Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P

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Summary

Medir o coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) de células pode ajudar a compreender os mecanismos de regulação de aquaporinas (AQPs). P f determinação em protoplastos de células de plantas esféricas aqui apresentados protoplastos envolve o isolamento e análise numérica da sua velocidade inicial da alteração de volume, como um resultado de um desafio osmótica constante durante a perfusão de banho.

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Shatil-Cohen, A., Sibony, H., Draye, X., Chaumont, F., Moran, N., Moshelion, M. Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example. J. Vis. Exp. (92), e51652, doi:10.3791/51652 (2014).

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Abstract

Estudar mecanismos de regulação AQP é crucial para a compreensão das relações de água, tanto no celular e todo os níveis de plantas. Apresentada aqui é um método simples e muito eficiente para a determinação do coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) em protoplastos de plantas, em princípio aplicável também a outras células, tais como esféricas oócitos de rã. A primeira etapa do ensaio é o isolamento de protoplastos a partir do tecido de planta de interesse por digestão enzimática para uma câmara com uma solução isotónica adequada. A segunda etapa consiste em um ensaio de desafio osmótica: protoplastos imobilizados no fundo da câmara é submetido a uma perfusão constante de partida com uma solução isotónica e seguido de uma solução hipotónica. O inchaço da célula é de vídeo gravado. Na terceira etapa, as imagens são processadas desligada para proporcionar mudanças de volume, e o curso de tempo das alterações de volume está correlacionada com a evolução no tempo da mudança de osmolarança do meio de perfusão da câmara, usando um procedimento de ajuste de curva escrito em Matlab (a 'PfFit'), para se obter P f.

Introduction

A absorção de água eo fluxo através das membranas celulares é um requisito fundamental para a existência de plantas, tanto no celular e todo os níveis de plantas. Ao nível celular, aquaporinas (AQPs) desempenham um papel fundamental na regulação do coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) da membrana celular 1-3.

Até à data, vários métodos têm sido utilizados para medir a endógena P f de protoplastos de diferentes órgãos da planta (ou seja, raízes, mesofilo, endoderme, etc., Revisado por Chaumont et al. 4). Uma das abordagens para medir P f é expor os protoplastos a um desafio osmótica e para controlar a velocidade inicial da sua alteração de volume (isto é., O declive da fase linear inicial da alteração de volume). Dois métodos diferentes foram previamente descritos com base nesta abordagem, tanto com base em uma troca instantânea de soluções. O primeiro consiste em immobilizing o protoplasto com uma micropipeta de sucção e interrupção do fluxo de solução a 5 e a segunda transferência de protoplasto de uma solução para outro, utilizando uma micropipeta 6. Estes métodos transferência de sucção micropipeta e micropipeta, que permitem a aquisição de imagens logo no início da troca rápida solução (para capturar a fase linear precoce de alteração de volume), provavelmente envolverá um esforço físico para protoplastos e requerem equipamentos especializados e micromanipulação especialista.

O método aqui descrito minimiza a perturbação das células, e não envolve a micromanipulação permite derivação de P f quando o banho de perfusão não é instantânea.

Após a digestão enzimática, os protoplastos, submersas numa solução isotónica, são imobilizados no fundo lamela de vidro de Plexiglass (aka Lucite ou perspex) por câmara de interacção de cargas. Em seguida, durante um banho de perfusão constante,a solução isotônica é nivelado afastado por uma solução hipotônica gerando um desafio hipoosmótico aos protoplastos. O inchamento do protoplasto é vídeo gravado e, em seguida, através da combinação da informação sobre a evolução no tempo do banho de perfusão e o curso de tempo da expansão celular, a P f é determinada por procedimentos de processamento de imagem e de ajuste de curva.

As vantagens deste método é que a experiência é muito eficiente, ou seja, é possível acompanhar algumas células simultaneamente em um único ensaio, e que não requer equipamento especial ou habilidades específicas de micromanipulação. Várias aplicações para este método são possíveis. Por exemplo, a determinação da P f nativo de uma variedade de células de diferentes tecidos e plantas, tais como mesófilo e agrupar as células da bainha de folhas de Arabidopsis 7, milho mesofilo ou células do córtex da raiz de 8-10 ou de suspensão de células cultivadas 11,12. Em additina, é possível determinar P f de células de animais, tais como células esféricas 11 oócitos. Outro exemplo envolve a análise da actividade AQP pela expressão transitória de seu gene nos protoplastos (ou quaisquer outros genes que possam afetá-los, por exemplo, genes de quinases) e determinação de sua contribuição para a P f; por exemplo, a expressão de tomate AQP SlTIP2; 2 em Arabidopsis mesofilo protoplastos por transformação PEG e determinação do SlTIP2; 2 relacionada com a P f 13. Finalmente, o exame do efeito sobre o f P de diferentes substâncias (moléculas / medicamentos, hormonas, etc) adicionado às soluções podem também ser examinadas, por exemplo, o bloqueador de AQP HgCl 2 7.

