Inducida por la quimioterapia Vascular Toxicidad - En tiempo real

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Bar-Joseph, H., Stemmer, S. M., Tsarfaty, I., Shalgi, R., Ben-Aharon, I. Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment. J. Vis. Exp. (95), e51650, doi:10.3791/51650 (2015).

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Abstract

Ciertas clases de quimioterapia pueden ejercer cambios vasculares agudos que pueden progresar en condiciones a largo plazo que pueden predisponer al paciente a un mayor riesgo de morbilidad vascular. Sin embargo, aunque la evidencia clínica de montaje, hay una escasez de estudios claros de toxicidad vascular y por lo tanto la etiología de un grupo heterogéneo de trastornos cardiovasculares vasculares / queda por esclarecer. Además, el mecanismo que puede ser la base de toxicidad vascular puede diferir completamente de los principios de la cardiotoxicidad inducida por la quimioterapia, que se relaciona para dirigir la lesión de los miocitos. Hemos establecido un tiempo real, vivo plataforma de imágenes molecular para evaluar el potencial de toxicidad vascular aguda de terapias contra el cáncer.

Hemos puesto en marcha una plataforma de in vivo, de alta resolución de imagen molecular en ratones, adecuado para la visualización de la vasculatura dentro de los órganos confinados y blo de referenciavasos DO dentro de los mismos individuos, mientras que cada individuo sirven como su propio control. Paredes de los vasos sanguíneos se deterioran después de la administración de doxorrubicina, lo que representa un mecanismo único de la toxicidad vascular que puede ser el evento temprano en la lesión de órganos diana. En esto, el método de creación de imágenes basada Fibered microscopía confocal de fluorescencia (FCFM) se describe, que proporciona un modo innovador para entender los fenómenos fisiológicos a nivel celular y subcelular en sujetos animales.

Introduction

La evidencia clínica indica que varias clases de quimioterapias producen una variedad de patologías vasculares manifestados por el fenómeno de Raynaud, hipertensión, con infarto de miocardio, ataque cerebrovascular y hepática veno-occlusivedisease 1,2. "Fármacos antiangiogénicos 'accidental'" es un término bastante nuevo, que describe agentes quimioterapéuticos convencionales que actúan como posibles inhibidores de la angiogénesis, aunque no desarrollaron originalmente para este propósito 3-5 pero diseñados para eliminar células tumorales mediante la imposición de tan poco "garantía daño "a las células normales como sea posible 3. Varios quimioterapias se han implicado como vasculo-tóxicos como se ha observado en estudios clínicos utilizando biomarcadores séricos. Entre ellos están los agentes (como la ciclofosfamida), compuestos de platino (como cisplatino) y antraciclinas 1,2,5-7 alquilantes.

Complicaciones cardiovasculares agudas pueden ocurrir como result de la toxicidad vascular inducida por la quimioterapia. Ellos pueden progresar en condiciones crónicas como la aterosclerosis y representan mayor riesgo de morbilidad vascular tarde. Sin embargo, a pesar de la creciente evidencia clínica, hay una escasez de estudios designados enfatizando el mecanismo de toxicidad vascular y, por tanto, mayor esclarecimiento de la patogenia exacta que infligen se justifica.

Un reto importante en el descubrimiento del mecanismo de toxicidad vascular inducida por la quimioterapia se deriva de la complejidad de la investigación de la función vascular en vivo. Se describe en este documento una plataforma de alta resolución en imagen molecular in vivo en ratones que permite capturar el flujo sanguíneo y características del buque. Esta plataforma facilita la detección de efectos vasculares directos inducidos por el tratamiento: en tiempo real, así como después de ellos durante un período de tiempo dentro de los mismos individuos.

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Protocol

Declaración de Ética: Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional. Cuidado de los animales estaba de acuerdo con las directrices institucionales. Ratones ICR hembra (7-8 semanas de edad; 25 - 30 g) fueron alojados en aparatos de aire acondicionado, luz controlada instalaciones de los animales de la Facultad Sackler de Medicina en la Universidad de Tel-Aviv. Al término, los animales fueron sacrificados con una sobredosis de anestesia.

