Chemioterapia-indotta vascolare Tossicità - in tempo reale

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Bar-Joseph, H., Stemmer, S. M., Tsarfaty, I., Shalgi, R., Ben-Aharon, I. Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment. J. Vis. Exp. (95), e51650, doi:10.3791/51650 (2015).

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Abstract

Alcune classi di chemioterapie possono esercitare cambiamenti vascolari acute che possono progredire in condizioni a lungo termine che possono predisporre il paziente ad un aumentato rischio di morbilità vascolare. Tuttavia, anche se l'evidenza clinica di montaggio, vi è una scarsità di chiare studi di tossicità vascolare e quindi l'eziologia di un gruppo eterogeneo di vascolari / disturbi cardiovascolari rimane da chiarire. Inoltre, il meccanismo che può essere alla base della tossicità vascolare può completamente differire dai principi di cardiotossicità indotta da chemioterapia, che è in relazione diretta pregiudizio miociti. Abbiamo stabilito un tempo reale, in vivo piattaforma di imaging molecolare per valutare la potenziale tossicità acuta vascolare di terapie anti-cancro.

Abbiamo creato una piattaforma di in vivo, imaging molecolare ad alta risoluzione nei topi, adatto per la visualizzazione di vasi all'interno di organi ristretti e blo riferimentood navi comprese negli stessi individui, mentre ogni singolo servono come proprio controllo. Pareti dei vasi sanguigni sono stati danneggiati dopo la somministrazione di doxorubicina, che rappresenta un meccanismo unico di tossicità vascolare che può essere il precoce evento lesioni d'organo. Qui, il metodo di microscopia confocale a fluorescenza (FCFM) di imaging basato fibrata è descritto, che fornisce un modo innovativo per comprendere i fenomeni fisiologici a livello cellulare e sub-cellulari in soggetti animali.

Introduction

Evidenze cliniche indicano che diverse classi di chemioterapie stimolano una varietà di patologie vascolari si manifestano con fenomeno di Raynaud, ipertensione, myocardialinfarction, attacco cerebrovascolare, ed epatica veno-occlusivedisease 1,2. "Farmaci anti-angiogenetici 'accidentale'" è abbastanza nuovo termine, che descrive agenti chemioterapici convenzionali che agiscono come possibili inibitori dell'angiogenesi, anche se non originariamente sviluppati per questo scopo 3-5 ma progettati per eliminare le cellule tumorali imponendo come poco "garanzia danno "alle cellule normali come possibile 3. Diversi chemioterapie sono state implicita come vasculo-sostanze tossiche come osservato negli studi clinici utilizzando biomarcatori sierici. Tra questi sono agenti (quali ciclofosfamide), composti del platino (cisplatino) come e antracicline 1,2,5-7 alchilante.

Complicanze cardiovascolari acute possono verificarsi come Result della tossicità vascolare indotta da chemioterapia. Essi possono progredire in condizioni croniche come l'aterosclerosi e rappresentano il maggior rischio di morbilità vascolare tardi. Eppure, nonostante il montaggio evidenza clinica, vi è una scarsità di studi designati sottolineando il meccanismo di tossicità vascolare e quindi, un'ulteriore delucidazione della patogenesi esatta che infliggono è garantito.

Una sfida importante nel rivelare il meccanismo di tossicità vascolare indotta da chemioterapia deriva dalla complessità di indagare funzione vascolare in vivo. Descriviamo qui una piattaforma ad alta risoluzione in imaging molecolare in vivo nei topi che permette di catturare il flusso di sangue e le caratteristiche delle navi. Questa piattaforma facilita il rilevamento di effetti diretti trattamento indotta vascolari: in tempo reale, nonché loro dopo un periodo di tempo entro gli stessi individui.