O protocolo seguinte descreve o isolamento de protoplastos de células e determinação da sua P f Arabidopsis mesófilo.

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Protocol

1 Preparação das Soluções

  1. Prepare isotónica (600 mOsm) e hipotónico (500 mOsm) soluções contendo 10 mM de KCl, 1 mM de CaCl2, e 8 H 2 (N-morfolino) Ácido -etanossulfónico (MES), pH 5,7 e ajustar a osmolaridade com as quantidades apropriadas de D-sorbitol: 540 mm para o isotônico e 440 mm para a solução hipotônica. Verificar a osmolaridade da solução (dentro de 3% do valor alvo), utilizando um osmómetro.
  2. Prepara-se uma pasta seca de 'mistura enzimática "contendo as enzimas seguintes: 0,55 g de celulase, 0,1 g pectolyase, 0,33 g de polivinilpirrolidona K 30, 0,33 g de BSA (ver Tabela 1 abaixo), a mistura de pó seco por vórtice, fazer alíquotas de 5,7 mg e armazenar a -20 ° C.

2 Isolamento de protoplastos de Arabidopsis mesófilo

  1. Prepara-se uma placa de Petri (10 cm) com cerca de 6 gotas (aproximadamente. 30 ul cada) de solução isotónica.
  2. Descasque as abaxial epiderme (inferior) de folhas de Arabidopsis, cut a folha desenrolada em quadrados de cerca de 4 x 4 mm 2, em seguida, coloque os quadrados sobre a solução isotônica cai com o lado abaxial exposta para baixo, tocando a solução.
  3. Dissolve-se 5,7 mg da mistura de enzima em 165 ul solução isotónica (3,3% w / w) em um tubo de 1,5 mL, misturar suavemente por pipetagem de um minuto ou então até se dissolver, e colocar várias gotas semelhantes da solução enzimática na mesma Petri prato.
  4. Transferir os pedaços de folhas para a solução enzimática gotas, fechar o prato de vedação com a tampa rodada de um parafilme e incubar durante 20 min, o prato flutuante em um banho de água regulado para 28 ° C.
  5. Adicionar algumas gotas de mais a solução isotónica com o prato (2 gotas por cada gota solução de enzima). Transferir cada pedaço de folha de uma nova gota solução isotónica e, em seguida, sequencialmente, a um segundo ponto (para lavar a solução enzimática de distância). Levante a peça pelas bordas usando uma pinça, agite-o na segunda queda (como um saquinho de chá) para liberar os protoplastos.Recolher as gotas com os protoplastos (usando uma pipeta de ponta de 100 ul cortado) para um tubo de 1,5 ml.

3. O hipotônico Desafio Ensaio: Inchaço celular Arabidopsis mesofilo

  1. Prepare o sistema de perfusão (Figura 1A), enchendo uma coluna com a solução isotónica e outra coluna com a solução hipotónica. Abra a válvula, deixe algum fluxo de solução (primeiro a hipotônica, em seguida, o isotônico) para encher o tubo todo o caminho para o colector de admissão (Figura 1B). Verifique se não há bolhas de ar, e em seguida, fechar a válvula.
  2. Selar uma lamela, utilizando massa de silicone (Tabela 1), para fazer uma parte inferior para a câmara no interior da corrediça de plexiglass (Figura 1B, ver também o esquema da câmara na Figura 1C). Para fazer com que a parte inferior da câmara (a superfície voltada para cima da lamela exposto dentro do anel de gordura) "pegajoso" para protoplastos, revesti-la-com carga positiva-rolamento de sulfato de protamina (1% em água; Tabela 1) ou poli-L-lisina (0,1% em água, Tabela 1). Espalhe esta "cola" sobre a lamela utilizando uma ponteira, esperar por 1-2 min, lavar 3-4 vezes com a solução isotônica e sacudir para longe a solução restante.
  3. Encher a câmara com a solução isotónica. Em seguida, adicione uma gota de protoplastos contendo solução para a câmara, usando uma ponteira cortado e esperar 3-4 minutos para os protoplastos para resolver. Cubra a câmara com uma tampa transparente (Figuras 1D, 1E) tocar a superfície da solução (evitar bolhas de interceptação abaixo).
  4. Coloque o slide (suavemente!) Em uma mesa de microscópio invertido, conectá-lo ao sistema de perfusão ea bomba (proteção contra bolhas de ar na tubulação!) E ligar o fluxo de solução isotônica para perfusão constante de 1 mL / min (taxas mais rápidas pode ser utilizado, até 4 ml / min).
  5. Para a gravaçãoas mudanças de volume, um microscópio invertido é usado, com um objectivo de 20X e com uma câmara de vídeo CCD ligada a um computador PC. Use o plugin 'CMU 1394 Camera Driver' do software ImageJ (veja a tabela de materiais específicos para os endereços de download destes dois pedaços de software) para gravar um filme de vídeo de 60 segundos de protoplastos imóveis selecionados (presumivelmente, aqueles que estão presos ao fundo) a uma taxa de uma imagem / segundo (1 Hz). Iniciar a gravação com uma lavagem de 15 seg de a solução isotónica (isto constitui a linha de base), para comutar a uma solução hipotónica para 45 segundos (para completar um total de 60 segundos a partir do início da perfusão). Salve o filme em formato TIF. NOTA: Escolha um campo de visão com o maior número de células possível, cumprindo os seguintes critérios: esféricas e com um contorno de células bem focada em seu maior perímetro (Figura 2A).

