La mesure de la perméabilité à l'eau Coefficient osmotique (P

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Summary

La mesure du coefficient de perméabilité à l'eau osmotique (P f) de cellules peut aider à comprendre les mécanismes de régulation de aquaporines (AQP). P f détermination dans des protoplastes de cellules végétales sphériques présentées ici implique l'isolement de protoplastes et l'analyse numérique de leur taux initial de changement de volume à la suite d'une faute de osmotique au cours de la perfusion de bain constant.

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Shatil-Cohen, A., Sibony, H., Draye, X., Chaumont, F., Moran, N., Moshelion, M. Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example. J. Vis. Exp. (92), e51652, doi:10.3791/51652 (2014).

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Abstract

L'étude des mécanismes de régulation PAQ est cruciale pour la compréhension des relations de l'eau, tant au niveau de la plante entière et cellulaire. Présenté ici est une méthode simple et très efficace pour la détermination du coefficient de perméabilité à l'eau osmosée (P f) dans des protoplastes végétaux, en principe applicable aussi à d'autres cellules sphériques telles que les ovocytes de grenouille. La première étape de l'analyse est l'isolement de protoplastes à partir du tissu de la plante d'intérêt par digestion enzymatique dans une chambre avec une solution isotonique appropriée. La deuxième étape consiste en un test de provocation osmotique: protoplastes immobilisés sur le fond de la chambre sont soumises à une perfusion constante de départ avec une solution isotonique et suivis par une solution hypotonique. Le gonflement de la cellule est une vidéo enregistrée. Dans la troisième étape, les images sont traitées hors ligne pour donner des changements de volume, et l'évolution dans le temps des changements de volume sont corrélées avec l'évolution temporelle de la variation de la osmolarité de la chambre à fluide de perfusion, en utilisant une procédure d'ajustement de courbe écrit dans Matlab (la PfFit '), pour obtenir P f.

Introduction

L'absorption d'eau et le débit à travers les membranes cellulaires est une exigence fondamentale pour l'existence de l'usine à la fois au niveau de la plante entière et cellulaire. Au niveau cellulaire, les aquaporines (AQP) jouent un rôle clé dans la régulation du coefficient de perméabilité à l'eau osmotique (P f) de la membrane de la cellule 1-3.

A ce jour, plusieurs procédés ont été utilisés pour mesurer la f P endogène de protoplastes à partir de différents organes de la plante (par exemple les racines, le mésophylle, endoderme, etc., Examiné par Chaumont et al. 4). L'une des approches pour mesurer P f est d'exposer les protoplastes à un défi osmotique et à contrôler la vitesse initiale de sa variation de volume (c.-à-., La pente de la phase précoce, linéaire de la variation de volume). Deux méthodes différentes ont été décrites précédemment sur la base de cette approche, tous les deux basés sur un échange instantané de solutions. La première consiste à immobilizment le protoplaste avec une micropipette d'aspiration et le passage du flux de la solution 5 et la deuxième consistant à transférer l'un protoplaste d'une solution à l'autre à l'aide d'une micropipette 6. Ces méthodes de transfert micropipette d'aspiration et de micropipette, qui permettent l'acquisition d'images au début de l'échange de solution rapide (pour capturer la phase linéaire début de changement de volume), impliquera probablement un stress physique de protoplastes et nécessitent un équipement spécialisé et micromanipulation expert.

Le procédé décrit ici minimise la perturbation des cellules, comporte aucun micromanipulation et permet la dérivation de P f lorsque la perfusion de bain n'est pas instantanée.

Après la digestion enzymatique, les protoplastes, immergées dans une solution isotonique, sont immobilisés sur le fond de la lamelle couvre-objet en verre une Plexiglas (aka Lucite ou plexiglas) chambre par interaction de charges. Puis, au cours d'une perfusion constante de bain,la solution isotonique est rincée par la solution hypotonique générer un défi hypoosmotique aux protoplastes. Le gonflement du protoplaste est une vidéo enregistrée et ensuite, en combinant les informations sur le déroulement dans le temps de la perfusion de bain et le déroulement dans le temps de gonflement de la cellule, le P f est déterminée par traitement d'image et des procédures d'ajustement de courbe.

Les avantages de cette méthode sont que l'expérience est très efficace, c'est à dire qu'il est possible de suivre quelques cellules simultanément dans un seul essai, et qu'il ne nécessite pas d'équipement spécial ou des compétences particulières de micromanipulation. Plusieurs applications de cette méthode sont possibles. Par exemple, la détermination de P f natif d'une variété de cellules provenant de différents tissus et des plantes, tels que mésophylle et regrouper les cellules de la gaine de feuille 7 Arabidopsis, maïs mésophylle des feuilles ou des cellules du cortex des racines 8-10 ou les cellules cultivées en suspension 11,12. En additisur, il est possible de déterminer P f de cellules animales telles que des cellules sphériques d'ovocytes 11. Un autre exemple concerne l'examen de l'activité PAQ par l'expression transitoire de leur gène dans les protoplastes (ou d'autres gènes susceptibles de les toucher; par exemple, les gènes de kinases) et la détermination de leur contribution à P f; par exemple, l'expression de tomate AQP SlTIP2; 2 dans les protoplastes d'Arabidopsis de PEG par transformation et la détermination SlTIP2; deux liés P f 13. Enfin, l'examen de l'effet sur ​​P f de différentes molécules / substances (médicaments, hormones, etc) ajouté à des solutions peuvent également être examinée, par exemple du bloqueur PAQ HgCl2 7.

