مملوءة بالماء الدافئ (وليس الساخن جدا للمس) لحوالي 30 ثانية. إعداد الوريد (IV) تحويلة لإدارة FITC ديكستران (وكيل النقيض) وإما مالحة أو وكيل العلاج الكيميائي، من خلال إدخال إبرة (30 G، 1/2 بوصة) في الوريد الذيل وربط حقنة 1 مل إليها . ضمان الوريد مفتوح عن طريق حقن محلول ملحي.
    ملاحظة: إن الإدارة الرابع من FITC ديكستران (عالية الوزن الجزيئي؛ 100 ميكرولتر، و 10 ملغ / مل، 2،000 كيلو دالتون) يسهل تصور الأوعية الدموية الدقيقة الفخذ التي كتبها FCFM. دوكسوروبيسين (100 ميكرولتر و 8 ملغ / كغ، أدرياميسين) أيضا أو المالحة أن تدار في وقت لاحق IV في الوريد ذيل قبل ساخنة.
  4. ضع الماوس supinely على خشبة المسرح البوليسترين. تأمين الماوس إلى سادة والحفاظ على مركزها الجراحي باستخدام شريط لاصق.
عنوان "> 3. التصوير الأوعية الدموية الفخذ التي كتبها FCFM وخلال وبعد إدارة دوكسوروبيسين أو المالحة

ملاحظة: المجهر متحد البؤر فيبيريد المستخدمة في هذه الدراسة يتكون من وحدتين: (1) مجهري (mini0 / 30). (2) وحدة المسح بالليزر (LSU-488، 488 نانومتر الطول الموجي).

  1. أداء جميع لفات الوقت يحلل باستخدام LSU 488 نانومتر طول الموجة الليزر.
    ملاحظة: للكشف عن وحدة الرئيسي بالكشف عن تصفيتها (500-650 نانومتر) المنبعثة مضان. وأعيد بناؤها الصور المكتسبة بعد ذلك وعرضها بمعدل 12 لقطة / ثانية.
  2. قطع بعناية المحقنة من الإبرة ونعلق حقنة جديدة تحتوي على FITC ديكستران. إدارة (IV) 100 ميكرولتر من FITC ديكستران.
  3. تحويل مجهري (mini0 / 30) إلى حقل مناسبة لعرض ويحملق فيه، عقب التعديل إلى المحور z، من أجل الحصول على صورة المقابلة. انتظر إشارة أولية إلى أن تتلاشى حتى إشارة واضحة ومركزة هي فيزيبلي.
  4. تسجيل تدفق الدم الأساسي لفترة استقرار قصيرة (~ 30 ثانية). قم بتوصيل إلى إبرة حقنة أخرى، تحتوي إما دوكسوروبيسين أو المالحة. IV إدارة 100 ميكرولتر دوكسوروبيسين أو المالحة.
  5. رصد تدفق حقن FITC-ديكستران بشكل مستمر لمدة 20 دقيقة. على البرنامج المصاحب FCFM، استخدم زر قطر على المسطرة العلوي من أجل قياس الأوعية الدموية وتصنيفها صغيرة مثل (<15 ميكرون) أو كبيرة (> 15 ميكرون).
  6. الموت ببطء الحيوان مع التخدير جرعة زائدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في التصوير المستمر الجسم الحي في الوقت الحقيقي

جهاز التصوير المستخدمة هنا هي عالية الوضوح، المجهر متحد البؤر فيبيريد، ومجهزة مع التحقيق الذي تجريه التي تمكن التصور من الأوعية الدموية واستجابته للمؤثرات المختلفة، والعلاج الكيميائي. هذا الأسلوب هو الغازية الحد الأدنى منذ الرغم من أنها قد تسهل تصوير الأوعية العميقة أو الجهاز، فإنه يتطلب شق صغير للتحقيق. تتكون حزم التحقيق من عشرات الآلاف من الألياف، والبصريات المجهر وموصل الدقة الملكية. ويرد التمثيل التخطيطي في الشكل 1.