1. fibred confocal microscopía de fluorescencia de calibración (FCFM)

  1. Encienda el dispositivo.
  2. Conecte la microsonda (mini0 / 30).
  3. Calibrar el dispositivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2. Los ratones Preparación for Imaging

  1. Anestesiar por una inyección subcutánea de tanto Ketaset (100 mg / kg) y XYL-M2 (6 mg / kg). Confirme anestesia adecuada por falta de respuesta a los pies de pellizcar.
  2. Incisión en la piel debajo de la ingle con el fin de revelar los vasos arteriales femorales. Mantenga el lugar de la incisión húmeda con solución salina después de la incisión.
  3. Calentar la cola usando una bolsa (o un guante) lleno de agua tibia (no demasiado caliente al tacto) por aproximadamente 30 segundos. Preparar un (IV) de derivación intravenosa para la administración del FITC dextrano (un agente de contraste) y de solución salina o de agente quimioterapéutico, mediante la inserción de una aguja (30 G, 1/2 pulgadas) en la vena de la cola y fijación de una jeringa de 1 ml a ella . Asegúrese de que la vena está abierto mediante la inyección de solución salina.
    NOTA: Una administración IV de FITC dextrano (de alto peso molecular; 100 l; 10 mg / ml; 2.000 kDa) facilita la visualización de la microvasculatura femoral por FCFM. La doxorrubicina (100 l; 8 mg / kg, adriamicina) o solución salina también se administran más tarde IV en la vena de la cola pre-calentado.
  4. Pasa el raton supina en un escenario de poliestireno. Asegure el ratón a la almohadilla y mantener la posición con cinta adhesiva quirúrgica.
title "> 3. Imaging de Femorales vasos sanguíneos por FCFM Durante y después de la administración de doxorrubicina o solución salina

NOTA: El microscopio confocal fibrado utilizado en este estudio se compone de dos unidades: (1) microsonda (mini0 / 30). (2) unidad de escaneo láser (LSU-488; 488 nm de longitud de onda).

  1. Realice todas las temporales vueltas análisis utilizando el láser de longitud de onda nm 488 LSU.
    NOTA: El detector detecta la unidad principal filtrada (500-650 nm) de fluorescencia emitida. Las imágenes adquiridas se reconstruyen después y visualizan a una velocidad de 12 cuadros / seg.
  2. Desconecte cuidadosamente la jeringa de la aguja y coloque una nueva jeringa que contiene FITC dextrano. Administrar (IV) 100 l de FITC dextrano.
  3. Cambie la microsonda (mini0 / 30) a un campo adecuado de visión y fijar que, tras el ajuste al eje z, con el fin de obtener la imagen correspondiente. Espere a que la señal inicial a desvanecerse hasta que una señal clara y enfocada es visible.
  4. Grabar un flujo de sangre de referencia para un período de estabilización de corto (~ 30 seg). A continuación, conecte a la aguja otra jeringa, contiene doxorrubicina o solución salina. IV administrar 100 l doxorrubicina o solución salina.
  5. Monitorear el flujo de inyectado FITC-dextrano continuamente durante 20 min. En el software FCFM-asociado, utilice el botón de diámetro en la regla superior con el fin de medir los vasos sanguíneos y clasificarlas como pequeños (<15 micras) o grandes (> 15 micras).
  6. La eutanasia a los animales con una sobredosis de anestesia.

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Representative Results

En las imágenes continua vivo en tiempo real

El aparato de formación de imágenes se utiliza aquí es una alta definición, microscopio confocal fibrado, equipado con una sonda que permite la visualización de la vasculatura y su respuesta a diversos estímulos como la quimioterapia. Este método es mínimamente invasivo ya que si bien puede facilitar la obtención de imágenes de vasos profundos o de órganos, que requiere una pequeña incisión para la sonda. Los haces de sonda constan de decenas de miles de fibras óptica del microscopio, y un conector de precisión propietario. Una representación esquemática se muestra en la Figura 1.

