화학 요법에 의한 혈관 독성 - 실시간

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Bar-Joseph, H., Stemmer, S. M., Tsarfaty, I., Shalgi, R., Ben-Aharon, I. Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment. J. Vis. Exp. (95), e51650, doi:10.3791/51650 (2015).

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Abstract

화학 요법은 특정 부류의 병적 혈관의 증가 된 위험에 걸리기 쉬운 환자 수 장기적인 상태로 진행​​할 수있다 급성 혈관 변화를 가할 수있다. 그러나, 장착 임상 증거에도 불구하고, 혈관 독성 때문에 혈관 / 심혈관 질환의 이종 그룹의 원인의 명확한 연구의 소수는 밝혀지지 남아있다. 또한, 혈관 독성의 기초가있다 메커니즘은 완전히 심근 손상을 유도하는 관련된 화학 요법 - 유도 심독성의 원리와 다를 수있다. 우리는 항암 치료의 잠재적 급성 혈관 독성을 평가하는 생체 분자 이미징 플랫폼에서 실시간을 확립했다.

우리는 적절한 밀폐 된 기관 및 참조 BLO 내 혈관을 시각화 생체, 마우스의 고해상도 분자 영상의 플랫폼을 설정 한각 개별 반면 같은 개인 내 외경 선박은 자체 제어 역할을합니다. 혈관벽 최종 장기 손상을 조기 이벤트가 될 수있다 혈관 독성을 나타내는 고유기구, 독소루비신 투여 후 손상되었다. 여기서, 다발, 공 초점 형광 현미경 (FCFM) 기반 이미징의 방법은 동물 피험자에서 세포 및 세포 이하 수준에서의 생리 현상을 이해하기 위해 혁신적인 모드를 제공하는 설명한다.

Introduction

임상 증거는 화학 요법의 여러 클래스가 레이노 현상, 고혈압, myocardialinfarction, 뇌 혈관 공격, 간성 veno-occlusivedisease 1, 2에 의해 나타난 혈관 병변의 다양성을 이끌어내는 것을 나타냅니다. 그들은 원래 이러한 목적 3-5으로 개발되지만 적게 부과함으로써 종양 세포를 제거하도록 설계되지는 않았지만 " '사고'항 혈관 형성 약제"는 "담보 가능한 혈관 신생 억제제로서 작용 종래의 화학 요법 제에 대해 설명 신종 용어이며 가능한 3과 정상 세포의 손상 ". 혈청 바이오 마커를 사용하여 임상 연구에서 관찰 된 여러 화학 요법은 vasculo - 독성 물질로 암시되고있다. 이 중 에이전트 (예 : 시클로 포스 파 미드 등), 백금 (시스플라틴 등) 화합물 및 안트라 사이클린 1,2,5-7 알킬화된다.

급성 심장 혈관 합병증은 resul로 발생할 수 있습니다화학 요법에 의해 유도 된 혈관 독성 t. 그들은 늦게 혈관 사망률의 위험이 증가 동맥 경화 및 계정 등의 만성 질환으로 발전 할 수 있습니다. 그러나 임상 적 증거를 장착에도 불구하고, 혈관 독성의 메카니즘을 강조 지정된 연구가 소수이므로, 그들은 입힐 정확한 병인의 추가 해명이 보증된다.

화학 요법에 의한 혈관 독성의 메커니즘을 밝히는데 중요한 과제는 생체 내에서 혈관 기능을 조사의 복잡성에서 유래. 우리는 본원에서 혈류 및 혈관 '특성을 포착 할 수 있도록 마우스에서 생체 분자 이미징에 대한 고해상도의 플랫폼을 설명한다. 이 플랫폼은 직접 유도 혈관 치료 효과의 검출을 용이하게한다 : 실시간뿐만 동일인 내의 일정 기간 동안 이들을 다음과 같이.

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Protocol

윤리 문 : 모든 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 동물 보호는 제도적 지침에 따라이었다. (- 8 주 오래 된 7; 25-30g) ICR 여성 마우스는 텔 아비브 대학에서 의학 학부 Sackler의 에어컨, 조명 제어 동물 시설에 수용되었다. 용어에서, 동물은 마취 과다 복용으로 안락사시켰다.