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Protocol

Dichiarazione etica: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale. Cura degli animali è stato secondo le linee guida istituzionali. Topi ICR femminile (7 - 8 settimane di vita; 25 - 30 g) sono stati ospitato in aria condizionata, controllata di luce strutture di animali della Facoltà di Medicina Sackler a Tel-Aviv University. Al termine, gli animali sono stati sacrificati con overdose anestesia.

1. fibrato confocale microscopia a fluorescenza (FCFM) Calibration

  1. Accendere il dispositivo.
  2. Collegare la microsonda (mini0 / 30).
  3. Calibrare il dispositivo secondo le istruzioni del produttore.

2. Mice Preparazione Imaging

  1. Anestetizzare da una iniezione sottocutanea di entrambi Ketaset (100 mg / kg) e XYL-M2 (6 mg / kg). Verificare il corretto anestesia da insensibilità ai piedi-pizzico.
  2. Incidere la pelle sotto l'inguine, al fine di rivelare i vasi arteriosi femorali. Mantenere il sito umido con soluzione fisiologica incisione dopo incisione.
  3. Riscaldare la coda utilizzando un sacchetto (o un guanto) riempita con acqua calda (non troppo caldo al tatto) per circa 30 sec. Preparare un (IV) shunt endovenosa per la somministrazione di destrano FITC (un agente di contrasto) e di una soluzione fisiologica o agente chemioterapico, inserendo un ago (30 G, 1/2 pollice) nella vena della coda e collegamento di una siringa da 1 ml a esso . Assicurarsi che la vena è aperto iniettando soluzione fisiologica.
    NOTA: Un'amministrazione IV di FITC destrano (alto peso molecolare, 100 ml, 10 mg / ml; 2.000 kDa) facilita la visualizzazione del microcircolo femorale da FCFM. Doxorubicina (100 ml; 8 mg / kg, Adriamicina) o soluzione salina saranno successivamente somministrati IV nella vena della coda pre-riscaldato.
  4. Posizionare il mouse supinamente su un palco di polistirolo. Fissare il mouse pad e mantenere la posizione con nastro adesivo chirurgico.
title "> 3. Imaging di femorali vasi sanguigni di FCFM durante e dopo la somministrazione di doxorubicina o Saline

NOTA: Il microscopio confocale fibered utilizzato in questo studio è composto da due unità: (1) microsonda (mini0 / 30). (2) unità di scansione laser (LSU-488; 488 nm di lunghezza d'onda).

  1. Eseguire tutti i time-giri analisi con il nm laser LSU 488.
    NOTA: Il rivelatore unità principale rileva il filtrato (500-650 nm) fluorescenza emessa. Le immagini acquisite vengono ricostruite dopo e visualizzate ad una velocità di 12 fotogrammi / sec.
  2. Staccare con attenzione la siringa dall'ago e collegare un nuovo siringa contenente FITC destrano. Somministrare (IV) 100 ml di destrano FITC.
  3. Spostare la microsonda (mini0 / 30) per un campo di vista adeguato e fissare, seguendo adeguamento l'asse z, in modo da ottenere l'immagine corrispondente. Attendere il segnale iniziale a svanire fino a quando un segnale chiaro e focalizzato è visible.
  4. Registrazione di un flusso di sangue al basale per un periodo di stabilizzazione a breve (~ 30 sec). Collegare quindi l'ago della siringa un'altra, contenente doxorubicina o soluzione salina. IV amministrare 100 microlitri doxorubicina o soluzione salina.
  5. Monitorare il flusso di iniezione FITC-destrano continuamente per 20 min. Sul software FCFM-associato, utilizzare il pulsante di diametro sul righello superiore al fine di misurare i vasi sanguigni e classificare come piccole (<15 micron) o grande (> 15 micron).
  6. Euthanize l'animale con overdose anestesia.