Obtención de imágenes de la microvasculatura femoral

Hemos clasificado la red de la vasculatura arterial femoral de acuerdo a los vasos de diámetro (pequeña <15 micras; grande> 15 micras) por FCFM en ratones inyectados con FITC-dextrano. Una vasoconstricción rápida (2-5 minutos) de los vasos pequeños fue inducida por la doxorubicina. Un disappearan completace de la fluorescencia FITC-dextrano, tratamiento de 8 minutos después de la doxorrubicina (Figura 2A por ejemplo, flechas, Video 1). En varios ratones, la reducción de la señal fluorescente en el vaso sanguíneo y aumentar la señal de su rodea se observó en la región perivascular, unos segundos después de la administración de doxorrubicina (Figura 2B g, flechas). Estos resultados indican que el aumento de permeabilidad de los vasos y las fugas del dextrano de alto peso molecular desde el vaso sanguíneo a los tejidos circundantes. No señal de fluorescencia fue evidente tras la administración de doxorrubicina en los ratones que no fueron inyectados previamente con FITC-dextrano. Los ratones tratados con paclitaxel demostraron estructura similar vasos de sangre y el caudal a los observados en los ratones inyectados con solución salina (no mostrado), en todo el periodo de medición.

Figura 1
Figura 1. La FCFM El microscopio confocal se utiliza aquí se compone de dos unidades: la microsonda (mini0 / 30) y la unidad de exploración láser (LSU-488; 488 nm de longitud de onda)..

Figura 2
Figura 2. Imágenes de señal de fluorescencia FITC-dextrano en la microvasculatura femoral. Los vasos se clasifican en dichotomously menor (<15 micras) o mayor (> 15 micras) de acuerdo con su calibre. Microvasculatura femoral del FITC dextrano (100 l; 10 mg / ml). Se obtuvieron imágenes de los ratones inyectados antes y durante la administración IV de cualquiera de doxorrubicina o solución salina (A) Los vasos menores, fotografiada por FCFM, comenzó vasoconstrictores agudamente 2 min después de la administración de doxorrubicina (f , flecha), que muestra un estrechamiento continuo de la señal fluorescente hasta su desaparición completa, sin recuperación aparente recuperación de la señal durante el next ocho minutos de la imagen en tiempo real (g, flecha). (B) Aspecto, en algunos instantáneas, de una zona de "vaga" alrededor de las paredes de los vasos sanguíneos de ratones inyectados con quimioterapia (g flecha) inmediatamente después de la inyección, indica un potencial El dextrano-FITC fugas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1. imágenes microvasculatura femoral. Un representante fotografiado película de menor fluorescente FITC-dextrano (<15 micras de diámetro) los vasos sanguíneos. Tiempo microvasculatura de ovario y femoral vueltas fotografía: ratones inyectados con 100 l de FITC-dextrano (10 mg / ml) fueron imágenes y fotografiado desde el momento de la administración IV de la doxorrubicina. 2 - 5 min después de la inyección doxorrubicina, vasos menores mostró vasoconstricción dramática seguido por la abolición completa de la señal fluorescente, ya después de 8 min treatment. (AVI) Por favor haga clic aquí para ver el vídeo.

