जीवित चूहों में ऊरु अस्थि मज्जा आकांक्षा

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Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice. J. Vis. Exp. (89), e51660, doi:10.3791/51660 (2014).

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Abstract

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी पशु प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए दिशा निर्देश के अनुसार आयोजित किए गए थे और मेमोरियल स्लोअन-Kettering कैंसर केंद्र में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUCs) द्वारा अनुमोदित किया गया.

जांध की हड्डी से अस्थि मज्जा की 1. आकांक्षा (बीएम) कक्ष

  1. एक सटीक vaporizer के साथ प्रशासित isoflurane (1-4%) के साथ ऊरु अस्थि मज्जा आकांक्षा से गुजरना होगा जो माउस anesthetize. संज्ञाहरण की गहराई शल्य हेरफेर और / या कान, पैर की अंगुली, और पूंछ चुटकी के साथ जुड़े सांस की दर में कोई बदलाव नहीं आया है कि देख कर प्रक्रिया के दौरान हर 5-10 मिनट पर नजर रखी जानी चाहिए. संज्ञाहरण isoflurane के साथ प्रेरित और भी isoflurane के साथ प्रक्रिया में बनाए रखा है. 0.05-0.1 मिलीग्राम की एक खुराक पर buprenorphine के एक अग्रकय पूर्व प्रक्रियात्मक खुराक / किलोग्राम subcutaneously हर 6-12 घंटे एक adj रूप प्रक्रिया के साथ जुड़े दर्द को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैCarprofen को unct.
  2. कार्निया सुखाने को रोकने के लिए संज्ञाहरण के माउस निम्नलिखित प्रेरण की आंखों को नेत्र मरहम लागू करें.
  3. फर सावधानी इरादा आकांक्षा साइट के क्षेत्र से लगभग 150% बड़ा त्वचा के एक क्षेत्र से काटा गया है. ढीला फर एक नम धुंध पैड के साथ हटा दिया जाता है. प्रक्रिया के दौरान हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए एक परिसंचारी गर्म पानी पैड या अन्य सुरक्षित thermostatically नियंत्रित सतह पर माउस रखें.
  4. (एक povidone आयोडीन (Betadine) या एक chlorhexidine (Nolvasan) साफ़ और 70% isopropyl शराब या 70% इथेनॉल लथपथ धुंध स्पंज या तो साथ बारी) बारी scrubs के तीन सेट के साथ आकांक्षा से गुजरना होगा जो फीमर वाले संपूर्ण पैर कीटाणुरहित.
  5. बी.एम. aspirating से पहले बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ:;: एक 0.5 मिलीलीटर ट्यूबरक्यूलिन सिरिंज (27.5 जी गेज 0.5 सीसी मात्रा) गीले. पीबीएस के 200-500 μl के साथ सिरिंज भरें और तुरंत पीबीएस निष्कासित. इस प्रक्रिया में 2-3 टी दोहराएँIMEs.
  6. अनामिका या पांचवें उंगली के साथ या तो टिबिया धक्का द्वारा फीमर से टिबिया तुला रखें. एक उपयुक्त संवेदनाहारी विमान प्राप्त किया गया है कि पुष्टि करें. सिरिंज अंगूठे और तर्जनी का उपयोग कर आयोजित किया जाता है. इस condyles उजागर करने की अनुमति देता है और सुई की प्रविष्टि की सुविधा.