4. análise do volume celular mudar usando ImageJ

NOTA: Para analisar asérie de imagens de uma célula inchaço, use o campo 'Imagem Explorer' e 'plugins protoplastos Analyzer' no software ImageJ (escrito por Xavier Draye) 14. Começando com os protoplastos escolhidos em seu primeiro ponto de tempo, o plug-in 'protoplastos Analyzer' irá detectar automaticamente as bordas protoplastos (contornos) e calcular a evolução temporal de suas áreas durante o experimento (os plugins estão disponíveis com o programa de análise de PfFit, abaixo) .

  1. Comece ImageJ. Para abrir o filme, clique em "Arquivo" no painel de ImageJ, então, consecutivamente nos menus suspensos enquanto eles se desenrolam: 'Importar' então 'Imagem Explorer'. Realce o filme escolhido, em seguida, clique com o botão direito sobre ele, então clique em "protoplastos Analyzer '. Percorra o filme (usando um controle deslizante na parte inferior da imagem de protoplastos) para identificar protoplastos que permanecem em grande parte imóveis durante o experimento - estes serão analisados. De volta à primeira image, usando o mouse, desenhe círculos (escolhidos a partir das ferramentas de desenho ImageJ) em torno dos protoplastos selecionados (Figura 2B) e clique em 'OK' na tabela de "Parâmetros de detecção" que apareceram.
  2. Para iniciar o algoritmo de detecção de protoplastos, clique em 'Local' na imagem do painel superior protoplastos, em seguida, "processo" no menu suspenso. Examine os círculos verdes em torno das protoplastos selecionados (Figura 2C) durante todo o filme. Salve o 'resultado' em um arquivo do Excel. Saia do ImageJ. NOTA: No caso de um ponto vermelho aparece (para indicar um mau contorno apto - geralmente devido a um pobre contraste da imagem), execute novamente com parâmetros diferentes.
  3. Para separar as linhas pertencentes a cada célula (que - se duas ou mais células foram analisadas simultaneamente - serão interligados, porque a análise é feita quadro a quadro), em Excel, classificar os dados salvos pela coluna número de células ('objeto' ).
  4. Para Determine o fator de conversão pixel-a-mm para obter o valor real de P f, tirar uma imagem de uma régua micrométrica via o mesmo objetivo 20X microscópio. Arraste uma linha (escolhidos entre as ferramentas de desenho ImageJ) a imagem régua ao longo e ler o número de pixels equivalente ao comprimento da régua na parte inferior do painel principal do ImageJ. Converta os valores de área de pixel arbitrários no arquivo Excel em mM 2. Salve o curso áreas hora (para cada célula separadamente) como um arquivo de texto (duas colunas de números únicos). NOTA: Esta será uma entrada para o programa 'PfFit' de ajuste de volume.