تصوير الأوعية الدموية الدقيقة الفخذ

لقد صنفت شبكة الفخذ الأوعية الدموية الدم وفقا للسفن القطر (صغير <15 ميكرون، كبيرة> 15 ميكرون) من خلال FCFM في الفئران المحقونة مع FITC-ديكستران. وكان المستحث - (5 دقائق 2) من السفن الصغيرة التي دوكسوروبيسين وتضيق الأوعية السريع. وdisappearan الكاملم من الفلورسنت FITC-ديكستران، 8 دقائق بعد العلاج دوكسوروبيسين (الشكل 2A على سبيل المثال، والسهام، فيديو 1). في العديد من الفئران، والحد من إشارة الفلورسنت في الأوعية الدموية وزيادة إشارة لها وحظ المحيطة في المنطقة المحيطة بالأوعية، وبضع ثوان بعد تناوله دوكسوروبيسين (الشكل 2B ز، والسهام). وتشير هذه النتائج إلى أن زيادة في نفوذية الأوعية والتسرب من ارتفاع الجزيئي ديكستران الوزن من الأوعية الدموية إلى الأنسجة المحيطة بها. وكانت أي إشارة واضحة مضان التالية إدارة دوكسوروبيسين في الفئران التي لم تحقن في السابق مع FITC-ديكستران. أظهرت الفئران المعالجة باكليتاكسيل سفن مماثلة هيكل الدم ومعدل تدفق لتلك التي لوحظت في الفئران حقن محلول ملحي (لا يظهر)، طوال فترة القياس.

الشكل (1)
الشكل 1. FCFM المجهر متحد البؤر المستخدمة هنا يتكون من وحدتين: ومجهري (mini0 / 30) وحدة المسح الضوئي ليزر (LSU-488، 488 نانومتر الطول الموجي).

الشكل 2
الشكل 2. صور FITC-ديكستران إشارة مضان في الأوعية الدموية الدقيقة الفخذ. سفن صنفت بتفرع ثنائي لقاصر (<15 ميكرون) أو الكبرى (> 15 ميكرون) وفقا لعيار بهم. الأوعية الدموية الدقيقة الفخذ من FITC ديكستران (100 ميكرولتر، و 10 ملغ / مل). حقن الفئران تم تصويرها قبل وأثناء إدارة IV إما دوكسوروبيسين أو المالحة (A) والسفن الصغيرة، تصوير كتبها FCFM، بدأ vasoconstricting تماما 2 دقيقة بعد تناوله دوكسوروبيسين (و ، السهم)، مما يدل على تضييق المستمر للإشارة الفلورسنت حتى اختفائها كاملة، مع عدم وجود انتعاش واضح للإشارة أثناء نتحويلة ثماني دقائق من التصوير في الوقت الحقيقي (ز، السهم). (ب) المظهر، في بعض لقطات من منطقة "ضبابية" حول جدران الأوعية الدموية من الفئران حقن العلاج الكيميائي (ز السهم) مباشرة بعد الحقن، ويشير المحتملين تسرب ديكستران-FITC. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1. التصوير الأوعية الدموية الدقيقة الفخذ. بتصوير ممثل فيلم قاصر الفلورسنت FITC-ديكستران (<15 ميكرون في القطر) الأوعية الدموية. المبيض والفخذ الوقت الأوعية الدموية الدقيقة فات التصوير الفوتوغرافي: الفئران المحقونة مع 100 ميكرولتر FITC-ديكستران (10 ملغ / مل) تم تصويرها وتصويرها من لحظة الإدارة الرابع من دوكسوروبيسين. 2-5 دقيقة بعد حقن دوكسوروبيسين، وأظهرت السفن الصغيرة تضيق الأوعية الدرامي تليها إلغاء كامل للإشارة الفلورسنت، وبالفعل 8 دقيقة بعد المعاملهر. (AVI) الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقييم الناجم عن العلاج الكيميائي سمية الأوعية الدموية يمثل تحديا بسبب صعوبة في تصور ديناميات الأوعية الدموية في استجابة لمحفزات في الوقت الحقيقي. وقد تورط العديد من الدراسات السريرية أن العديد من العلاجات الكيميائية تسبب إصابة الأوعية الدموية مباشرة، ولكن يبقى آلية وخصائص هذه السمية إلى توضيح. أنشأنا في الوقت الحقيقي، في الجسم الحي منصة التصوير الجزيئي لتقييم سمية الأوعية الدموية المحتملة من العلاج الكيميائي في الفئران التي تتألف من فيبيريد المجهري الفلورسنت مبائر كما هو موضح هنا 8-10. هذا التصوير الجزيئي عالية الدقة من الفئران مناسب لتصور تدفق الدم في الشرايين والهندسة المعمارية السفن. فإنه يمكن الكشف في الوقت الحقيقي من المضاعفات الناجمة عن العلاج في نفس الحيوان على مدى فترة طويلة من الزمن. قمنا بتقييم فئتين من الكيميائي: دوكسوروبيسين الذي يعرف أن تكون سامة للخلايا البطانية في المختبر وكذلك في الأنسجةق تم الحصول عليها من الحيوانات تعامل مع دوكسوروبيسين 10-15، وباكليتاكسيل باعتباره العلاج الكيميائي التحكم الذي الأدلة السابق للأي تأثير الأوعية الدموية محدودة للغاية.