1. 섬유질의 공 초점 형광 현미경 (FCFM) 교정

  1. 장치를 켜십시오.
  2. 마이크로 탐침 (mini0이 / 30)을 연결합니다.
  3. 제조업체의 지시에 따라 교정 장치.

2. 마우스 이미징을위한 준비

  1. 모두 Ketaset (100 ㎎ / ㎏)과 XYL-M2 (6 ㎎ / ㎏)의 피하 주사에 의해 마취. 발가락 핀치에 응답하지 않는 문제로 적절한 마취를 확인합니다.
  2. 순서에 사타구니 아래 피부를 절개 대퇴 동맥 혈관을 알 수있다. 절개 다음 식염수 촉촉한 절개 사이트를 유지합니다.
  3. 약 30 초 동안 따뜻한 물 (너무 뜨겁지 않은 터치)로 가득 찬 가방 (또는 장갑)를 사용하여 꼬리를 가열. 식염수 또는 화학 요법 제 중 하나의 꼬리 정맥에 주사 바늘 (30 G, 1/2 인치)를 삽입하고 여기에 1 ML의 주사기를 부착하여 FITC 덱스 트란 (조영제)의 관리를위한 정맥 주사 (IV) 션트를 준비하고 . 정맥은 식염수를 주입하여 열려 있는지 확인하십시오.
    참고 : FITC 덱스 트란의 IV 관리 (고 분자량 100 ㎕의 10 ㎎을 / ㎖, 2000 kDa의)이 FCFM에 의한 대퇴 미세 혈관을 시각화 용이. 독소루비신 (100 μL; 8 ㎎ / kg, 아드리아 마이신) 또는 염수 나중에 예열 꼬리 정맥으로 IV 투여 될 것이다.
  4. 폴리스티렌 무대에 드러 마우스를 놓습니다. 패드에 마우스를 안전하고 수술 덕트 테이프를 사용하여 위치를 유지한다.
동안과 독소루비신 또는 식염수를 투여 한 후 FCFM에 의한 대퇴 혈관의 제목 "> 3. 영상

참고 : (1) 마이크로 탐침 (mini0이 / 30) :이 연구에 사용 된 다발, 공 초점 현미경은 두 개의 유닛으로 구성되어있다. (2) 레이저 스캐닝 유닛 (LSU-488; 488 nm 파장).

  1. LSU 488 nm 파장의 레이저를 이용하여 분석 모든 시간 바퀴를 수행합니다.
    참고 : 본체 검출기는 여과 감지 (500-650 nm의) 방출 형광을. 획득 된 이미지는 이후 재구성 / 초 12 프레임의 속도로 표시됩니다.
  2. 조심스럽게 바늘의 주사기를 분리하고 FITC 덱스 트란을 포함하는 새로운 주사기를 연결합니다. FITC 덱스 트란의 (IV) 100 μl를 관리합니다.
  3. 대응하는 화상을 얻기 위해서, Z 축 조정 다음에, 뷰 필드에 적합한 마이크로 프로브 (mini0 / 30)를 시프트하고 흥분시키는. 명확하고 초점을 맞춘 신호가 VISI 때까지 페이드 초기 신호를 기다립니다BLE.
  4. 짧은 안정화 기간 (~ 30 초)에 대한 기준선 혈액의 흐름을 기록합니다. 그런 다음 독소루비신 또는 식염수를 포함, 바늘에 다른 주사기를 연결합니다. IV 100 μL 독소루비신 또는 식염수를 관리 할 수​​ 있습니다.
  5. 20 분 동안 연속적으로 주입 FITC 덱스 트란의 흐름을 모니터링한다. FCFM 관련된 소프트웨어를, 혈관을 측정하기 위해 상부에 눈금자 직경 버튼을 사용하여 분류하고 그들 작은 (<15㎛ 인) 또는 큰 (> ~ 15㎛).
  6. 마취 과다 복용으로 동물을 안락사.