5 Modelagem da Taxa de osmolaridade Mudança na Câmara Experimental Usando ImageJ eo f Fit Matlab Programa P

  1. Adicionar 2 mg de xilenocianol (Tabela 1, abaixo) a 100 ml de solução isotónica (para produzir o 'Indicador Dye').
  2. Prepare o sistema de perfusão (como em 3.1) com o Indicador Dye eo h não tingidosolução ypotonic.
  3. Selar a lamela utilizando graxa de silicone para o fundo da câmara de acrílico, em seguida, preencher com cuidado a câmara com o Indicador Dye, cobri-lo com uma lamela (como acontece com os protoplastos antes) e colocá-lo no palco microscópio.
  4. Ligue a câmara para o sistema de perfusão e a bomba, e ligar o corante indicador de fluxo para uma perfusão constante em l ml / min.
  5. Gravar um filme de 60 segundos, à taxa de 1 Hz. Inicie a gravação com 15 segundos de Indicador Dye, mudar para a solução hipotônica para 45 seg. Parar de filmar. Lave com o Indicador Dye (pelo menos durante 30 segundos), em seguida, começar um novo filme. Repita cerca de 5-6 vezes e salvar todos os filmes
  6. Use o software ImageJ para analisar as imagens de vídeo da transmitância Indicador Dye para obter um curso da mudança transmitância tempo em média.
    1. Comece ImageJ, clique em "Arquivo" e, em seguida, "Open", e navegar para o filme. Para cada filme, desenhar a 10 pixels de largura verticaisretângulo em qualquer lugar na 1 ª imagem do filme. Clique em 'Imagem' no painel principal do ImageJ, clique em 'Cortar' no menu suspenso.
    2. Para alinhar os 60 quadros (do filme de 60 segundos) em uma linha, clique novamente 'Imagem', em seguida, clique consecutivamente nos menus suspensos enquanto eles se desenrolam: 'Pilhas' e 'Fazer Montagem "(colunas 60, linhas 1). Desenhe um 1 pixel alta retângulo horizontal em qualquer lugar ao longo de toda a linha de imagens e clique em "Analisar" no painel principal do ImageJ, em seguida, clique em "perfil enredo" no menu suspenso. NOTA: A 'Lote de Montagem de' janela aparecerá (não mostrado), e uma lista de dados de transmitância pode ser aberta a partir do seu menu. Cada imagem do filme é representado nesta lista de 10 valores de transmitância originadas na sua 10 pixels de largura retângulo e, conseqüentemente, a "base de tempo" (o número seqüencial de imagem) é 10 vezes mais.
    3. Copie as listas da dat transmitânciaum (uma lista por vídeo) para um arquivo Excel. Calcular a média dos cursos de tempo de transmitância obtidas a partir dos vários filmes dos resplendores Indicador Dye. Gerar uma base de tempo real através da multiplicação do número sequencial de imagem por 0,1. Salve o curso de tempo média (duas colunas) para um arquivo de texto. NOTA: Antes de média, se desejar, traçar os períodos individuais, para rejeitar quaisquer irregularidades. Certifique-se de que o filme inclui, pelo menos, 5 segundos finais de transmitância em estado estacionário do corante indicador.
  7. Inicie o programa de encaixe P f Fit Matlab (painel de 'Indicador Fit ", Figura 3) para calcular os vários parâmetros do curso de tempo da osmolaridade. NOTA: com base nas concentrações iniciais e finais conhecidos da solução no banho, o curso do tempo da concentração osmótica mudança da solução é calculada a partir do curso de tempo de concentração (calculado, por sua vez, a partir do indicador de transmitância tintura), supondo que ele segue a mesma dinâmica como aconcentração de corante. P f Fit é um programa disponível para uso gratuito. O 'PfFit_Installer_web.exe' pode ser baixado a partir de: P f Guia Fit Usuário 'com explicações e definições é acessível através de Jove como um arquivo suplementar, que ajuda a familiarizar o usuário com a P f programa Fit.
  8. No painel 'Indicador Fit', importe os dados do curso o tempo médio do transmitância Indicador Dye ("arquivo de dados Indicador ', Figura 3A) e inserir manualmente os parâmetros da experiência atuais e as estimativas iniciais dos parâmetros" width "e" t_half 'descreve a evolução temporal da concentração Indicador Dye (Figura 3B. Clique em "Executar" para ver as parcelas dos cursos de tempo da concentração Indicador Dye (dados reais e em forma, Figura 4A), e do calculado banho modelado () osmolaridade (Figura 4B). NOTA: agood ajuste aos dados é essencial (uma recomendação: comece com os valores mostrados na Figura 3).

6 Determinar o f P usando o Matlab programa de adaptação P f Fit

NOTA: Além dos pressupostos básicos com relação ao comportamento de um protoplasto como um verdadeiro e perfeito osm�etro 11, a determinação do P f repousa na presunção de que P f pode mudar com o tempo, que essa dinâmica de P f subjacente ao tempo Claro que a variação de volume da célula e que três parâmetros são suficientes para descrever: fi P (o valor inicial de P f), Pista Pf (a taxa de variação linear de P f) e de retardo (o período desde o início do banho mudança osmolaridade até o início da alteração do volume da célula). Diferentes modelos podem ser testados, incluindo diferentes combinações desses parâmetros e seus valores, incluindo valores nulos 11. P 11, o tempo calculado experimental, por sua vez, a partir da série de áreas de células importado-contorno (ver também o Suplementar 'P f Guia Fit Usuário ").

  1. Mude para o 'Volume Fit' painel (Figura 5). Escolha para a importação do arquivo de dados de áreas (o arquivo de texto com o curso do tempo das "áreas" dos protoplastos analisados, Figura 5A). Escolha 'Last Indicador de montagem' como fonte de parâmetros (Figura 5B, ver o 'P f Guia Fit Usuário' de alternativas). NOTA: Estes parâmetros (Figura 5D) são então usadas para regenerar a mudança osmótico no banho para os volumes correspondentes ao procedimento.
  2. No painel 'Volume Fit' (Figura 5C), inicializar (preencher as estimativas iniciais para os parâmetros F) P: P f, Slope Pf e Delay (uma recomendação: começar com 1, 1, e 30, respectivamente), escolheu a modelo 'Class' (uma recomendação: começar com II e marca 'cheques' para todos os três parâmetros a serem instaladas). Clique em "Executar" e, em seguida globo ocular a figura provisória (Figura 5E) e ajuste o parâmetro Delay eo comprimento do registro, se necessário.
  3. Examine o gráfico resultados (Figura 6) para avaliar a qualidade em forma e gravar o erro em forma. Altere os parâmetros de inicialização alguns Dobre cada, e re-'Run '. NOTA: Não desanime quando o programa fica preso - basta reiniciar o programa!
  4. Repita esse procedimento várias vezes, começando com diferentes combinações de parâmetros de inicialização, visando o menor valor do erro em forma.
  5. Copie a lista dos resultados de ajuste diretamente a partir da tela, ou encontrá-los em tele PfFit gerado pelo arquivo '_FIT_Vol_Results.txt'.