  7. सुई फीमर की दो condyles के बीच सुरक्षित रखा गया है कि ताकि सिरिंज गीला करने के बाद, patellar कण्डरा के माध्यम से सुई डालें. अंगूठे और तर्जनी के साथ फीमर की एपिफ़ीसिस के करीब अस्थिदंड धारण करके, सुई आसानी फीमर की शाफ्ट में डाला जाता है.
  8. यह फीमर की शाफ्ट के साथ समानांतर है कि इतनी जावक और ऊपर सुई कुंडा. इस कार्रवाई फीमर शाफ्ट से अस्थि मज्जा सामग्री की पुनर्प्राप्ति की सुविधा.
  9. ऊरु मज्जा गुहा में धीरे धीरे इसे आगे बढ़ाने जबकि वामावर्त सुई दक्षिणावर्त बारी और. धीरे एसवाई ले जाकर सुई की सही स्थिति की पुष्टिlaterally Ringe.
  10. आगे और पीछे बी.एम. गुहा के भीतर सुई घूम रहा है, जबकि धीरे, नकारात्मक दबाव बनाने, वापस सुई सवार खींच. नोट: बी.एम. aspirated की मात्रा आम तौर पर 0.4-0.8 x 10 6 कोशिकाओं mononuclear से मेल खाती है, जो लगभग 5 μl हो जाएगा. सफल आकांक्षा सिरिंज के आधार में सुई के शीर्ष में रक्त की उपस्थिति से नेत्रहीन की पुष्टि की जाएगी. कोई रक्त सिरिंज में देखा जाता है, तो यह एक छोटी हड्डी या ऊतक टुकड़ा सुई में फंस गया है कि संभावना है. यह (इस सिरिंज बी.एम. aspirating से पहले पीबीएस के साथ प्रीफिल्ड किया जाना चाहिए एक कारण है) पीबीएस में ऊपर और नीचे सवार को ले जाकर सुई से हटाया जा सकता है. ऊतक सिरिंज से उखाड़ फेंकना नहीं किया जा सकता है, तो एक नई सुई और सिरिंज (फिर पीबीएस के 200-500 μl के साथ सिरिंज गीला) का उपयोग करें.
  11. बी.एम. सफलतापूर्वक फीमर से aspirated है एक बार, फीमर और माउस से सुई और सिरिंज हटा दें.
  12. एक microfuge ट्यूब जनसंपर्क aspirated बी.एम. ले जाएँपीबीएस के 500 μl के साथ efilled. सबसे अनुप्रयोगों के लिए, बी.एम. कोशिकाओं को फिर आगे की प्रक्रिया यदि संभव हो तो जब तक बर्फ पर रखा जाना चाहिए.
  13. प्रक्रिया के पूरा होने के बाद 5 मिलीग्राम / किग्रा subcutaneously Carprofen साथ एनाल्जेसिक प्रशासन. फिर संज्ञाहरण से माउस को हटाने और पूरी तरह से ठीक है जब तक एक गर्म पैड पर जगह है. नोट: अगर ठीक से किया आकांक्षा प्रक्रिया के बाद अनुभवी कोई जटिलता या संकट नहीं होना चाहिए.
  14. आवास क्षेत्र के लिए चूहों लौटने से पहले, वे भोजन और पानी ambulate और तक पहुँचने में सक्षम हैं सुनिश्चित करते हैं. अगले 24 घंटे में संकट या बाद संक्रमण की प्रक्रिया के संकेत के लिए चूहों को ध्यान से देखें. लक्षण शामिल हैं: लगातार खून बह रहा है, रक्ताल्पता, सुस्ती. इन संकेतों के किसी भी पद प्रक्रिया में देखा जाता है, तो जानवर (ओं) euthanized किया जाना चाहिए. नोट: बी.एम. आकांक्षा / नमूना दोहराया जा सकता है लेकिन दोहराने की प्रक्रिया एक ही पैर को दोहराया आघात को रोकने के लिए विपरीत फीमर पर किया जाना चाहिए. Fr के बारे में उपलब्ध कम जानकारी हैequency कि बी.एम. आकांक्षा किया जा सकता है. ऊरु अस्थि मज्जा आकांक्षा आम तौर पर कोई अधिक बार हर 2 सप्ताह से दोहराया है.