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Representative Results

In vivo Imaging continua in tempo reale

L'apparecchiatura di imaging qui utilizzato è ad alta definizione, microscopio confocale fibrata, equipaggiato con una sonda che consente la visualizzazione della vascolarizzazione e la sua risposta a vari stimoli la chemioterapia. Questo metodo è minimamente invasiva poiché sebbene possa facilitare l'imaging di navi profonde o organo, esso richiede una piccola incisione per la sonda. I fasci sonda costituite da decine di migliaia di fibre ottiche, microscopio e un connettore di precisione proprietario. Una rappresentazione schematica è mostrato in Figura 1.

Imaging di microcircolo femorale

Abbiamo classificato la rete di femorale vascolarizzazione sangue secondo vasi di diametro (piccolo <15 micron; grande> 15 micron) per FCFM in topi iniettati con FITC-destrano. A vasocostrizione rapida (2 - 5 min) dei piccoli vasi è stata indotta da doxorubicina. A disappearan completoce la fluorescenza FITC-destrano, 8 min trattamento post doxorubicina (Figura 2A ad esempio, frecce; Video 1). In diversi topi, la riduzione del segnale fluorescente del vaso sanguigno e il segnale dei suoi dintorni è stata osservata nella regione perivascolare, pochi secondi dopo la somministrazione doxorubicina (Figura 2B g, frecce) aumentare. Questi risultati indicano che aumento permeabilità vasale e perdite di elevato peso molecolare destrano dal vaso sanguigno ai tessuti circostanti. Nessun segnale di fluorescenza era evidente dopo la somministrazione di doxorubicina nei topi che non sono stati iniettati in precedenza con FITC-destrano. Topi trattati con paclitaxel dimostrato simile struttura dei vasi sanguigni e portata a quelli osservati nei topi soluzione salina iniettata (non mostrato), per tutto il periodo di misura.

Figura 1
Figura 1. Il FCFM Il microscopio confocale qui utilizzato è composto da due unità: la microsonda (mini0 / 30) e l'unità di scansione laser (LSU-488; 488 nm)..

Figura 2
Figura 2. Immagini di segnale di fluorescenza FITC-destrano nel microcircolo femorale. Le navi sono state classificate per dicotomicamente minore (<15 micron) o maggiore (> 15 micron) in base al loro calibro. Microcircolo femorale di FITC destrano (100 ml; 10 mg / ml). Iniettato topi è stato ripreso prima e durante la somministrazione endovenosa di doxorubicina o soluzione salina (A) Le navi minori, ripresi dal FCFM, iniziato vasocostrittori acutamente 2 minuti dopo la somministrazione di doxorubicina (f , freccia), che mostra un restringimento continua del segnale fluorescente fino alla sua completa scomparsa, senza recupero apparente recupero del segnale durante la next otto minuti l'imaging in tempo reale (g, freccia). (B) Aspetto, in alcune istantanee, di una zona "nebuloso" attorno ai vasi sanguigni pareti di topi chemioterapia iniettata (g freccia) immediatamente dopo l'iniezione, indica un potenziale perdita Dextran-FITC. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Video 1. femorale immagini microcircolo. Un rappresentante fotografato film minore fluorescenti FITC-destrano (<15 micron di diametro) vasi sanguigni. Tempo microcircolo ovarica e femorale lambisce fotografia: topi iniettati con 100 microlitri FITC-destrano (10 mg / ml) sono stati ripresi e fotografati dal momento della somministrazione endovenosa di doxorubicina. 2-5 minuti dopo l'iniezione di doxorubicina, navi minori mostrato vasocostrizione drammatica seguita da una completa abolizione del segnale fluorescente, già 8 minuti dopo treatment. (AVI) Clicca qui per vedere il video.