Le protocole suivant décrit l'isolement de protoplastes des cellules et la détermination de leur P f Arabidopsis de.

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Protocol

1 Préparation de solutions

  1. Préparer isotonique (600 mOsm) et hypotonique (500 mOsm) des solutions contenant 10 mM de KCl, CaCl2 1 mM, et 8 M 2 (N-morpholine) d'acide -ethanesulphonic (MES), pH 5,7 et ajuster l'osmolarité avec les quantités appropriées d' D-sorbitol: 540 mm pour les isotonique et 440 mM pour la solution hypotonique. Vérifier l'osmolarité de la solution (à moins de 3% de la valeur cible) à l'aide d'un osmomètre.
  2. Préparer une pâte sèche de «mélange enzymatique» contenant les enzymes suivantes: 0,55 g cellulases, 0,1 g pectolyase, 0,33 g de polyvinylpyrrolidone K 30, 0,33 g de BSA (voir le tableau 1 ci-dessous), mélanger la poudre sèche par vortex, faire 5,7 mg aliquotes et stocker à -20 ° C.

2 Arabidopsis L'isolement de protoplastes de mésophylle

  1. Préparer une boîte de Pétri (10 cm) avec environ 6 gouttes (env. 30 ul chacun) de solution isotonique.
  2. Peler les abaxiales Les épiderme (inférieure) de feuilles d'Arabidopsis, cut la feuille pelée en carrés d'environ 4 x 4 mm 2, puis placez les carrés sur la solution isotonique gouttes avec le côté abaxiale exposé vers le bas, touchant la solution.
  3. Dissoudre 5,7 mg du mélange d'enzymes dans 165 ul solution isotonique (3,3% p / p) dans un tube de 1,5 ml, mélanger doucement par pipetage pour une minute ou jusqu'à dissolution, et placer quelques gouttes semblables de la solution enzymatique dans le même Petri plat.
  4. Transférer les morceaux de feuilles sur la solution enzymatique gouttes, fermer le plat d'étanchéité du couvercle avec un tour de parafilm et incuber pendant 20 min, flottant le plat dans un bain-marie réglé à 28 ° C.
  5. Ajouter quelques gouttes d'une solution isotonique de l'antenne (2 gouttes par chaque goutte de solution enzymatique). Transfert de chaque morceau de feuille à une nouvelle goutte de solution isotonique, puis, successivement, à une seconde goutte (pour laver la solution enzymatique loin). Soulevez la pièce par son bord en utilisant une pince, serrer dans la deuxième chute (comme un sachet de thé) pour libérer les protoplastes.Recueillir les gouttes avec les protoplastes (à l'aide d'une pipette 100 ul rognée) dans un tube de 1,5 ml.

3 L'hypotonie Défi test: gonflement cellulaire Arabidopsis Mésophylle

  1. Préparer le système de perfusion (figure 1A) en remplissant une colonne avec la solution isotonique et une autre colonne avec la solution hypotonique. Ouvrir la vanne, et encore un certain écoulement de la solution (la première hypotonique, puis la isotonique) pour remplir le tube tout en bas de la tubulure d'admission (figure 1B). Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air, puis fermer la vanne.
  2. Sceller une lamelle, avec de la graisse de silicone (tableau 1), pour faire un fond pour la chambre dans la diapositive en plexiglas (figure 1B, voir aussi les schémas de la chambre à la figure 1C). Pour rendre le fond de la chambre (la surface vers le haut face exposée de la lamelle dans la couronne de graisse) "collante" pour protoplastes, enduireavec le sulfate de protamine-portant une charge positive (à 1% dans l'eau, tableau 1) ou la poly-L-lysine (0,1% dans l'eau; tableau 1). Fais tourner ce «colle» sur la lamelle à l'aide d'une pipette, attendre 1 - 2 min, rincer 3 - 4 fois avec la solution isotonique et secouer loin la solution restante.
  3. Remplir la chambre avec la solution isotonique. Ensuite, ajoutez une goutte de protoplastes contenant une solution à la chambre, à l'aide d'une pipette coupée et attendre 3 - 4 min pour les protoplastes se déposer. Couvrir la chambre avec un couvercle transparent (figures 1D, 1E) de toucher la surface de la solution (éviter la formation de bulles sous).
  4. Placer la lame (doucement!) Sur une table de microscope inversé, connectez-le au système de perfusion et la pompe (se prémunir contre des bulles d'air dans le tube!) Et tourner sur le flux de solution isotonique pour perfusion constante à 1 ml / min (vitesses plus rapides peut être utilisé, à 4 ml / min).
  5. Pour l'enregistrementles variations de volume, un microscope inversé est utilisé, avec un objectif 20X et avec une caméra vidéo CCD reliée à un ordinateur de type PC. Utilisez la CMU 1394 Camera Driver "plug-in du logiciel ImageJ (voir la Table des Matières spécifiques pour les adresses de téléchargement de ces deux morceaux de logiciels) pour enregistrer une vidéo film de 60 secondes de protoplastes immobiles sélectionnés (sans doute, ceux qui sont coincés au fond) à une vitesse de 1 image / seconde (1 Hz). Lancer l'enregistrement avec un lavage à 15 sec de la solution isotonique (ce qui constitue la ligne de base), l'interrupteur de la solution hypotonique pendant 45 s (pour compléter un total de 60 s à partir du début de la perfusion). Enregistrer le film en format TIF. REMARQUE: Choisissez un champ de vision avec autant de cellules que possible, répondant aux critères suivants: sphériques en forme et avec un contour de cellule bien ciblée à leur plus grand périmètre (figure 2A).