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Discussion

La evaluación de la toxicidad vascular inducida por la quimioterapia es un reto debido a la dificultad en la visualización de la dinámica del sistema vascular en respuesta a un estímulo en tiempo real. Numerosos estudios clínicos han implicado que varias quimioterapias causan daño vascular directo, sin embargo, el mecanismo y las características de su toxicidad aún no se ha dilucidado. Hemos establecido un tiempo real, vivo plataforma de imágenes molecular en para evaluar la potencial toxicidad de la quimioterapia vascular en ratones que comprenden de microscopía de fluorescencia confocal con fibras como se describe en el presente documento 8-10. Esta alta resolución de imagen molecular de ratones es adecuado para visualizar el flujo sanguíneo arterial y la arquitectura buques ». Se permite la detección en tiempo real de las complicaciones inducidas por el tratamiento en el mismo animal durante un período prolongado de tiempo. Se evaluaron dos tipos de quimioterapias: doxorrubicina que se sabe que es tóxico para las células endoteliales in vitro, así como en el tejidos obtenidos a partir de animales tratados con doxorrubicina 10-15, y paclitaxel como quimioterapia de control para que la primera evidencia de ningún efecto vascular es muy limitada.

La tecnología de escaneo láser confocal de FCFM facilita el rastreo de tejidos profundos de fluorescencia de teñido en tiempo real y produce lapso de tiempo imágenes de vídeo de los vasos sanguíneos in vivo 9. En nuestro estudio FCFM se utilizó para observar el efecto vascular aguda de la doxorrubicina, como agente prototipo vasculotóxica. Este efecto, que comenzó poco después de la administración de doxorrubicina, era dependiente de los vasos sanguíneos de tamaño: el diámetro más pequeño de los buques, la más prominente el daño. La señal de fluorescencia de diámetro pequeño (<15 micras) los vasos disminuyó gradualmente como resultado de la constricción de los vasos constante causada por doxorrubicina. Sin aparente recuperación se detectó durante el próximo 8 minutos de imágenes en tiempo real. De gran diámetro (> 15 micras) los barcos eran menos dañada; la integridadde su pared se vio comprometida, que presenta una superficie irregular. Estos efectos eran únicas a la doxorrubicina y no fueron evidentes cuando se utilizó paclitaxel, lo que indica que esta metodología delinea meticulosamente el efecto específico de la droga.

Modificaciones y solución de problemas

A lo largo del protocolo, la potencia del láser se puede cambiar durante la grabación de la línea de base con el fin de ilustrar los vasos. Sin embargo, la potencia del láser no debe ser cambiado durante el experimento. Además, un alto poder de láser puede blanquear el agente de fluorescencia durante el tiempo. Además, una vez que se termine de grabar, es posible cambiar el contraste de la película y para editar su longitud y velocidad. Las mediciones de los buques podrán entonces ser hechas y los cambios que se producen pueden ser seguidos.

Limitaciones de la técnica y pasos críticos

El dispositivo FCMF tiene algunas limitaciones. La región de interés (ROI) puede cambiar duranteel tiempo de formación de imágenes. Además, el área fotografiada podría secarse; uno debe mantener la zona hidratada. El agente de fluorescencia puede blanquear y se perderá la señal. Un paso crítico se debe prestar atención es mantener al animal y la sonda bien fijo para evitar los cambios de la ROI.

Aplicaciones de significación y futuras

La plataforma experimental establecido puede servir como una prueba inmediata de respuesta a la quimioterapia o alternativamente como un marcador biológico potencial para caracterizar el potencial perfil de toxicidad vascular. Basándose en el mecanismo estudiado de deterioro vascular, el método también puede ser útil en el futuro para la evaluación de agentes potenciales especificada para reducir la toxicidad vascular inducida por la quimioterapia. La necesidad de disminuir las posibles complicaciones vasculares a largo plazo en los sobrevivientes de cáncer que nos impulsa a explorar el mecanismo detrás de la toxicidad vascular inducida por la quimioterapia.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
general anesthesia Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2
depilatory cream (Veet) ReckittBenckiser, Bristol, UK
30 G, 1/2 inch needle attached to 1 ml syringe
FITC dextran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) Sigma FD2000S 100 μl volume
Doxorubicin Teva, Israel 8 mg/kg, Adriamycin
paclitaxel Taro, Israel 1.2 mg/kg, Medexel
saline

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