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Representative Results

A fim de determinar o P f e comparar a actividade de diferentes AQPs, mesófilo protoplastos de folha de Arabidopsis são utilizados. Estes protoplastos foram encontrados a ter baixos basal (fundo) P f níveis 7 e pode servir como um sistema de expressão funcional para permitir medições P f reprodutíveis.

Os protoplastos a partir de uma folha madura a partir de uma planta Arabidopsis seis semanas de idade foram isolados e três construções de genes com os genes de Arabidopsis AQP (AtPIP2; 1) e milho (ZmPIP1; ZmPIP2 2 e, 4) foram transitoriamente (e separadamente) expressa utilizando a transformação PEG Método 15. Assumindo-se que o evento de transformação é simultânea para um grande número de plasmídeos aplicadas à célula, independentemente da sua natureza e com base nos resultados que mostraram uma taxa de sucesso de 100% para a expressão transitória sincronizada de dois plasmídeos em uma célula previamente relatado por outros sistemas de plantas15,16, que foram co-transformadas com um vector que codifica a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP), a fim de identificar os protoplastos transformados (Figura 7).

Para os ensaios de f P, os protoplastos foram definidos na câmara experimental (Figura 1B) e a GFP protoplastos marcado foram monitorados por vídeo enquanto eles foram inicialmente lavada com a solução isotónica (600 mOsm), em seguida com a solução hipotónica (500 mOsm), utilizando o sistema de perfusão (Figura 1A).

Os cursos de tempo das alterações de volume da célula (Figura 8A) foram obtidos para cada célula em dois estágios: primeiro, o 'Imagem Explorer' e encaixes 'protoplastos Analisador' foram utilizados para gerar o curso de tempo das alterações na área do contorno celular (Figura 2) e, em seguida, o programa Matlab encaixe P f Fit (Figura 5) foi utilizado para importar these áreas e convertê-los em volumes celulares. Os valores de P f (Figura 8C) foram derivados para cada célula usando o programa de ajuste P f (Figura 5), com base na evolução temporal dos volumes celulares e, além disso, no decurso do tempo em média importada de variações de transmitância do Indicador Corante (Figura 3), convertido para o curso de tempo da alteração da concentração indicadora de corante (Figura 4A) e em seguida, - para o curso de tempo da mudança banho osmolaridade (Figuras 4B, 6A e 8B). É de notar, que DELc, a diferença nas concentrações osmóticos na célula (Cin) e no banho (Cout), ou seja., A força motriz para a entrada de água, deveu-se quase só para a mudança de Cout (Figura 6A ). Nesta experiência, P f aumentado durante o ensaio (Figura 6B).

O P f f da célula de controlo transformada com GFP sozinho (Figura 8C).

Figura 1
Figura 1: O sistema de volume-ensaio. (A) A montagem experimental: O sistema de perfusão de solução contém reservatórios (colunas de infusão, 'Cols'), tubagem (T), as válvulas (V) e uma bomba peristáltica (P), ligada à lâmina de plexiglass definido na tabela de microscópio. SH = solução hipotónica, IS solução isotónica, Cm câmara. (B) uma vista aumentada da corrediça de plexiglass com a câmara experimental (Cr) e o tubo ligado através de uma entrada (In) do conector do bloco. A solução é aspirado a partir da câmara através de uma saída (para fora), para a bomba. (C) Um desenho esquemático o plexiglass slides (sentido anti-horário: vista de cima, vista do lado de comprimento e visão de curto lado): a = deslizamento tampa de vidro, a parte inferior central de câmara; b = fita adesiva clara (Tabela 1), que serve como um fundo para as ranhuras de entrada e de saída da solução levando a partir da secção central; quando a fita Scotch é substituído (apenas ocasionalmente), é aberto um orifício no-lo sob a câmara; c = um bloco de acrílico colado ao slide; d = um orifício de saída do conector. Os números são mm (mas o desenho não está à escala). (D) uma vista aumentada da porção central da lâmina com a cobertura transparente (também plexiglas) que cobre parcialmente a câmara central (setas) (E). Desenho esquemático (topo e vistas laterais) da tampa transparente. O tamanho do punho da tampa transparente (plástico verde em D) é arbitrária. Outros detalhes são como em C.