Aspirated बी.एम. कोशिकाओं में सेलुलर सामग्री के 2. आकलन

  1. 4 सी या आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा एक microfuge ट्यूब में बी.एम. आकांक्षा और जगह से लिया गोली कोशिकाओं.
  2. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और फिर एसीके लाल रक्त कोशिका lysis बफर ("अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम" lysis बफर) के 500 μl में गोली resuspend.
  3. 10 मिनट के लिए लाल सेल lysis बफर में कोशिकाओं को सेते हैं और फिर पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 4 सी या आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर फिर मिश्रण नीचे स्पिन. नोट: लाल रक्त कोशिका lysed गोली अब बी.एम. mononuclear कोशिकाओं के होते हैं. ये FACS धुंधला, सेल गिनती, प्रत्यारोपण, Cytospin विश्लेषण और / या किसी भी अन्य उपयोग (बलिदान किया चूहों से काटा बी.एम. कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जाएगा बस के रूप में) के लिए resuspended किया जा सकता है.

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Representative Results

एक लाइव C57/B6 माउस का ऊरु बी.एम. आकांक्षा बलिदान के बाद ही माउस के पारंपरिक बी.एम. फसल द्वारा पीछा बी.एम. mononuclear कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया था. दो तरीकों से प्राप्त बी.एम. mononuclear कोशिकाओं तो, बी.एम. कोशिकाओं की (1) कोशिकीय विश्लेषण द्वारा विश्लेषण (2) hematopoietic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के रिश्तेदार आवृत्ति (HSPCs) का निर्धारण, और हल HSPCs (3) पूर्व vivo संस्कृति थे. बाद के प्रयोग, वंश नकारात्मक Sca1 + सी किट में + (LSK) कोशिकाओं बी.एम. आकांक्षा ने साथ ही पारंपरिक बी.एम. फसल से प्राप्त कोशिकाओं mononuclear से हल किया गया. प्रत्येक विधि द्वारा प्राप्त 150 LSK कोशिकाओं तो तकनीकी प्रतियों में 7 दिनों के लिए माइलॉयड एर्य्थ्रोइद साइटोकिन्स युक्त methylcellulose अर्द्ध ठोस मीडिया में चढ़ाया गया. चित्रा 1 ए में दिखाया गया डेटा, बी थोक कोशिकाओं और HSPCs के समान प्रकार और अनुपात शब्द के भागों से देखा और ऊरु बी.एम. आकांक्षा या पारंपरिक बी.एम. फसल या तो उपयोग कर cytometric विश्लेषण प्रवाह थे कि दिखाता है.

मात्रात्मक ऊरु अस्थि मज्जा आकांक्षा बनाम पारंपरिक अस्थि मज्जा फसल के साथ देखा LSK और माइलॉयड पूर्वज कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए आदेश में, हम 3 स्वतंत्र आकांक्षाओं और पारंपरिक मज्जा की फसल में कुल जीवित कोशिकाओं की एक आवृत्ति के रूप में LSK और सांसद subpopulations के प्रतिशत की तुलना में. चित्रा 1C में प्रदर्शित किया गया यह डेटा, पारंपरिक मज्जा फसल के साथ तुलना ऊरु आकांक्षा से एकत्र अस्थि मज्जा से LSK और सांसद subpopulations में कमी का पता चलता है (यह अंतर सांख्यिकीय किसी भी आबादी के लिए महत्वपूर्ण नहीं था, हालांकि).

Methylcellulose में पूर्व vivo संस्कृति द्वारा पीछा LSK कोशिकाओं की छंटनी (चित्रा -1 में दिखाया गया है) कॉलोनी नंबर और ऊरु अस्थि मज्जा आकांक्षा और पारंपरिक बी.एम. फसल से प्राप्त प्रकार की कोशिकाओं के समान में हुई. कॉलोनी प्रकार मनाया और प्रगणित CFU-GEMM (granulocyte, एरिथ्रोसाइट, एककेंद्रकश्वेतकोशिका, megakary शामिलocyte कॉलोनी के गठन इकाई), CFU जीएम (granulocyte, एककेंद्रकश्वेतकोशिका कॉलोनी बनाने की इकाई), और BFU ई (एर्य्थ्रोइद फट के गठन इकाई).