ليزر تكنولوجيا المسح الضوئي مبائر من FCFM يسهل تتبع الأنسجة مصبوغ مضان عميقة في الوقت الحقيقي، وتنتج الوقت الفاصل بين صور الفيديو من الأوعية الدموية في الجسم الحي 9. في دراستنا كان يستخدم FCFM لمراقبة تأثير الأوعية الدموية الحاد في دوكسوروبيسين، كعامل النموذج سام للأوعية. كان هذا التأثير، والتي بدأت بعد وقت قصير من إدارة دوكسوروبيسين، يعتمد على حجم الأوعية الدموية: أصغر قطر والسفن، وأكثر بروزا الضرر. إشارة مضان من ذات القطر الصغير (<15 ميكرون) السفن تضاءلت تدريجيا نتيجة لانقباض الأوعية المستمر الناجم عن دوكسوروبيسين. تم الكشف عن أي انتعاش واضح خلال دقيقة و 8 القادم من التصوير في الوقت الحقيقي. قطر كبير (> 15 ميكرون) كانت السفن أقل التالفة. سلامةالجدار من كان يثير الشبهة، واظهار سطح غير منتظم. وكانت هذه الآثار الفريدة لدوكسوروبيسين ولم تكن واضحة عندما استخدمت باكليتاكسيل، مشيرا إلى أن هذه المنهجية ترسم بدقة تأثير معين من الدواء.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

في جميع أنحاء البروتوكول، قد يتم تغيير قوة الليزر أثناء التسجيل خط الأساس من أجل توضيح السفن. ومع ذلك، لا يجب تغيير قوة الليزر أثناء التجربة. وبالإضافة إلى ذلك، قوة الليزر عالية قد التبييض وكيل مضان خلال الوقت. بالإضافة إلى ذلك، بمجرد الانتهاء من التسجيل، فمن الممكن تغيير النقيض من الفيلم وتعديل طوله والسرعة. القياسات من السفن قد ثم يتم ويمكن اتباعها التغييرات التي تحدث.

القيود المفروضة على هذه التقنية والخطوات الحاسمة

الجهاز FCMF لديها عدد قليل من القيود. المنطقة ذات الاهتمام (ROI) قد تتغير خلالفي وقت التصوير. بالإضافة إلى ذلك، فإن المنطقة تصويرها قد تجف. ينبغي للمرء أن إبقاء المنطقة رطبة. وكيل مضان قد التبييض وسيتم فقدان الإشارة. واحد خطوة حاسمة واحدة ينبغي إيلاء الاهتمام لهي للحفاظ على الحيوانات والتحقيق ثابتة بشكل جيد لتجنب التغيرات في العائد على الاستثمار.