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Figura 2: Análise de inchaço protoplastos imagens usando o plug-in 'protoplastos Analyzer'. (A) a, a primeira imagem do filme com protoplastos, b, como em um, mas círculos amarelos indicam a seleção feita depois de rever o filme, antes que os contornos são auto-detectados, c, da primeira até a última imagem dos círculos verdes firmemente seguir os contornos dos protoplastos "bem-comportados" submetidas a análise. (B) "parcelas pratos Time' (com unidades de número de imagem sobre o eixo das abscissas) das áreas calculadas dentro dos contornos de protoplastos ('Area', em pixels quadrados ), para cada protoplastos rastreado (e numerados). (C) Os parâmetros do painel de entrada do plug-in do 'protoplastos analisador'. Quatro 'parâmetros de detecção podem ser ajustados para afinar o algoritmo de detecção de protoplastos. O "número de pixels de fronteira "Parâmetro define a espessura mínima do contorno de protoplastos (valor padrão: 5). O parâmetro "peso relativo" influencia o cinza diferença limiar nível entre a área de protoplastos interior e da fronteira externa (padrão: 2). A 'proporção máxima circunferência define um limite de exclusão de protoplastos, sempre que a sua forma se desvia de um círculo. Este parâmetro é a razão entre a circunferência de protoplastos para a circunferência de um círculo perfeito com a mesma área que o protoplasto (padrão: 1,05). O "aumento máximo area '(aumento% ao passo de tempo) parâmetro exclui protoplastos com área de contorno aumenta acima do valor do parâmetro (valor padrão: 5%). Finalmente, o plugin também lida com pequenos movimentos de protoplastos, mas vai parar de rastrear protoplastos que se movem rapidamente ou que desaparecem da área de imagem. O filme pode ser repetida quantas vezes forem necessárias, e uma única protoplastos podem ser novamente analisadas separadamente..com / files / ftp_upload / 51652 / "target =" 51652fig2highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Painel da P f programa Fit O 'Indicador Fit'. Esta peça traduz a evolução temporal transmitância indicador em curso o tempo do banho osmolaridade. (A) Procure o arquivo de dados salvo contendo o curso tempo de mudanças de transmitância do indicador Dye. (B) Ou usar a lista salva anteriormente de variáveis ​​e parâmetros, ou inserir manualmente os cinco valores de variáveis ​​do experimento atual: 'true_C_init' e 'true_C_end' (os osmolaridades da solução do banho inicial ea solução P f -assay perfundidos via o banho), 't_start_wash'(A duração da amostragem base no nível Indicador Dye inicial),' threshold_% '(% do valor de referência, em que o programa detecta automaticamente a partida de transmitância baseline; 1-5% são geralmente as mais eficazes),' N_steady_st_pts '(o número de amostras - com 10 amostras representativas de cada imagem Indicador Dye tomadas - para a média no nível de estado estacionário final do Indicador Dye, crucial para a conversão da concentração Indicador Dye à concentração osmótica) e estimativas iniciais para dois dos quatro parâmetros do curso de tempo sigmoidal Indicador Dye transmitância, "largura" e t metade (Aproximadamente relacionadas com a duração da parte de transição do sigmóide e do seu ponto médio, respectivamente; t metade pode ser negativo!). Dois melhores parâmetros de ajuste, em adição a "largura" e t metade são obtidos sem a necessidade de uma estimativa iniciales: lag ('flush_lag'), o tempo entre a abertura da válvula para a chegada da solução no banho, e 'C_init', sem significado físico, mas necessária para a descrição do decurso de tempo da osmolaridade (ver a carta P f Fit Guia do Usuário.

Figura 4
Figura 4:. Indicador A concentração de corante no banho e a osmolaridade do meio (A) O curso de tempo da concentração de corante indicador, calculado directamente a partir de dados (pontos) e a partir dos parâmetros de melhor ajuste (linha), como é lavado afastado por uma solução não tingido. (B) O curso da alteração da osmolaridade da solução de banho de tempo calculado, assumindo que segue a mesma dinâmica como a alteração da concentração indicadora de corante.

Figura 5 Figura 5:., O «volume Fit 'painel da P f programa Fit (A) Procure o arquivo de dados do curso vez que a área do protoplasto analisados ​​(B) Escolha o" Indicador Última Fitting "opção de importar os parâmetros da experiência do. . última corrida através do "Indicador Fit '(consulte o Guia do Usuário do Supplemental P f Fit alternativas) (C)" Modelo Tipo' / 'Class': Classe I contém o modelo mais simples 1, Classe II - modelos 2-5, classe III - Modelos de 6 - 8 Os modelos diferem no que diz respeito a quais parâmetros estão sendo fixa e que estão sendo ajustados (ou seja, variável livremente.) durante o procedimento de ajuste (marque a caixa para permitir que ele para variar), e se ou não ' SlopePf 'e / ou' Delay 'são nulos. O modols 1-6 são discutidas longamente por Moshelion et al 11.. "Concentrações 'lista as opções de parâmetros ditados pela escolha de' Modelo Tipo '/' Class '. Entre os modelos com um resultado encaixe similar - escolher o mais simples! Inicializar os parâmetros "atraso", conforme apresentado (mais detalhes sobre "atraso" em E abaixo) 'P f', 'Slope Pf' ('Slope_Pf') e. (D) As variáveis ​​e parâmetros que descrevem a evolução no tempo da mudança osmoticum banho são introduzidos manualmente ou conforme descrito em B. (E) Um enredo interino, invocado por bater 'Run', de um curso de tempo de mudança de volume (calculado a partir das zonas de contorno celular) para ajudar na escolha do valor inicial para o parâmetro "Delay". Estimado, a olho, o comprimento total da linha de base a partir do ponto de r 1 até ao início da variação de volume da célula (a 'atraso, inclusive: a soma de 't-start-wash' + 'lag' / 'lave-lag' + o "fisiológico" 'delay'). Insira este valor como parâmetro de entrada para o 'atraso' no painel 'VolumeFit' e 'Run' novamente (consulte também o Guia do Usuário Suplementar P f Fit).