चित्रा 1
चूहों के बलिदान के बिना मज्जा सामग्री की परीक्षा की सुविधा के लिए जीवित चूहों में चित्रा 1. ऊरु अस्थि मज्जा (बीएम) आकांक्षा. (ए) राइट Giemsa लाइव चूहों के बीएम आकांक्षा के माध्यम से प्राप्त कोशिकाओं mononuclear की cytospins दाग. लगभग 0.4-0.8 x 10 6 कोशिकाओं mononuclear प्रत्येक व्यक्ति ऊरु आकांक्षा में प्राप्त किया जा सकता है. आम तौर पर चूहों के बलिदान के माध्यम से पारंपरिक बी.एम. सेल अलगाव बनाम ऊरु बी.एम. आकांक्षा (दाएं) द्वारा प्राप्त wildtype 6 सप्ताह पुरानी C57/B6 चूहों की सामग्री मज्जा रहे हैं यहाँ shown (बाएं) (पैमाने बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है). (बी) ऊरु बी.एम. आकांक्षा आकलन के लिए कोशिकाओं का एक पर्याप्त संख्या प्रदान करता हैhematopoietic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष डिब्बे के बयान यहाँ सचित्र के रूप में (सही: बीएम महाप्राण से कोशिकाओं, वाम: बलिदान किया चूहों से मज्जा की कटाई से प्राप्त कोशिकाओं). CD34 और FcγR अभिव्यक्ति विश्लेषण किया गया द्वारा परिभाषित के रूप में hematopoietic स्टेम कोशिकाओं से युक्त है और साथ ही वंश नकारात्मक Sca-1-C-किट + माइलॉयड progenitors और उनके उपप्रकार वंश नकारात्मक Sca -1 + सी किट + (LSK) कोशिकाओं (माता पिता के गेट के रहने वाले है , वंश नकारात्मक कोशिकाओं). पता चला प्रतिशत फाटक के भीतर कोशिकाओं के प्रतिशत को देखें. LSK (सी) मात्रा (कोशिकाओं, माइलॉयड पूर्वज (म. प्र.) कोशिकाओं, आम माइलॉयड progenitors (वंश नकारात्मक Sca-1-C-किट + CD34 + FcγR मध्यवर्ती +), granulocyte-बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं पूर्वज (वंश नकारात्मक Sca-1-C-किट + CD34 + FcγR +), और महामूललोहितकोशिका-एर्य्थ्रोइद पूर्वज कोशिकाओं (वंश नकारात्मक Sca-1-C-किट + CD34-FcγR-), पारंपरिक मज्जा फसल से जीवित कोशिकाओं की एक आवृत्ति के रूप में (n = 3) और ऊरु अस्थि मज्जा आकांक्षा (n = 3). त्रुटि सलाखों मानक डे का प्रतिनिधित्वmethylcellulose कॉलोनी परख की viation. (डी) प्रतिनिधि फोटो एक सप्ताह methylcellulose (ऊपर) और संख्या और कालोनियों के प्रकार प्रत्येक विधि से LSK कोशिकाओं का उपयोग कर मनाया युक्त माइलॉयड / एर्य्थ्रोइद में 150 LSK कोशिकाओं के चढ़ाना के बाद यह परिणाम है. मनाया और प्रगणित कॉलोनी प्रकार CFU-GEMM (granulocyte, एरिथ्रोसाइट, एककेंद्रकश्वेतकोशिका, महामूललोहितकोशिका कॉलोनी के गठन इकाई), CFU जीएम (granulocyte, एककेंद्रकश्वेतकोशिका कॉलोनी बनाने की इकाई), और BFU ई (एर्य्थ्रोइद फट के गठन इकाई) शामिल हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