4. analyse de l'évolution cellulaire de volume à l'aide ImageJ

REMARQUE: Pour analyser l'série d'images d'un gonflement cellulaire, utilisez le 'Image Explorer »et plugins' Protoplast Analyzer» dans le logiciel ImageJ (écrit par Xavier Draye) 14. En commençant par les protoplastes choisis à leur premier point de temps, le plugin le 'Protoplast Analyzer »détecte automatiquement les protoplastes bords (contours) et de calculer le cours du temps de leurs domaines au cours de l'expérience (les plugins sont disponibles avec le programme d'analyse PfFit, ci-dessous) .

  1. Lancer ImageJ. Pour ouvrir le film, cliquez sur «Fichier» sur le panneau ImageJ, puis, successivement sur les menus déroulants tels qu'ils se déroulent: «Importer», puis «de Image Explorer. Mettez en surbrillance le film choisi, puis faites un clic droit dessus, puis clic gauche sur "Protoplast Analyzer». Parcourez le film (à l'aide d'un curseur à l'image du bas de protoplastes) d'identifier les protoplastes qui restent en grande partie immobiles pendant l'expérience - ils seront analysés. Retour sur la première image, à l'aide de la souris, tracer des cercles (cueillies dans les outils de dessin de ImageJ) autour des protoplastes sélectionnés (figure 2B), puis cliquez sur «OK» dans le tableau des "paramètres de détection» qui sont apparus.
  2. Pour lancer l'algorithme de détection de protoplastes, cliquez sur «Local» sur le panneau supérieur de l'image de protoplastes, puis «processus» dans le menu déroulant. Examiner les cercles verts autour des protoplastes sélectionnés (figure 2C) tout au long du film. Enregistrez le «Résultats» dans un fichier Excel. Quitter ImageJ. NOTE: Dans le cas où un point rouge apparaît (pour indiquer une mauvaise contour en forme - le plus souvent en raison d'un contraste d'image médiocre), relancez avec des paramètres différents.
  3. Pour séparer les lignes appartenant à chaque cellule (qui - si deux ou plusieurs cellules ont été analysées simultanément - sera liée, parce que l'analyse se fait image par image), dans Excel, trier les données enregistrées par la colonne du nombre de cellules ('objet' ).
  4. Pour DeTermine le facteur de conversion pixel-à-um pour obtenir la valeur réelle de P f, casser l'image d'un dirigeant du micromètre par le même objectif 20X de microscope. Faites glisser une ligne (cueillis dans les outils de dessin de ImageJ) le long de l'image de la règle et de lire le nombre de pixels équivalente à la longueur de la règle dans le bas du panneau principal ImageJ. Convertir les valeurs de la zone pixel arbitraires dans le fichier Excel dans um 2. Enregistrer le cours zones de temps (pour chaque cellule séparément) sous forme de fichier texte (deux colonnes de chiffres uniquement). NOTE: Ce sera une contribution au programme de volume ajusté 'PfFit.

5 Modélisation du taux de osmolarité changement dans la Chambre expérimentale utilisant ImageJ et le programme Matlab P f Fit