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Representative Results

실시간 생체 내 이미징 연속

여기에 사용되는 촬상 장치는, 혈관계의 시각화 및 화학 요법과 같은 다양한 자극에 대한 응답을 가능하게 장착 된 프로브 고화질, 다발, 공 초점 현미경이다. 깊숙히 혈관 또는 기관의 영상을 용이하게 할 수 있지만,이 프로브 작은 절개를 필요로하기 때문에이 방법은 침습적이다. 프로브 번들은 수십 섬유, 현미경 광학 및 독점 정밀 커넥터의 수천으로 구성되어 있습니다. 개략도는도 1에 도시된다.

대퇴 미세 혈관의 영상

우리는 혈관 직경에 따라 대퇴 혈액 혈관의 네트워크를 분류했다 (작은 <15 μm의; 큰> 15 μm의) FCFM에 의해 FITC-덱스 트란 주입 쥐. 급격한 혈관 수축 - 소형 선박 (2 5 분) 독소루비신에 의해 유도했다. 전체 disappearanFITC-덱스 트란 형광의 CE, 8 분 후 독소루비신 치료 (그림 2A 예를 들면, 화살표, 비디오 1). 몇몇 마우스에서, 혈관에서 형광 신호가 감소와 혈관 주위 영역, 독소루비신 투여 후 수 초 (도 2B의 g, 화살표)에서 관찰되었다 둘러싼 신호를 증가시킨다. 이러한 결과는 주변 조직에 혈관에서 고 분자량 덱스 트란의 혈관 투과성의 증가와 누출을 나타낸다. 형광 신호는 FITC-덱스 트란과 이전에 주입되지 않은 쥐에서 독소루비신의 투여 분명 없었다. 파클리탁셀 처리 된 마우스는 유사 혈관 구조를 입증 및 측정 기간에 걸쳐, 생리 식염수가 주입 된 마우스 (도시 생략)에서 관찰되는 것에 유속.

그림 1/>도 1 FCFM 개의 유니트로 구성된다 여기서 사용 된 공 초점 현미경 : 마이크로 프로브 (mini0 / 30) 및 레이저 스캐닝 유닛 (LSU-488; 488 nm 파장)..

그림 2
그림 2. 대퇴부 미세 혈관에 FITC-덱스 트란 형광 신호의 이미지. 선박이 dichotomously (<15 μm의 또는 주요 마이너)로 분류되었다 (> 15 μm의) 자신의 구경에 따라. FITC 덱스 트란 대퇴 미세 혈관계 (100 μL, 10 ㎎ / ㎖). (A) FCFM 의해 촬상 부 혈관, 마우스 전과 독소루비신 또는 식염수 중의 IV 투여시에 이미징 된 주입 2 분 독소루비신 투여 후 급격 vasoconstricting 시작 (F 상기 N 중 신호없이 복구 명백한 회복, 완전한 소멸까지 형광 신호의 연속 좁아 게재) 화살표EXT 실시간 영상 (g, 화살표) 여덟 분 거리. (B)는 외관, 어떤 스냅 샷에 바로 주입 후 화학 요법 주입 된 마우스 (g 화살표)의 혈관 벽의 주위에 "불투명"영역의 전위를 나타내는 덱스 트란-FITC 누설. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1. 대퇴 미세 혈관 이미징. 담당자가 FITC - 덱스 트란 형광 작은 (직경 <15 μm의) 혈관의 필름을 촬영했다. 100 μL FITC - 덱스 트란 (10 ㎎ / ㎖)를 주입 한 쥐 이미징 및 독소루비신의 IV 관리의 순간에서 촬영되었다 : 난소 및 대퇴 미세 혈관 시간은 사진을 겹쳐지는. 2 - 독소루비신 주입 후 5 분, 작은 용기는 형광 신호의 완전한 폐지, 이미 treatmen 후 8 분 뒤에 극적인 혈관 수축을 보였다t. (AVI)는 이 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