सीरियल बी.एम. आकांक्षा मनुष्य में hematologic विकारों की चिकित्सीय जांच के लिए महत्वपूर्ण है एक नियमित प्रक्रिया है. लंबा प्रयोगों भर में सेलुलर संरचना और बीएम के घटक के लक्षण वर्णन के लिए चूहों में बी.एम. के एक अनुरूप धारावाहिक नमूने प्रदर्शन करने की क्षमता है वैसे ही बहुत मूल्यवान है. यह प्रक्रिया माउस का त्याग किए बिना लेकिन यह भी परिधीय रक्त की सामग्री बी.एम. में रहने कोशिकाओं को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है, जहां मामलों में बी.एम. में अतिरिक्त प्रकार की कोशिकाओं की उपस्थिति का पता लगाने के लिए HSPC के लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी है. सीरियल बी.एम. आकांक्षा मानव कोशिकाओं की उपस्थिति उदाहरण 3 के लिए immunocompromised चूहों में xenografted की निगरानी में यह बाद में इस उद्देश्य के लिए बहुत प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया गया है. 0.4-0.8 x 10 6 कोशिकाओं आम तौर पर हर बी.एम. आकांक्षा के साथ प्राप्त कर रहे हैं कि यह देखते हुए, इन कोशिकाओं कोशिकीय विश्लेषण (चित्रा 1 ए) सहित प्रयोजनों के एक नंबर, व्यास के लिए उपयोग किया जा सकता हैGnostic फ्लो (चित्रा 1 बी), सेल (चित्रा 1C) की संस्कृति सहित छांटी गई कोशिकाओं के आगे डाउनस्ट्रीम उपयोग के बाद cytometric सेल जुदाई, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, सीमित सेल नंबर की प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन की दिशा में सक्षम assays के लिए प्रोटीन निष्कर्षण, और आगे भी प्रत्यारोपण के प्रवाह की कोशिकाओं को निकाला. उसी समय, यह प्रत्येक ऊरु आकांक्षा में लिया HSCs की संख्या इस प्रक्रिया में लिया कोशिकाओं की कुल संख्या के द्वारा सीमित है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, वंश नकारात्मक Sca1 + cKIT + CD150 + CD48-CD244-कोशिकाओं के रूप में HSCs की परिभाषा पर विचार, HSCs की आवृत्ति लगभग 10 HSCs/100, 000 कोशिकाओं 7 है. इस आवृत्ति के आधार पर लगभग 40-80 HSCs प्रत्येक आकांक्षा प्रक्रिया के साथ प्राप्त होने की उम्मीद है. चित्रा 1C में नोट के रूप में भी, LSK और पूर्वज कोशिकाओं की आवृत्ति हड्डी MARRO में, सांख्यिकीय महत्व नहीं पहुंच पा हालांकि, कम हैऊरु अस्थि मज्जा आकांक्षा के माध्यम से प्राप्त डब्ल्यू कोशिकाओं पारंपरिक अस्थि मज्जा फसल के साथ तुलना में. हम शल्य अस्थि मज्जा फसल को आकांक्षा रिश्तेदार के साथ देखा इस रिश्तेदार LSK में कमी और पूर्वज आवृत्ति ऊरु अस्थि मज्जा आकांक्षा के साथ होता है कि परिधीय रक्त के साथ संदूषण से संबंधित है विश्वास. मज्जा में दुर्लभ सेल आबादी के मूल्यांकन में ऊरु अस्थि मज्जा आकांक्षा की इन सीमाओं को ध्यान दिया जाना चाहिए. एक अतिरिक्त ध्यान दें कि हम आम तौर पर 6 साल की उम्र के सप्ताह या उससे अधिक उम्र के चूहों में इस प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है. हम इस प्रक्रिया उम्र के 6 सप्ताह से भी कम चूहों के साथ तेजी से तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण होगा कि विश्वास करते हैं.

इस तकनीक को भी अच्छी तरह से चल रहे एक प्रतियोगी पुनर्गठन प्रयोग के संदर्भ में परिधीय रक्त के विरोध के रूप बी.एम. के काइमेरावाद का आकलन करने के लिए अनुकूल है. इन assays में चूहों की एक प्रयोगात्मक सेट से एचएससी के कार्यात्मक क्षमता एचएससी और का एक सेट ज्ञात संख्या के खिलाफ जांच कर रहा है# 8217; एस readout (Purton एट अल 8 द्वारा समीक्षा देखें.) परिधीय रक्त काइमेरावाद जा रहा है और साथ ही एचएससी के काइमेरावाद साथ. परिधीय रक्त की काइमेरावाद बी.एम. में काइमेरावाद से विपरीत हो सकता है अगर परिपक्व परिसंचारी रक्त कोशिकाओं में HSPC का बिगड़ा भेदभाव में hematopoietic स्टेम सेल कम्पार्टमेंट परिणाम को प्रभावित करने perturbations. प्रत्यारोपण 9 और उस काइमेरावाद बाद कम से कम 16 सप्ताह का समय 10 से भी लंबी अवधि के, इस तरह यहाँ सचित्र रूप में विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है HSPC डिब्बे को पहले उपयोग की सुविधा है, जो तकनीक के बाद बदल सकता है जब तक निश्चित hematopoiesis स्थापित नहीं है कि यह देखते हुए. एक ताजा उदाहरण में, challen एट अल. परिधीय रक्त में Dnmt3a-अशक्त चूहों से पता चला कम काइमेरावाद लेकिन Dnmt3a के HSC काइमेरावाद में एक उलटी वृद्धि से Dnmt3a की समयुग्मक प्रसवोत्तर विलोपन के साथ चूहों से बी.एम. कोशिकाओं की प्रतियोगी प्रत्यारोपणअशक्त एचएससी के बीएम 11 में. आत्म नवीकरण में वृद्धि के बावजूद एचएससी के - / - इस परिणाम Dnmt3a का भेदभाव दोष का संकेत था. इसके अलावा, इस परिणाम को हर 16 सप्ताह के अंतराल पर धारावाहिक प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण के प्रयोगों में ही प्राप्तकर्ता प्रतिरोपित चूहों के समय बलिदान पर देखा गया था. इसलिए चूहों के बलिदान की आवश्यकता होती है और चूहों की चल रही अवलोकन की अनुमति के बिना परिधीय रक्त के साथ समानांतर में बी.एम. कोशिकाओं का नमूना लेने के लिए अनुमति देते हैं जो assays काफी उपयोगी होते हैं.