  1. Ajouter 2 mg xylene cyanol (tableau 1, ci-dessous) à 100 ml de la solution isotonique (pour produire le «colorant indicateur).
  2. Préparer le système de perfusion (comme en 3.1) avec le colorant indicateur et le non-teinte hsolution ypotonic.
  3. Sceller une lamelle avec de la graisse de silicium au fond de la chambre en plexiglas, puis versez doucement la chambre avec le colorant indicateur, couvrir avec une lamelle (comme avec les protoplastes avant) et le placer sur la platine du microscope.
  4. Connectez la chambre au système de perfusion et de la pompe, et tourner sur le flux colorant indicateur pour une perfusion constante à l ml / min.
  5. Enregistrer un film de 60 secondes à la fréquence de 1 Hz. Lancer l'enregistrement avec 15 sec de colorant indicateur, passer à la solution hypotonique pendant 45 sec. Arrêter de filmer. Rincer avec de l'indicateur Dye (au moins pour 30 sec), puis commencer un nouveau film. Répétez environ 5 - 6 fois et enregistrer tous les films
  6. Utiliser le logiciel ImageJ à analyser les images vidéo de la transmittance colorant indicateur d'obtenir une évolution dans le temps de la modification moyenne de la transmittance.
    1. Lancer ImageJ, cliquez sur «Fichier», puis, «Ouvrir», et parcourir pour le film. Pour chaque film, dessiner un 10 pixels de large verticalrectangle n'importe où sur le 1 er image du film. Cliquez sur "Image" sur le panneau principal ImageJ, puis cliquez sur «culture» dans le menu déroulant.
    2. Pour aligner les 60 images (du film de 60 secondes) dans une rangée, cliquez à nouveau sur "Image", puis cliquez sur consécutivement dans les menus déroulants tels qu'ils se déroulent: «Stacks» et «Faire Montage" (colonnes 60, lignes 1). Dessinez un 1 pixel de haut rectangle horizontal partout sur toute la rangée d'images et cliquez sur "Analyser" dans le panneau principal ImageJ, puis cliquez sur le profil de complot »dans le menu déroulant. REMARQUE: Un «Terrain de Montage« fenêtre apparaîtra (non représenté), et une liste de données de transmission peuvent être ouverts à partir de son menu. Chaque image du film est représenté dans cette liste de 10 valeurs de transmission provenant de son 10 pixels de large rectangle et par conséquent la "base de temps" (l'image numéro séquentiel) est 10 fois plus longtemps.
    3. Copiez les listes de la dat de transmissionun (une liste par film) vers un fichier Excel. La moyenne des cours de temps de transmittance obtenus à partir des plusieurs films des bouffées de colorant indicateur. Générer une véritable base de temps en multipliant l'image numéro séquentiel de 0,1. Enregistrez le cours du temps en moyenne (deux colonnes) dans un fichier texte. NOTE: Avant la moyenne, si on le souhaite, tracer les cours à temps individuels, de rejeter toute irrégularité. Assurez-vous que le film comprend au moins 5 sec finale de l'état stable de transmission du colorant indicateur.
  7. Démarrez le programme Matlab raccord P f Fit (panneau du «indicateur Fit", Figure 3) pour calculer les différents paramètres de l'évolution dans le temps de l'osmolarité. Remarque: sur la base des concentrations initiales et finales connues de la solution dans le bain, au cours du temps de la concentration osmotique changement de la solution est calculée à partir de l'évolution temporelle de la concentration (calculée en retour à partir de la transmission de l'indicateur de colorant), en supposant qu'il suit la même dynamique que laconcentration de colorant. P f Fit est un programme disponible pour une utilisation gratuite. Le «PfFit_Installer_web.exe 'peut être téléchargé à partir de: P f Guide des coupes de l'utilisateur» avec des explications et des définitions détaillées est accessible via Jupiter dans un fichier supplémentaire, ce qui contribue à familiariser l'utilisateur avec le programme Fit P f.
  8. Dans le panneau «indicateur Fit", importer les données de l'évolution dans le temps moyen de la transmission Indicateur Dye («fichier de données Indicateur», figure 3A) et insérer manuellement les paramètres expérimentaux actuels et les estimations initiales de de la largeur 'les paramètres et' t_half "décrivant l'évolution temporelle de la concentration du colorant indicateur (figure 3B. Cliquez sur" Exécuter "pour afficher les courbes des cours à temps de la concentration du colorant indicateur (données réelles et en forme, figure 4A), et de la valeur calculée) bain modélisé ( osmolarité (figure 4B). REMARQUE: agood ajustement aux données est indispensable (recommandation: commencer par les valeurs indiquées dans la figure 3).

6 Détermination de la f de P en utilisant le programme d'ajustement de Matlab P f Fit

NOTE: En plus des hypothèses de base en ce qui concerne le comportement d'un protoplaste comme un osmomètre vraie et parfaite 11, la détermination de P f repose sur la présomption que P f peut changer avec le temps, que cette dynamique de P f sous-tend le temps cours de la variation de volume de la cellule et que les trois paramètres suffisent pour le décrire: P fi (la valeur initiale de P f), la pente Pf (le taux de la variation linéaire de P f) et de retard (la période allant du début de la baignoire changement de l'osmolarité jusqu'au début de la variation de volume de la cellule). Différents modèles peuvent être testés, y compris différentes combinaisons de ces paramètres et leurs valeurs, y compris les valeurs nulles 11. P 11, calculé, à son tour, de la série importés de zones cellulaire contour (voir aussi le complémentaire 'P f Guide Fit de l'utilisateur »).

  1. Passez au volet 'Volume Fit' (figure 5). Choisissez pour l'importation du fichier de données sur les aires (le fichier texte avec le cours du temps des «zones» de protoplastes analysés, figure 5A). Choisissez l'option «Dernière indicateur de pose» comme source de paramètres (figure 5B, voir le 'P f Fit Guide de l'utilisateur »pour des solutions de rechange). REMARQUE: Ces paramètres (figure 5D) est ensuite utilisé pour régénérer le changement osmotique dans le bain pendant les volumes procédure d'ajustement.
  2. Dans le panneau «Volume Fit '(figure 5C), initialiser (remplir les estimations initiales pour) les P f paramètres: P f, pente Pf et Delay (recommandation: commencer par 1, 1, et 30, respectivement), a choisi le modèle 'Class' (une recommandation: commencer par II et marque «contrôles» pour les trois paramètres qui doivent être montées). Cliquez sur "Exécuter", puis globe oculaire le chiffre provisoire (Figure 5E) et régler le paramètre Delay et la longueur de l'enregistrement, si nécessaire.
  3. Examinez le graphique des résultats (Figure 6) pour évaluer la qualité en forme et enregistrer l'erreur ajustement. Modifiez les paramètres d'initialisation un peu plier chaque, et re-'Run. NOTE: Ne vous découragez pas lorsque le programme est bloqué - juste redémarrer le programme!
  4. Répéter cette procédure plusieurs fois, en commençant par différentes combinaisons de paramètres d'initialisation, en vue de la plus faible valeur de l'erreur est nécessaire.
  5. Copiez la liste des résultats ajustement directement à partir de l'écran, ou les trouver en til PfFit généré le fichier '_FIT_Vol_Results.txt.