Figura 6
Figura 6: Os resultados do ajuste (A) "Por trás das cenas": os períodos finais calculados das concentrações osmótica nos dois compartimentos:. Banho (Cout, linha verde) ea célula (Cin, linha azul; Cin é calculada com base na variação do volume de protoplastos e a suposição de que a membrana plasmática é permeável somente a água - o "osmómetro perfeito e verdadeiro" 11), e a evolução no tempo da diferença entre eles (DELc, Linha vermelha), a qual é a força motriz para o fluxo de água, 'Eo-tlag' marca o fim da "rubor-lag" e o início do desafio hipotónico (aqui apenas a cerca de 21 seg). Caixa vermelha: o erro do valor fit (caber-ERR, ver definição no B abaixo) (B) O resultado final da montagem do curso de tempo de volume;. Caixa verde: 'variáveis ​​de entrada "são os valores inseridos através da P f Fit /' VolumeFit 'painel (definido na Figura 5A legenda). Caixa preta: 'Exptl-Vol "e" Vol-montado "são os dados experimentais eo volume calculado usando os parâmetros de melhor ajuste, respectivamente,' Eo-tlag 'é o mesmo que em A, marcas' Eo-delay 'o o início da alteração de volume. 'Área acima de 3% "marca o volume em que a área de superfície aumentou 3%, o limite presumida para a capacidade da membrana celular para esticar sem se romper. 'Pf (escalado)' é o tempo de curso a montagem-based calculado P f, abrangendo os valores indicados abaixo da caixa vermelha como "Span de P f '. Caixa vermelha: "FIT parâmetros 'são os valores dos melhores parâmetros de ajuste:' Pf i '(o P f inicial),' delay '(o período entre o início do desafio hipotônico e o início da mudança de volume (que, de acordo com o modelo de 5 utilizado neste exemplo, é também o início de uma alteração no valor de f P), e 'encosta-P f' (a constante de velocidade de alteração do valor de P f 'fit_ERR' mostrado em A. - o alvo minimização do procedimento de ajuste Matlab - é o desvio "root-mean square" (ou seja, uma raiz quadrada de um desvio quadrado em média) de um ponto verde na linha preta), apresentados em% do volume inicial É. é por este valor que o relativo sucesso da montagem repetida com diferentes valores de parâmetro de inicialização é julgado. ANOTA DE CUIDADO: Como os valores dos parâmetros de melhor ajuste pode ser o resultado de um mínimo local encontrado no procedimento de minimização do erro - para verificar se um mínimo global foi encontrada, várias corridas são necessários com diferentes valores de inicialização para estes três parâmetros (e o menor fit_ERR deve ser procurado durante essas tentativas caixa azul:. deltas são as mudanças que ocorreram no final do período de mudança de volume equipada: 'avg Volm%' é a medida relativa da mudança de volume de protoplastos calculados e 'Area avg%' é a variação relativa da área de superfície de protoplastos. O tamanho inicial da célula é dada por 'raio', derivada do valor médio da área de protoplastos contorno basal.

Figura 7
Figura 7: Epi-fluorescência vista microscopia de protoplastos do mesófilo (A) sob a luz transmitida e branco (B) a 488 nm de excitação e 520 nm de emissão. Barra de escala:. 100 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8
Figura 8:. Mudança de volume e a permeabilidade à água extraída osmótica, P f (A), o tempo (60 segundos) de protoplastos inchaço após exposição ao desafio hipotónico (média ± SE) (B) A concentração osmótica calculado no banho durante a. desafio hipotônica. Note-se que, enquanto o fluxo de solução hipotónica foi ligado a 15 segundos, atingiu o banho só depois de umlag, aqui de 5,9 seg. (C) P f (média ± SE). Os asteriscos indicam diferenças significativas de controle (p ≤0.05). Dados de pelo menos três experimentos independentes para cada tratamento com um total de n protoplastos (controle: n = 52, AtPIP2, 1: n = 13, ZmPIP1, 2: n = 28, ZmPIP2; 4: n = 34).