जैसा कि पहले उल्लेख, यहाँ का प्रदर्शन तकनीक सीधे चूहों 2,3 की मज्जा गुहा अंतरिक्ष में intrafemoral इंजेक्शन के लिए उपयोग तकनीक के समान है. सीधी intrafemoral इंजेक्शन यह नसों में इंजेक्शन 6,12,13 के साथ सीधे तुलना में सुधार engraftment प्रदान करने के लिए दिखाया गया है जहां चूहों में मानव xenograft पढ़ाई को सुविधाजनक बनाने में बहुत उपयोगी साबित हो गया है. इस तकनीक को भी अनुमति देने के किया गया हैतेजी से मानव HSCs populating के पहले अज्ञात वर्ग की पहचान के लिए एड.

वर्तमान में यह एक ही फीमर के माध्यम से चूहों में बी.एम. के दोहराया नमूना बी.एम. या दोहराया आकांक्षाओं के साथ पुनः प्राप्त मज्जा की कोशिकाओं की संख्या के सेलुलर संरचना को प्रभावित करती है कि क्या ज्ञात नहीं है. इसके अलावा, एक ही फीमर से दोहराने आकांक्षा प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए उचित समय की न्यूनतम राशि ज्ञात नहीं है. एक ही माउस में दोहराया ऊरु अस्थि मज्जा आकांक्षाओं प्रदर्शन, बी.एम. आकांक्षा के लिए इस्तेमाल किया फीमर वैकल्पिक और> 2 हफ्तों के अंतराल पर धारावाहिक बी.एम. रेस्पायरेट्रस प्रदर्शन करते हैं. किसी भी अगर इसके अतिरिक्त प्रयास प्रकार और बीएम या बी.एम. की वास्तुकला से लिया कोशिकाओं की संख्या पर विशिष्ट अंतराल पर चूहों में सीरियल ऊरु बी.एम. आकांक्षा प्रक्रियाओं की, संभावित प्रभाव को समझने पर ध्यान केंद्रित की जरूरत है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS PAA H15-002
Bovine serum albumin PAA K41-001
ACK lysis buffer Homemade in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter.
8.3 g Ammonium chloride Fisher Scientific A661-500
1 g Potassium bicarbonate Fisher Scientific P184-500
200 μl 0.5 M EDTA pH 8 Gibco 15575-038
RPMI 1640 PAA E15-842
0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G Becton Dickinson 305620
Sterile cell strainer 70 μm Fisher Scientific 22363548
Isoflurane, USP Attane NDC:66794-014-25
Blunt-end needle Stemcell Technologies 28110
PrecisionGlide needle 23 G Becton Dickinson 305193
3 ml Syringe Luer-Lok tip Becton Dickinson 309657
Non-tissue culture treated plate, 6 Well Becton Dickinson 351146
12 x 75 mm 5 ml tubes  Becton Dickinson 352054 FACS staining
12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap Becton Dickinson 352235 FACS staining
NK1.1 APC-Cy7 Biolegend 108723
CD11b APC-Cy7 Biolegend 101225
CD45R (B220) APC-Cy7 Biolegend 103223
CD3 APC-Cy7 Biolegend 100222
Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 Biolegend 108423
Ter119 APC-Cy7 Biolegend 116223
CD19 APC-Cy7 Biolegend 302217
CD4 APC-Cy7 BioLegend 317417
CD117 (c-KIT) PE BioLegend 105808
Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 Biolegend 122513
CD34 APC Biolegend 128612
CD16/32 e450 eBioscience 48-0161-82
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma-Aldrich 32670
MethoCult GF M3434 STEMCELLTECHNOLOGIES 3434 For methocellulose culture
Carprofen Crescent Chemical Company C11045850 1 dose (5mg/kg) 
Flow cytometer, LSRFortessa Becton Dickinson
Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) Dechra-US 17033-211-38

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References

  1. Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
  2. Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
  3. Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
  4. Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
  5. Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
  6. Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
  7. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  8. Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
  9. Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
  10. Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
  11. Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
  12. Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
  13. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).

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