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Representative Results

Afin de déterminer la P f et comparer l'activité des différents AQP, les protoplastes du mésophylle des feuilles de Arabidopsis sont utilisés. Ces protoplastes ont été trouvés à avoir de faibles basale (arrière-plan) des niveaux P f 7 et peuvent servir comme un système fonctionnel d'expression pour permettre des mesures P f reproductibles.

Protoplastes d'une feuille adulte à partir d'une ancienne usine d'Arabidopsis de 6 semaines ont été isolés et trois constructions géniques avec des gènes PAQ d'Arabidopsis (AtPIP2; 1) et le maïs (ZmPIP1; 2 et ZmPIP2; 4) étaient transitoire (et séparément) exprimées à l'aide de la transformation du PEG méthode 15. En supposant que l'événement de transformation est simultanée d'un grand nombre de plasmides appliquées à la cellule, indépendamment de leur nature et sur la base des résultats qui ont montré un taux de réussite de 100%, pour synchroniser l'expression transitoire des deux plasmides dans une cellule indiqué précédemment pour les autres systèmes de la centrale15,16, ils ont été co-transformé avec un vecteur codant pour la protéine fluorescente verte (eGFP) afin de marquer les protoplastes transformés (figure 7).

Pour les essais P f, des protoplastes ont été mis dans la chambre d'expérimentation (figure 1B) et la GFP protoplastes marqué ont été surveillées par vidéo alors qu'ils ont été rincés initialement avec la solution isotonique (600 mOsm), puis avec la solution hypotonique (500 mOsm), en utilisant le système de perfusion (Figure 1A).

Les cours à temps des changements de volume de la cellule (Figure 8A) ont été obtenues pour chaque cellule en deux étapes: d'abord, la «Image Explorer» et plugins 'Protoplast Analyzer »ont été utilisés pour générer le cours du temps l'évolution de la zone du contour de la cellule (Figure 2), puis, le programme d'ajustement de Matlab P f Fit (figure 5) a été utilisé pour importer des thesles zones de e et les convertir en volumes de cellules. Les valeurs P f (Figure 8C) ont été calculées pour chaque cellule en utilisant le programme Fit P f (figure 5), sur la base de l'évolution dans le temps des volumes de la cellule et, en outre, sur le parcours importé de temps moyenne des variations de facteur de transmission de l'indicateur Dye (figure 3), convertie à l'évolution dans le temps du changement de concentration du colorant indicateur (Figure 4A) et ensuite - à l'évolution dans le temps de la variation d'osmolarité bain (Figures 4B, 6A, 8B). Il est à noter, que DELc, la différence dans les concentrations osmotiques dans la cellule (Cin) et dans le bain (Cout), c'est à dire., La force motrice de l'afflux de l'eau, est due presque exclusivement à la variation de Cout (figure 6A ). Dans cette expérience, P f a augmenté au cours de l'essai (figure 6B).

Le P f f de la cellule témoin transformée avec la GFP seule (Figure 8C).

Figure 1
Figure 1: Le système volume dosage. (A) Le dispositif expérimental: Le système de perfusion contient des réservoirs de solution (colonnes de perfusion, 'cols'), les tubes (T), des soupapes (V) et une pompe péristaltique (P) reliée à la lame de plexiglas fixé sur la table de microscope. HS = solution hypotonique est une solution isotonique, Cm caméra. (B) une vue agrandie de la lame de plexiglas avec la chambre d'expérimentation (Chr) et la tubulure attachée via un orifice d'entrée (IN) collecteur. La solution est aspirée à partir de la chambre par l'intermédiaire d'une sortie (Out) à la pompe (C). Un dessin schématique d' la lame de plexiglas (sens antihoraire: vue de dessus, vue de côté long et vue du côté court): a = couvercle en verre feuillet, le fond de la chambre centrale; b = ruban adhésif transparent (tableau 1), servant de fond pour les entrée et de sortie des gorges de la solution menant à et partant de la chambre centrale; lorsque le scotch est remplacé (occasionnellement), un trou est découpé en sous la chambre; c = un bloc de plexiglas collé à la lame; d = un trou de connecteur de sortie. Les nombres sont mm (mais le dessin n'est pas à l'échelle). (D) une vue agrandie de la partie centrale de la lame avec le couvercle transparent (plexiglas également) recouvrant partiellement la chambre centrale (flèches). (E) Schéma (en haut et une vue de côté) du couvercle transparent. La taille de la poignée de couvercle transparent (plastique vert dans D) est arbitraire. D'autres détails sont comme en C.