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Discussion

Aqui descrito é um procedimento simples e muito eficiente para medir a P f isoladas de protoplastos de plantas, em princípio, aplicável também a outras células esféricas, por exemplo., Os oócitos de rã 11. Este método baseia-se na medição da P f em resposta a um desafio osmótico para a célula. Em contraste com os outros métodos com base nesta abordagem, no entanto, a alteração das soluções, ou seja, da osmolaridade, não é instantânea, mas gradual, durante um banho de perfusão constante, começando com a solução isotónica, em que o volume da célula basal é estabelecida. Além disso, este método não envolve uma pipeta de aspiração e, portanto, minimiza a perturbação para os protoplastos.

A abordagem aqui apresentada permite medições a partir de uma variedade de protoplastos, a partir de diferentes plantas ou tecidos. No entanto, por causa de os cálculos envolvidos, apenas as células esféricas podem ser analisados. Além disso, o isolamento enzimático de the protoplastos e a osmolaridade das soluções precisam de ser ajustados para as células ensaiadas (por exemplo, o isolamento enzimático de protoplastos de tomate mesófilo leva cerca de uma hora, consideravelmente mais longo do que no caso de protoplastos de Arabidopsis).

O isolamento de protoplastos de Arabidopsis mesófilo de acordo com o protocolo apresentado é simples, rápido e eficiente, dando origem a um elevado número de protoplastos. Notavelmente, este, juntamente com os seus baixos níveis de P f basais e à sua elevada eficiência de transformação (Figura 8), faz com que um sistema atractivo para a expressão funcional de AQPs, para permitir comparações quantitativas de P f induzida por diferentes isoformas AQP. Ao expressar AQPs nestes protoplastos com um gene marcador (por exemplo, GFP), pode-se facilmente pesquisar os protoplastos na câmara experimental para células fluorescentes para analisar.

Vale a pena verificar se este sistema é uma alternativ viávele de oócitos para ensaiar AQPs mesmo a partir de fontes animais (que as proteínas animais funcionais pode ser expressa em células de plantas foi já demonstrado 17).

Usando o f programa Fit P, mais dois parâmetros, ao lado do P f, são obtidos para a descrição das respostas aos desafios de protoplastos hipotônico: atraso, o tempo entre o início da mudança de volume eo início de banho de perfusão e Slope Pf, a taxa de mudança de P f durante o desafio osmótico (descrito em detalhe em 11).

Para cada conjunto do procedimento de ajuste de volume de dados experimentais precisa ser realizada várias vezes, fornecendo diferentes valores de partida (inicialização) para estes parâmetros, eventualmente, a escolha do ajuste com o menor erro. Este processo de minimização de erro poderia ser retratado como buscar o vale mais profundo (um "mínimo global") em uma paisagem de vales com diferentes profundidades, entre homemcolinas de y, e não tentar ser pego em um vale bastante superficial (um "mínimo local").

São obtidos dois tipos de f P, P f no início da resposta de inchaço hipoosmótico ('P f inicial ") e P f calculados no final de 15 seg de inchaço, contando a partir da extremidade de   o atraso ('P f fi nal'). A diferença entre os dois, será discutida por Moshelion et al. 11, no que diz respeito aos modelos analisados ​​6.

Existem dois passos críticos no protocolo: primeiro, um bom ajuste para o curso de tempo da concentração de corante indicador, em segundo lugar, um bom ajuste para a evolução no tempo do volume da célula de inchaço.

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Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por doações do Fundo Nacional Belga para fi Scienti c Research (FNRS), o Interuniversitário atração poloneses Programa-belga política científica e os "Communauté Française de Belgique-ações de Recherches Concertées" a FC, a partir do Israel Science Foundation Jerusalém ( ISF) para MM (Grant # 1311-1312) e NM (Grant # 1312-1312).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KCl Chem-Impex International 01247-1 http://www.chemimpex.com
Any source, anal. grade
CaCl2 Merck 11718006 http://www.merck.com
Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) Sigma 15152002 http://www.sigmaaldrich.com
Any source, anal. grade
D-Sorbitol Sigma 18032003 http://www.sigmaaldrich.com
Any source, anal. grade
Cellulase Worthington, Lakewood, NJ, USA LS002603 http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase Karlan,               Phonix, AZ, USA 8006 http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) Sigma 81420 http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9418-5G http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate Sigma P4380 http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine Sigma P8920 http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol Sigma X4126 http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy Merck 107921 https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope  Nikon Eclipse TS100/TS100F http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump BIO-RAD EP-1 Econo Pump http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera Scion Corporation CFW-1308M http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ Carnegie Mellon http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html
Free software
ImageJ NIH http://rsb.info.nih.gov/ij/
Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit BIO-RAD 731-9006 http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold DirectMed http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns) Welford IF-BR-001 http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing TYGON R-3603 http://www.usplastic.com
3M packaging Scotch tape 1'', clear Viking Industrial, UK VKMONO25 http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8
any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK

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References

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