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Discussion

Valutare tossicità vascolare indotta da chemioterapia è difficile a causa della difficoltà nel visualizzare la dinamica del sistema vascolare in risposta ad una stimoli in tempo reale. Numerosi studi clinici hanno implicato che diverse chemioterapie causano danno vascolare diretta, ma il meccanismo e le caratteristiche di questa tossicità resta da chiarire. Abbiamo stabilito un tempo reale, in vivo piattaforma di imaging molecolare per valutare la potenziale tossicità vascolare della chemioterapia in topi composto di microscopia a fluorescenza confocale fibrata come qui descritto 8-10. Questo imaging molecolare ad alta risoluzione di topi è adatto per la visualizzazione flusso di sangue arterioso e architettura vasi. Esso consente il rilevamento in tempo reale di complicazioni trattamento indotte nello stesso animale per un periodo prolungato di tempo. Abbiamo valutato due classi di chemioterapici: doxorubicina che è conosciuto per essere tossico per le cellule endoteliali in vitro e in tessutoS ottenuto da animali trattati con doxorubicina 10-15, e paclitaxel come la chemioterapia di controllo per cui la prima evidenza di effetti vascolari è molto limitata.

Il laser scanning tecnologia confocale di FCFM facilita tracciare profonde tessuti fluorescenza tinto in tempo reale e produce immagini video time-lapse di vasi sanguigni in vivo 9. Nel nostro studio FCFM stato usato per osservare l'effetto acuto vascolare di doxorubicina, come agente prototipo vasculotoxic. Questo effetto, iniziata poco dopo la somministrazione doxorubicina, dipendeva dimensioni vasi sanguigni: il diametro minore vasi, tanto più prominente il danno. Il segnale di fluorescenza di piccolo diametro (<15 micron) navi diminuita gradualmente come risultato di navi costante costrizione causata da doxorubicina. Nessuna recupero apparente è stato rilevato durante il successivo 8 min di immagini in tempo reale. Di grande diametro (> 15 micron) le navi erano meno danneggiati; l'integritàdella loro parete è stata compromessa, esibendo una superficie irregolare. Questi effetti erano uniche alla doxorubicina e non erano evidenti quando paclitaxel è stato utilizzato, indicando che questa metodologia delinea meticolosamente l'effetto specifico del farmaco.

Modifiche e risoluzione dei problemi

Durante il protocollo, la potenza del laser può essere modificato durante la registrazione di base per illustrare i vasi. Tuttavia, potenza del laser non deve essere modificata durante l'esperimento. Inoltre, una potenza laser elevato potrebbe candeggiare l'agente di fluorescenza nel tempo. Inoltre, una volta terminata la registrazione, è possibile modificare il contrasto del film e per modificare la lunghezza e la velocità. Le misurazioni delle navi possono quindi essere fatte e le modifiche che si verificano possono essere seguite.

Limiti della tecnica e passaggi critici

Il dispositivo FCMF ha alcune limitazioni. La regione di interesse (ROI) può cambiare duranteil tempo di imaging. Inoltre, l'area ripreso potrebbe asciugare; si deve mantenere la zona idratata. L'agente di fluorescenza potrebbe candeggina e verrà perso il segnale. Un passo fondamentale si dovrebbe prestare attenzione è quello di mantenere l'animale e la sonda ben fissato per evitare cambiamenti del ROI.

Applicazioni Importanza e future

La piattaforma sperimentale stabilito può servire come test immediata risposta alla chemioterapia o alternativamente come potenziale marcatore biologico per caratterizzare il potenziale profilo di tossicità vascolare. Sulla base del meccanismo studiato di compromissione vascolare, il metodo può essere utile anche in futuro per valutare agenti potenziali specificato per ridurre la tossicità vascolare indotta da chemioterapia. La necessità di ridurre le potenziali complicanze vascolari a lungo termine in pazienti sopravvissuti al cancro ci spinge ad esplorare il meccanismo che sta dietro la tossicità vascolare indotta da chemioterapia.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
general anesthesia Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2
depilatory cream (Veet) ReckittBenckiser, Bristol, UK
30 G, 1/2 inch needle attached to 1 ml syringe
FITC dextran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) Sigma FD2000S 100 μl volume
Doxorubicin Teva, Israel 8 mg/kg, Adriamycin
paclitaxel Taro, Israel 1.2 mg/kg, Medexel
saline

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