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Figure 2: Analyse de l'enflure protoplastes images en utilisant le plugin le 'Protoplast Analyzer ». (A) a, la première image du film avec des protoplastes, b, comme dans un, mais des cercles jaunes indiquent la sélection effectuée après examen du film, avant que les contours sont détectés, c, de la première jusqu'à la dernière image des cercles verts suivre étroitement les contours des protoplastes "bien élevés" soumises à analyse. (B) «parcelles Time'-cours (avec unités de numéro de l'image sur l'axe des abscisses) des superficies calculées dans les contours de protoplastes (« Zone », en pixels carrés ), pour chaque objet d'un suivi (et numérotée) protoplastes. (C) Le panneau d'entrée des paramètres de plug-in de la «Protoplast analyseur. Quatre «paramètres de détection» peuvent être ajustés pour ajuster l'algorithme de détection de protoplastes. Le «nombre de pixels à la frontière «Paramètre définit l'épaisseur minimale du contour de protoplastes (valeur par défaut: 5). Le paramètre «poids relatif» influe sur la différence de seuil de niveau de gris entre la zone de protoplastes intérieure et la bordure extérieure (par défaut: 2). Le 'rapport de la circonférence maximale »définit un seuil d'exclusion de protoplastes chaque fois que leur forme s'écarte d'un cercle. Ce paramètre est le rapport de la circonférence de protoplastes de la circonférence d'un cercle idéal ayant la même aire que le protoplaste (par défaut: 1,05). Le 'augmentation de la superficie maximale »(% d'augmentation par pas de temps) paramètre exclut protoplastes avec la zone du contour des hausses supérieures à la valeur du paramètre (valeur par défaut: 5%). Enfin, le plugin gère aussi des petits mouvements de protoplastes mais cessera de suivre protoplastes qui se déplacent rapidement ou qui disparaissent de la zone de l'image. Le film peut être recommencé autant de fois que nécessaire, et un seul de protoplastes peut être réanalysé séparément..com / fichiers / ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Le panneau «indicateur Fit» du programme Fit P f. Cette partie se traduit au cours du temps indicateur de transmission dans cours de temps de bain de l'osmolarité. (A) Recherchez le fichier de données enregistré contenant le cours du temps des changements de transmittance du colorant indicateur. (B) soit utiliser la liste sauvegardée auparavant, de variables et de paramètres, ou insérer manuellement les cinq valeurs de la variable de l'expérience actuelle: 'true_C_init »et« true_C_end' (les osmolarité de la solution de bain initial et la solution P f -assay perfusé via le bain) ', t_start_wash»(La durée du échantillonnage de base au niveau colorant indicateur initial),« threshold_% "(% de la valeur de référence, à laquelle le programme détecte automatiquement le départ de transmission de base 1; - 5% sont généralement les plus efficaces),« N_steady_st_pts »(le nombre d'échantillons - avec 10 échantillons représentant chaque image colorant indicateur pris - à la moyenne au niveau de l'état d'équilibre final du colorant indicateur, essentiel pour la conversion de la concentration du colorant indicateur de la concentration de osmoticum) et des estimations initiales pour deux des quatre paramètres du colorant indicateur de transmission sigmoïde cours du temps, «largeur» et t demi (Plus ou moins liée à la durée de la partie de transition de la sigmoïde, et à son point médian, respectivement; t la moitié peut être négatif!). Deux meilleurs paramètres d'ajustement, en plus de 'width' et t la moitié sont obtenus sans la nécessité d'une estimation initialees: décalage ("flush_lag '), le temps écoulé entre l'ouverture de soupape à l'arrivée de la solution dans le bain, et' C_init ', sans signification physique, mais nécessaires à la description de l'évolution dans le temps de l'osmolarité (voir le complémentaire P f Fit Guide de l'utilisateur.

Figure 4
Figure 4:. La concentration du colorant indicateur dans le bain et l'osmolarité du milieu (A) L'évolution dans le temps de la concentration du colorant indicateur, calculé directement à partir de données (points) et à partir des paramètres de meilleur ajustement (ligne) comme il est lavée distance par une solution non teint. (B) L'évolution dans le temps calculée de la variation de l'osmolarité de la solution de bain, en supposant qu'il suit la même dynamique que la variation de la concentration en colorant indicateur.

Figure 5 Figure 5:. L''Fit Volume' panneau du programme Fit P f (A) Recherchez le fichier de données en fonction du temps de la zone de la protoplastes analysé (B) Choisissez le «Dernier indicateur de pose 'option pour importer les paramètres d'expérimentation de l'. . dernière course à travers la «indicateur Fit '(voir le complémentaire P f Fit Guide de l'utilisateur des solutions de rechange) (C)« Modèle Type' / 'Class': Classe I contient le modèle le plus simple 1, classe II - modèles 2 - 5, classe III - les modèles à 6 - 8 Les modèles diffèrent par rapport à laquelle les paramètres sont fixés et qui sont en cours de réglage (par exemple, librement variable.) au cours de la procédure d'ajustement (cocher la case pour permettre de varier), et si oui ou non » SlopePf »et / ou« Retard »sont nulles. Le models: 1 - 6 sont discutés en détail par Moshelion et al 11.. «Combinaisons» énumère les choix de paramètres dictés par le choix de «Type de modèle» / «de classe». Parmi les modèles avec un résultat similaire en forme - choisir la plus simple! Initialiser le 'P f »,« Pente Pf »(« Slope_Pf') et les paramètres «retard» comme le montre (plus de détails sur «retard» dans E ci-dessous). (D) Les variables et les paramètres décrivant l'évolution temporelle de la osmoticum de bain changement sont entrées manuellement, ou comme décrit dans B. (E) Un terrain provisoire, invoqué en appuyant sur ​​"Exécuter", d'un cours de temps de changement de volume (calculé des zones de contour de la cellule), pour aider dans le choix de la valeur initiale pour le paramètre "Retard. Estimer, à l'oeil nu, la longueur totale de la ligne de base à partir de la 1 ère pointe jusqu'au début de changement de volume des cellules (la 'retard compris: la somme de 't-start-wash' + 'décalage' / 'ras-lag + le «retard» «physiologique»). Insérer cette valeur comme paramètre d'entrée pour le «retard» dans l'onglet 'VolumeFit »et« Run »à nouveau (voir aussi le Guide de l'utilisateur supplémentaire P f Fit).

Figure 6
Figure 6: Les résultats de montage (A) "Dans les coulisses": les cours à temps ultimes calculées des concentrations de osmoticum dans les deux compartiments:. Le bain (Cout, ligne verte) et la cellule (Cin, ligne bleue, Cin est calculé sur la base du changement de volume de protoplastes et une supposition que la membrane plasmique est perméable seulement à l'eau - le "vrai et osmomètre parfait" 11), et l'évolution temporelle de la différence entre eux (DELc, Ligne rouge), qui est la force motrice pour l'écoulement de l'eau, «Eo-Tlag» marque la fin de la «chasse d'eau-lag et le début de la contestation hypotonique (ici seulement à environ 21 secondes). Boîte rouge: l'erreur de la valeur ajustement (fit-ERR, voir définition en B ci-dessous) (B) Le résultat final de montage au cours du temps du volume;. Boîte verte: «VARIABLES D'ENTRÉE» sont les valeurs saisies via le panneau P f Fit / 'VolumeFit »(défini à la figure légende 5A). Boîte noire: «Exptl-vol» et «Vol-équipé» sont les données expérimentales et le volume calculé en utilisant les paramètres les mieux adaptés, respectivement, «Eo-Tlag 'est le même que dans A, les marques« Eo-retard de la le début du changement de volume. «Zone hausse de 3%» marque le niveau à partir duquel la surface a augmenté de 3%, la limite présumée à la capacité de la membrane cellulaire de s'étirer sans se rompre. «Pf (à l'échelle)» est le cours du temps de l'aménagement based calculé P f, couvrant les valeurs indiquées ci-dessous la boîte rouge comme «Span de P f '. Boîte rouge: 'EQUIPE paramètres' sont les valeurs des meilleurs paramètres d'ajustement: «Pf i '(P f initial),« retard »(la période entre le début du défi hypotonique et le début de la variation de volume (qui, selon le modèle 5 utilisé dans cet exemple, est aussi le début d'une variation de la valeur de f P), et «pente-P f '(la constante de vitesse de variation de la valeur P f' fit_ERR 'représentée en A. - l'objectif de minimisation de la procédure d'ajustement Matlab - est l'écart "racine carrée moyenne" (c'est à dire, une racine carrée d'un écart quadratique moyenne) d'un point vert de la ligne noire), présenté en% du volume de base Il. est par cette valeur que le succès relatif de montage répétée avec différentes valeurs paramètre d'initialisation est jugé. AMISE EN GARDE: Les valeurs de paramètre de meilleur ajustement pourraient être le résultat d'un minimum local trouvé dans la procédure de minimisation d'erreur - à vérifier qu'un minimum global a été trouvé, plusieurs passages sont nécessaires avec différentes valeurs d'initialisation pour ces trois paramètres (et la fit_ERR plus faible doit être recherchée au cours de ces tentatives boîte bleue:. deltas sont les changements qui ont eu lieu à la fin de la période équipée de changement de volume: «avg Volm%» est l'importance relative de la variation de volume de protoplastes calculé et «Espace avg% ' est la variation relative de la surface de protoplastes. taille initiale de la cellule est donnée par "rayon", dérivée de la valeur moyenne de la zone de contour de base de protoplastes.

Figure 7
Figure 7: Epi-fluorescence vue de microscopie de protoplastes du mésophylle (A) au titre de la lumière blanche émise et (B) une excitation à 488 nm et émission à 520 nm. Barre d'échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8:. Changement de volume et la perméabilité à l'eau osmotique extrait, (A) cours du temps P f (60 secondes) de protoplastes de gonflement lors d'une exposition à une provocation hypotonique (moyenne ± erreur type) (B) La concentration en agent osmotique calculé dans le bain au cours de la. défi hypotonique. Notez que, bien que le débit de la solution hypotonique a été mis en marche à 15 sec, il atteint le bain qu'après undécalage, ici de 5,9 sec. (C) P f (moyenne ± SE). Les astérisques indiquent des différences significatives de contrôle (p ≤0.05). Données provenant d'au moins trois expériences indépendantes pour chaque traitement avec un total de n protoplastes (contrôle: n = 52, AtPIP2; 1: n = 13, ZmPIP1; 2: n = 28, ZmPIP2; 4: n = 34).

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Discussion

Décrit ici est un procédé simple et très efficace pour la mesure de la P f de protoplastes végétaux isolés, en principe applicable aussi à d'autres cellules sphériques, par exemple., Les ovocytes de grenouille 11. Cette méthode est basée sur la mesure de la P f en réponse à un défi osmotique de la cellule. A la différence des autres méthodes basées sur cette approche, cependant, le changement de solutions, à savoir, d'osmolarité, n'est pas instantanée, mais progressive, au cours d'une perfusion de bain constant, à partir de la solution isotonique, dans lequel le volume de la cellule de référence est établie. En outre, ce procédé ne comporte pas une pipette d'aspiration et donc minimise la perturbation des protoplastes.

L'approche présentée ici permet des mesures à partir d'une variété de protoplastes, à partir de plantes ou de tissus différents. Cependant, à cause des calculs impliqués, seules les cellules sphériques peuvent être analysés. De plus, l'isolement enzymatique de the protoplastes et l'osmolarité des solutions doivent être ajustés aux cellules dosées (par exemple, l'isolement enzymatique de protoplastes du mésophylle tomate dure environ une heure, beaucoup plus longue que dans le cas des protoplastes d'Arabidopsis).

L'isolement des protoplastes d'Arabidopsis de les en suivant le protocole présenté est simple, rapide et efficace, ce qui donne un nombre élevé de protoplastes. Notamment, ce qui, avec leurs faibles niveaux basaux P f et leur efficacité de transformation élevée (figure 8), les un système attrayant pour l'expression fonctionnelle de AQP fait, afin de permettre des comparaisons quantitatives de P f induite par différentes isoformes PAQ. Lors de l'expression de ces AQP protoplastes avec un gène marqueur (tel que GFP), on peut facilement cribler les protoplastes dans la chambre expérimentale de cellules fluorescentes à analyser.

Il est utile de vérifier si ce système est une alternativ viablee d'ovocytes pour doser AQP même à partir de sources animales (protéines animales que fonctionnelles peuvent être exprimées dans des cellules végétales a été déjà démontré 17).

Utilisation de la f programme Fit P, deux autres paramètres, à côté de la P f, on obtient pour la description des réponses de protoplastes défis hypotonique: retard, le délai entre l'apparition des changements de volume et le début de bain perfusion, et la pente Pf, le taux de variation de P f pendant le défi osmotique (décrit en détail dans 11).

Pour chaque ensemble de la procédure d'ajustement des données expérimentales de volume doit être effectué plusieurs fois, en fournissant de départ (initialisation) pour différentes valeurs de ces paramètres, éventuellement le choix de la forme avec l'erreur la plus faible. Ce processus de minimisation d'erreur pourrait être décrit comme la recherche de la vallée la plus profonde (un «minimum global") dans un paysage de vallées avec des profondeurs différentes, parmi les hommescollines y, et essayant de ne pas être pris dans une vallée peu profonde (un «minimum local»).

Deux types de f P sont obtenus, f P au début de la réaction de gonflement hypo-osmotique («P f initial ') et P f calculée à la fin de gonflement de 15 secondes, en comptant à partir de la fin de l'   le retard ('P f fi nal »). La différence entre les deux est traitée entièrement par Moshelion et al. 11, en ​​ce qui concerne les six modèles analysés.

Il existe deux étapes critiques du protocole: d'une part, un bon ajustement de l'évolution temporelle de la concentration du colorant indicateur, d'autre part, un bon ajustement de l'évolution dans le temps du volume de gonflement de la cellule.

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Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du Fonds national belge pour scienti fi de la recherche (FNRS), l'Pôles d'attraction interuniversitaires Programme-belge Politique scientifique et les «Communauté française de Belgique-Actions de Recherches Concertées" FC, de la Fondation Israël science Jérusalem ( ISF) à MM (Grant # 1311-1312), et à NM (Grant # 1312-1312).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KCl Chem-Impex International 01247-1 http://www.chemimpex.com
Any source, anal. grade
CaCl2 Merck 11718006 http://www.merck.com
Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) Sigma 15152002 http://www.sigmaaldrich.com
Any source, anal. grade
D-Sorbitol Sigma 18032003 http://www.sigmaaldrich.com
Any source, anal. grade
Cellulase Worthington, Lakewood, NJ, USA LS002603 http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase Karlan,               Phonix, AZ, USA 8006 http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) Sigma 81420 http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9418-5G http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate Sigma P4380 http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine Sigma P8920 http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol Sigma X4126 http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy Merck 107921 https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope  Nikon Eclipse TS100/TS100F http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump BIO-RAD EP-1 Econo Pump http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera Scion Corporation CFW-1308M http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ Carnegie Mellon http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html
Free software
ImageJ NIH http://rsb.info.nih.gov/ij/
Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit BIO-RAD 731-9006 http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold DirectMed http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns) Welford IF-BR-001 http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing TYGON R-3603 http://www.usplastic.com
3M packaging Scotch tape 1'', clear Viking Industrial, UK VKMONO25 http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8
any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK

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References

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