화학 요법 - 유도 된 혈관 독성을 평가하기 때문에 실시간으로 자극에 반응하여 혈관의 역학을 시각화하는 어려움에 도전. 수많은 임상 연구는 여러 가지 화학 요법 직접 혈관 손상을 일으킬 것으로 연루, 아직이 독성의 메커니즘과 특성은 밝혀지지 남아있다. 우리는 여기에 8 ~ 10 설명 된 바와 같이 다발, 공 초점 형광 현미경으로 구성된 마우스에서 화학 요법의 잠재적 인 혈관 독성을 평가하기위한 생체 분자 이미징 플랫폼, 실시간를 설립했다. 이 마우스의 고해상도 분자 이미징 동맥 혈류 및 혈관 '구조를 시각화하기에 적합하다. 또한 장기간에 걸쳐 동일한 동물에서 치료 합병증 유발 실시간으로 검출 할 수있다. 조직뿐 아니라 공지 된 독소루비신이 시험관 내에서 내피 세포에 유독 할 수있는 우리는 두 종류의 화학 요법을 평가어떠한 혈관 효과 전 증거 매우 제한되는 제어 화학 요법 10-15 독소루비신 및 파클리탁셀로 처리 된 동물로부터 얻은 s는.

FCFM의 레이저 스캐닝 공 초점 기술은 실시간으로 형광 염색 깊은 조직을 추적 ​​및 생체 9 혈관의 시간 경과 비디오 이미지를 생성 촉진한다. 우리의 연구에서 FCFM는 원형 vasculotoxic 제로서 독소루비신 급성 혈관 효과를 관찰 하였다. 곧 독소루비신 투여 후에 시작이 효과는 혈관의 크기에 의존했다 : 작은 혈관 '직경보다 중요한 손상. 작은 직경의 형광 신호는 (<15 μm의) 혈관 독소루비신에 의한 지속적인 혈관 수축의 결과로서 점진적으로 감소. 명백한 회복 실시간 이미징 다음 8 분 동안 검출되지 않았다. 큰 직경 (> 15 μm의) 선박이 덜 손상되었다; 무결성그 벽의 불규칙한 표면을 전시, 손상되었다. 이러한 효과는 독소루비신에 고유이었고,이 방법은 꼼꼼하게 약물의 특정 효과를 묘사 것을 나타내는, 파클리탁셀 (paclitaxel)을 사용 하였다하지 않을 때 분명했다.

수정 및 문제 해결

프로토콜 동안, 레이저 파워는 혈관을 설명하기 위해서 기준선 기록 중에 변경 될 수있다. 단, 레이저 파워는 실험 기간 동안 변경되지 않아야. 또한, 높은 레이저 파워 시간 동안 형광 표백제 에이전트 것이다. 기록이 완료되면 또한, 그것은 영화의 콘트라스트를 변경하고 그 길이 및 속도를 편집 할 수있다. 선박의 측정은 다음 이루어질 수 있으며 발생하는 변경 사항은 다음에 할 수있다.

기술과 중요한 단계의 한계

FCMF 장치는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 관심 (ROI)의 지역 동안 변경 될 수 있습니다촬상 시간. 또한, 몇 군데 지역은 건조 있습니다; 하나는 수화 영역을 유지해야합니다. 형광 에이전트는 표백 수 있으며 신호가 손실됩니다. 하나에주의를해야 하나 중요한 단계는 동물과 잘 ROI의 변경을 방지하기 위해 고정 된 프로브를 유지하는 것입니다.

의의 및 향후 응용 프로그램

설립 실험 플랫폼은 화학 요법 또는 다른 잠재적 인 혈관 독성 프로파일을 특성화 할 수있는 잠재적 인 생물학적 지표로 응답을 즉시 검사로 역할을 할 수있다. 혈관 손상의 연구기구에 기초하여, 방법은 또한 잠재적 제제를 평가 미래에 유용 화학 요법에 의해 유도 된 혈관 독성을 감소시킬 수 지정. 암 생존자의 잠재적 인 장기 혈관 합병증을 감소 할 필요는 화학 요법에 의한 혈관 독성 뒤에 메커니즘을 탐구하는 우리를 구동한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
general anesthesia Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2
depilatory cream (Veet) ReckittBenckiser, Bristol, UK
30 G, 1/2 inch needle attached to 1 ml syringe
FITC dextran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) Sigma FD2000S 100 μl volume
Doxorubicin Teva, Israel 8 mg/kg, Adriamycin
paclitaxel Taro, Israel 1.2 mg/kg, Medexel
saline

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