أهمية والمستقبلية التطبيقات

منصة تجريبية أنشئت قد تكون بمثابة اختبار فوري للاستجابة للعلاج الكيميائي أو بدلا من ذلك كعلامة البيولوجية المحتملة لتوصيف المحتملين الشخصى سمية الأوعية الدموية. استنادا إلى آلية درس من ضعف الأوعية الدموية، ويمكن أيضا أن تكون طريقة مفيدة في المستقبل لتقييم وكلاء المحتمل المحدد للحد من سمية الأوعية الدموية الناجم عن العلاج الكيميائي. الحاجة إلى تقليل مضاعفات الأوعية الدموية المحتملة على المدى الطويل في الناجيات من سرطان يدفع لنا لاستكشاف آلية وراء الناجم عن العلاج الكيميائي سمية الأوعية الدموية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
general anesthesia Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2
depilatory cream (Veet) ReckittBenckiser, Bristol, UK
30 G, 1/2 inch needle attached to 1 ml syringe
FITC dextran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) Sigma FD2000S 100 μl volume
Doxorubicin Teva, Israel 8 mg/kg, Adriamycin
paclitaxel Taro, Israel 1.2 mg/kg, Medexel
saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chow, A. Y., et al. Anthracyclines cause endothelial injury in pediatric cancer patients: a pilot study. J Clin Oncol. 24, (6), 925-928 (2006).
  2. Nuver, J., et al. Acute chemotherapy-induced cardiovascular changes in patients with testicular cancer. J Clin Oncol. 23, (36), 9130-9137 (2005).
  3. Vos, F. Y., et al. Endothelial cell effects of cytotoxics: balance between desired and unwanted effects. Cancer Treat Rev. 30, (6), 495-513 (2004).
  4. Kerbel, R. S., et al. 'Accidental' anti-angiogenic drugs. anti-oncogene directed signal transduction inhibitors and conventional chemotherapeutic agents as examples.Eur. J Cancer. 36, (10), 1248-1257 (2000).
  5. Soultati, A., et al. Endothelial vascular toxicity from chemotherapeutic agents: preclinical evidence and clinical implications. Cancer Treat Rev. 38, (5), 473-483 (2012).
  6. Tempelhoff, G. F., et al. Blood coagulation during adjuvant epirubicin/cyclophosphamide chemotherapy in patients with primary operable breast cancer. J Clin Oncol. 14, (9), 2560-2568 (1996).
  7. Ben Aharon, I., et al. Doxorubicin-induced vascular toxicity--targeting potential pathways may reduce procoagulant activity. PLoS One. 8, (9), e7515 (2013).
  8. Laemmel, E., et al. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41, (5), 400-411 (2004).
  9. Al-Gubory, K. H., Houdebine, L. M. In vivo imaging of green fluorescent protein-expressing cells in transgenic animals using fibred confocal fluorescence microscopy. Eur J Cell Biol. 85, (8), 837-845 (2006).
  10. Bar-Joseph, H., et al. In vivo bioimaging as a novel strategy to detect doxorubicin-induced damage to gonadal blood vessels. PLoS One. 6, (9), e23492 (2011).
  11. Kaushal, V., Kaushal, G. P., Mehta, P. Differential toxicity of anthracyclines on cultured endothelial cells. Endothelium. 11, (5-6), 253-258 (2004).
  12. Kim, E. J., et al. Doxorubicin-induced platelet cytotoxicity: a new contributory factor for doxorubicin-mediated thrombocytopenia. J Thromb Haemost. 7, (7), 1172-1183 (2009).
  13. Walsh, J., Wheeler, H. R., Geczy, C. L. Modulation of tissue factor on human monocytes by cisplatin and adriamycin. Br J Haematol. 81, (4), 480-488 (1992).
  14. Kotamraju, S., et al. Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species. J Biol Chem. 275, (43), 33585-33592 (2000).
  15. Vasquez-Vivar, J., et al. Endothelial nitric oxide synthase-dependent superoxide generation from adriamycin. Biochemistry. 36, (38), 11293-11297 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics