Доклинические мышиной модели метастазами в печени

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Доклинические, мышиной модели метастазами в печени осуществляется через инъекции технику hemispleen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Soares, K. C., Foley, K., Olino, K., Leubner, A., Mayo, S. C., Jain, A., Jaffee, E., Schulick, R. D., Yoshimura, K., Edil, B., Zheng, L. A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases. J. Vis. Exp. (91), e51677, doi:10.3791/51677 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Многочисленные мышиные модели были разработаны для изучения человека рака и улучшить понимание лечения рака и развития. Здесь, доклинические, мышиный поджелудочной модель опухоли печеночных метастазов через hemispleen инъекции сингенных мышиных панкреатических опухолевых клеток описана. Эта модель имитирует многие из клинических условиях у пациентов с метастазами в печень. Мыши последовательно развиваются метастазы в печени, позволяя для исследования метастатического процесса, экспериментальной проверки терапии, и иммунологии опухолей исследований.

Introduction

Протока поджелудочной железы аденокарциномы (PDA) является четвертой по значимости причиной, связанных с раком смертей в Соединенных Штатах 1. Пятилетняя выживаемость пациентов с метастатическим КПК является 2-12% 1. Хотя адъювантной и неоадъювантной химиотерапии рака поджелудочной железы является более эффективным сегодня, как никогда, все еще остается отчаянную необходимость новых видов лечения.

Развитие новой терапии требует надежных доклинических моделей животных. Хотя подкожные моделях опухолей просты в использовании, недостатки включают неспособность этих опухолей к метастазированию и имитировать прогрессирование опухоли и микросреды видел в человеческих раковых клеток. Генно-инженерные модели, такие, как генно-инженерного мыши, содержащей Kras и p53 нокаут в онкогенных мутаций (модель KPC) 2 и модель КЗК с клонов индикатора YFP (модель PKCY) 3 позволяют по изучению естественных опухолей в immunocompeteмышей NT. Кроме того, микросреда опухоли не изменяется и больше напоминает, что видел в опухолевой прогрессии человеческого. К сожалению, сроки развития опухоли можно изменять в этих моделях, что делает его трудно изучать экспериментальные методы лечения. Кроме того, возвратное скрещивание этих мышей требуется значительное количество времени и финансовых обязательств, что не всегда возможно. Наконец, имплантированные модели ксенотрансплантат PDA мыши вызывают необходимость иммунитетом мышей, которые изменили или отсутствующих микросреды опухоли. В результате, эффективность экспериментальных методов лечения продемонстрировали в этих доклинических моделей часто не воспроизводимы в человеческих клинических испытаний 4.

Эта модель использует мышь hemisplenectomy Panc02 опухолевых клеток, которые в высшей степени онкогенными, индуцированной метилхолантреном поджелудочной железы линии опухолевых клеток, полученная из мышей C57BL / 6 5, 6. Кроме того, другие мышиные линии PDA клеток, полученных от микрофона KPCE может быть использован в этой модели. Schulick др. Ранее разработали методику hemisplenectomy и создал сингенную модель мыши рака толстой кишки метастазы 7. Это hemisplenectomy модель (Рисунок 1) предлагает последовательное и равное прививку опухоли в иммунокомпетентных мышей кредитных себя к исследованию новых терапевтических агентов 7-10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных соответствовали директивам уходу и использованию комитета животных университета Джонса Хопкинса, и животные были введены в соответствии с руководящими принципами ассоциации по оценке и аккредитации лаборатории санитарной помощи (AAALAC). Хирургическая процедура выполняется в стерильных условиях в операционной, который подвергается как минимум пятнадцати воздухообмена в час. Все инструменты стерилизуют в автоклаве до процедуры и снова с 70% этанола в период между каждой мыши во время процедуры. Все мыши не ожидается, чтобы выжить хирургическую процедуру эвтаназии в соответствии с СО 2 в течение 3 мин с последующим смещением шейных позвонков, все еще ​​под наркозом.

1 Приготовление клеток

  1. Ресуспендируют культивируемые клетки Panc02 в фосфатно-буферном солевом растворе при 2 x10 7 клеток / мл, и держать на льду.

2 Подготовка Мышь

  1. Администрирование кетаминаE (100 мг / кг) смешивают с ксилазином (10 мг / кг) внутрибрюшинно 8-12 недельных мышей C57BL / 6 самок мышей в разделенных дозах.
  2. Проверьте, что носок щепотку снятие рефлекс отменены для того, чтобы мышь полностью под наркозом.
  3. Администрирование дополнительных доз кетамина (100 мг / кг), смешанные с ксилазином (10 мг / кг) по мере необходимости, чтобы полностью анестезию мыши.
  4. Применить Puralube Vet мазь для глаз мышей, чтобы предотвратить высыхание в то время как мыши под анестезией.
  5. Бритье хирургическую область мышей, чтобы избежать загрязнения раны.
  6. Подготовьте левую подреберье надреза с 70% этанола и затем йода.
  7. Поместите хирургической простыне вокруг живота для сохранения стерильности.

3 Лапаротомию

  1. Сделайте левой подреберье разрез в соответствии с левого уха через кожу и через брюшину скальпелем.
  2. Экспресс селезенки через разрез, применяя одновременно цифровой рдав ления вдоль черепных и хвостовых аспектов разреза.
  3. Найти селезенки кровеносные сосуды на нижнем конце селезенки.
  4. Разделите селезенки, поставив два Horizon среднего размера лигирования клипы в центре селезенки будьте осторожны, чтобы не повредить селезенки кровеносные сосуды в селезенки полюсов.
  5. Установите верхний полюс селезенки обратно в брюшину, чтобы избежать загрязнения.

4 опухоли Инъекции

  1. Составление 150 мкл фосфатно-буферным раствором в 26 G 5/8 "х шприца.
  2. Составьте 100 мкл Panc02 (2 x10 6) клеток в одном шприце поддержания шприц в вертикальном положении в течение всего времени во время инъекции.
  3. Dip иглу в 70% растворе этанола. Игла погружают в 70% этаноле, чтобы обеспечить стерильность.
  4. Введите клетки медленно в открытой hemispleen будучи уверенным, шприц хранится в вертикальном положении в любой момент времени. Конические из СиринGE должны соблюдаться во все времена через селезенки капсулы, чтобы избежать инъекционных клетки под селезенки. Отбеливание селезенки и сосудов следует соблюдать при инъекции.
  5. Поднимите селезенку и применять один средний Horizon клип под селезенки окклюдировать селезенки кровеносные сосуды.
  6. Нанесите один маленький клип Horizon в наиболее дистальной стороны поджелудочной железы и селезенки сосудов.
  7. Лигировать поджелудочную железу и селезенки сосуды от hemispleen по резке над клипами Horizon.
  8. Наведите на его 'стороне, и орошать разрез с дистиллированной водой.

5 животе Закрытие и выхода из наркоза

  1. Закройте брюшины с 4-0 Бегущая строчка.
  2. Применить 2:58 клипы кожи, чтобы закрыть разрез кожи.
  3. Администрирование 0,1 мг / кг бупренорфина или 5-10 мг / кг подкожно Carprofen, чтобы облегчить сообщение хирургической боли.
  4. Наведите на грелку для рекне Overy до мобильных и мышь демонстрирует закономерности дыхания. Животные только вернулся в компанию других животных после полного восстановления после хирургического вмешательства.

6 Вскрытие Экспертиза и Заготовка печени

  1. В период с 30 до 60 дней после операции, мыши начнут показывать клинические симптомы метастазов и потребует эвтаназию. Признаки метастазов, требующие гуманного эвтаназию включать расширенный животы и развитие асцита. Усыпить мышей при вдыхании СО 2.
  2. После ингаляции, выполнять шейки дислокации.
  3. После того, как животное было определено быть не реагировать, сделать надрез через брюшину выставить живот с помощью ножниц.
  4. Использование щипцов и ножниц, мягко сократить печень из живота.
  5. Поместите печень в октябре соединения, и вспышка заморозить с помощью жидкого азота. Хранить печень при -80 ° С. С другой стороны, в прямом эфиреR может быть зафиксирована в 16% нейтральном формалине с буфером при комнатной температуре в течение 24 ч и парафин.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Опухолевые Panc02 клетки вводят в hemispleen (Рисунок 1) форма печени метастазы в 100% мышей, в то время как в легких и перитонеальный метастазы не наблюдаются, если техника выполняется правильно. Эта техника была выполнена на более чем ста мышей с использованием Panc02 клетки в нескольких, независимых экспериментов, и воспроизводимо, все необработанные мыши погибают с метастазами в печень между 30 и 60 дней после процедуры hemisplenectomy (Рисунок 2). Для получения статистической значимости между необработанных и обработанных групп, десять мышей в группе необходимы. Тем не менее, это число будет меняться по отношению к клеточной линии и схемы лечения используется. Когда Panc02 клетки используются в данной модели, множественные метастазы печени можно наблюдать на аутопсии (рисунок 3).

KPC опухолевые клетки, которые сингенных поджелудочной железы линии опухолевых клеток, полученная из трансгенных мышей, имеющих ткане-специфической Крас и р53 домино вМутации 11, также могут быть использованы в этой модели. Использование этих клеток результатов в аналогичных метастазами в печень (фиг.4). Тем не менее, при оценке образование метастазов в печени с использованием другой клеточной линии, количество клеток вводили следует титрованию, пока все необработанных мышей не развиваются метастазы в печени. Panc02 клетки могут быть использованы в качестве положительного контроля, чтобы гарантировать, что операция была выполнена правильно. Важно отметить, что в то время как степень формирования метастазов в печени и выживание может варьироваться в зависимости от клеточной линии, используемой в течение одного эксперимента все необработанных мышей развитие метастазов в печени в подобной нагрузки и умирают от этих метастазов воспроизводимо в течение короткого периода времени. Поэтому нормализация опухолевой ультразвуком не нужно при использовании этого метода.

Несоблюдение побудить результаты метастазов в печени в нормального появления печени при вскрытии, что может свидетельствовать о том, что процедура была выполнена неправильно. Тем не менее, не смог или дelayed образование метастазов может привести следующие обращения с лечения, которые подавляют или ингибируют метастазирования (рисунок 5), в результате чего длительного выживания. Таким образом, эта модель может быть использована для оценки влияния различных терапевтических агентов на рост опухоли и образования метастазов.

Потому что это технически возможно оценить печень на УЗИ, небольшой ультразвуковой животных (Рисунок 6) 12 может быть использован для оценки образования в естественных условиях метастазов в печени. Кроме того, формирование метастазов может быть дополнительно изучена гистопатологии следующие вскрытии (рисунок 7).

Рисунок 1
Рис.1 Схема модели hemisplenectomy, который используетсяДля создания поджелудочной железы с метастазами в печени Panc02 опухолевых клеток.

Рисунок 2
Рисунок 2 представитель выживание мышей C57BL / 6 после прохождения Panc02 hemisplenectomy в день 0 показано на кривой Каплана-Мейера (N = 10). Мышей инъецировали опухолевыми клетками Panc02 в этой модели будет все умирают от 30 до 60 дней после Процедура, если Антинеопластические лечения не проводится.

Рисунок 3
Рисунок 3 Общая исследование печени после инъекции Panc02 клеток в hemispleen показывает метастазы в печени (ИндикаТед стрелками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4 Общая исследование печени следующей hemispleen инъекцию КЗК опухолевых клеток в hemispleen показывает метастазы в печени (черные стрелки), которые заменяют нормальный печеночной паренхимы (белая стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5 >
Рисунок 5 Общая исследование печени следующей эффективного терапевтического вмешательства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6 УЗИ печени с использованием Vevo 660 зверек ультразвук на мышь с большим метастатического поражения в печени (черная стрелка) в соответствии с процедурой hemisplenectomy. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ig7highres.jpg "SRC =" / файлы / ftp_upload / 51677 / 51677fig7.jpg "/>
Рисунок 7 H & E окрашивание парафином метастазами в печень, образованных Panc02 клеток в модели hemisplenectomy. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Это доклинические мышиной модели рака поджелудочной метастазов рака в печень через инъекции технику hemispleen является первой моделью описано, что отражает многие из клинических и иммунологических условий больных с метастазами в печень. Эта модель имеет ряд преимуществ по сравнению с другими мышиных моделях. Во-первых, в отличие трансгенные модели рака поджелудочной железы, в котором только 30% мышей, развиваются метастазы в печень и сроках формирования метастазов вполне переменной, эта модель имеет то преимущество, последовательно получения метастазов в печень в 100% мышей при равномерное время, позволяет исследователям изучать метастазы в этой обстановке. Кроме того, эта модель сохраняет наивную hemispleen чтобы обеспечить периферической крови иммунной анализа в воспроизводимым модели. Кроме того, в отсутствие противоопухолевых препаратов, мыши погибают от прогрессирования опухоли при последовательной момент времени в зависимости от начальной нагрузки опухоли и выживаемость соответствуетот одного эксперимента к другому. Наконец, эта модель имеет целый ряд приложений, включая исследования метастазов в печень 13, иммунологии опухолей 10, и тестирование экспериментальной терапии 9.

Критические этапы этой техники препарат клеточной суспензии, инъекции опухолевых клеток, размещение клипов горизонт, и размещение клипов кожи. Для обеспечения успешной операции и избежать возможных перекосов результатов, следующие изменения критических шагов может быть необходимым. Прежде всего, при подготовке клеточной суспензии, крайне важно, чтобы один суспензию клеток быть получены и введены в hemispleen. Малой стук опухолевых клеток будут загораживать селезенки сосуды и привести к преждевременной смерти во время операции. Этого можно избежать путем ресуспендирования клеток в declumping агента и путем подготовки каждый шприц для инъекций непосредственно перед инъекцией. Кроме того, в ходе подготовкишприц, крайне важно, чтобы клетки не смешивать с фосфатным буферным раствором заподлицо. Это может быть достигнуто путем первого составления фосфатно-буферным раствором, а затем очень медленно составления клетки, чтобы избежать путаницы, сохраняя шприц в вертикальном положении в любой момент времени. Во-вторых, во время стадии впрыска опухолевых клеток, конические шприца следует соблюдать в любое время с помощью селезеночной капсулы, чтобы избежать инъекций клеток в селезенке. Отбеливание селезенки и кровеносных сосудов, должны быть соблюдены при инъекции, который указывает, что опухолевые клетки были успешно введен в селезенке. В младшей мышей с меньшими селезенки, может быть необходимо вводить меньший объем флеш чем риск клеток, вытекающими из селезенки. Если утечка подозревается, заложить мышей на их стороне и мыть селезенку дистиллированной водой до ушивание мышей, чтобы помочь устранить любые клетки, которые могут просочились во время стадии впрыска. Если не удалить эти клетки приведетВ роста опухоли в месте инъекции, который может привести к смерти до достижения адекватных метастазы. В-третьих, размещение клипов Horizon под hemispleen имеет важное значение для обеспечения того, чтобы нет кровотечения после удаления hemispleen. Дополнительные зажимы горизонт может быть использован для окклюзии сосудов по мере необходимости. Окончательный важным шагом этой методики является размещение клипов кожи. Если мышей быть следующие за выживание, это может быть необходимо, чтобы шов на кожу мышей, а не с помощью зажимов кожи. Иногда клипы кожи будет падать до полного заживления кожной раны, которые могли бы оказать мышей восприимчивы к инфекции. Наложение швов на коже, отдельно от брюшины, будет предотвратить эту проблему.

Хотя этот метод имеет неоценимое значение для изучения метастатического процесса и метастазов, эта модель имеет несколько ограничений. Во-первых, воспроизводимые природа этой модели делает его более предпочтительным, чем трансгенных и orthotopiC модели для исследования метастатического процесса и микросреды опухоли в пораженных метастазами. Тем не менее, в силу характера модели, только последние шаги метастатического процесса, экстравазации и колонизации, могут быть изучены. Это ограничивает полезность этой модели для изучения полный метастатического процесса и не позволяет расследования сигналов, стимулирующих intravasation опухолевых клеток. Во-вторых, в то время как важно, чтобы сохранить полную иммунную функцию у этих мышей, сохраняя половину hemispleen, анализ лимфоцитов в печени включают в себя как лимфоциты от нормальной печени, а также лимфоцитов из микросреды опухоли, что может привести к необъективной представления истинного иммунного статуса в рамках микросреды опухоли. Использование более агрессивных линий опухолевых клеток, что приводит к более обширных метастазах в печень может помочь преодолеть это ограничение модели. Кроме того, если метастазы визуализируются на аутопсии, это может быть possiblэ рассекать метастазы из нормальной печени и анализировать только лимфоциты, найденные в метастазах далее в обход этой проблемы. Таким образом, в то время как эта модель имеет ряд недостатков, он также предлагает множество преимуществ по сравнению с другими моделями, и поэтому следует использовать дополняют эти модели при изучении метастазы в печень.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют соответствующих конфликтов интересов раскрывать.

Acknowledgements

KF и КО являются со первая авторов наряду с KS

Эта работа была частично поддержана в AHPBA Fellowship (KS), NIH K23 CA148964-01 (LZ), Johns Hopkins Школа Медицины клинический научный Award (LZ), Viragh Фонд и Центр Пропустить Viragh рака поджелудочной железы в Университете Джона Хопкинса (EMJ и LZ), Национальный Поджелудочная железа Foundation (LZ), Lefkofsky Фонд семьи (LZ), SPORE NCI в двенадцатиперстной кишки P50 CA062924 (EMJ, LZ), Lustgarten Foundation (LZ), и гранты Sol Goldman поджелудочной Центр исследования рака (KS , ППТ, LZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture media and components will vary depending on cell line
Phosphate Buffered Saline Gibco by Life Technologies 10010-023
15 ml centrifuge tubes Corning 430052
Curved Operating Scissor Roboz Surgical Store RS-6835
Micro Dissecting Graefe Forceps Roboz Surgical Store RS-5130
Needle holder (regular) World Precision Instruments, Inc
3-0 or 4-0 suture courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled Teleflex 137085
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled Teleflex 237115
Weck Horizon medium ligating clips Teleflex 002200
Weck Horizon small ligating clips Teleflex 001200
Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip Becton Dickinson 309625
Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip Becton Dickinson 309597
9 mm Autoclip Applier Mikron 427630
9 mm Autoclip Becton Dickinson 427631
Heating pad Sunbeam CAT93
70% Ethanol sold by numerous vendors
Ketamine Hydrochloride  Hospira 22395DD
Xylazine hydrochloride Sigma X1251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. Atlanta. (2013).
  2. Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
  3. Rhim, A. D., et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell. 148, 349-361 (2012).
  4. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).
  5. Corbett, T. H., et al. Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice. Cancer research. 44, 717-726 (1984).
  6. Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma. Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).
  7. Jain, A., et al. Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases. Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).
  8. Yoshimura, K., et al. Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes. Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).
  9. Yoshimura, K., et al. Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells. Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).
  10. Olino, K., et al. Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases. Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).
  11. Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer cell. 7, 469-483 (2005).
  12. Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods. Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).
  13. Zheng, L., et al. Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer. PloS one. 6, e19390 (2011).

Comments

6 Comments

  1. Thank you for your video and method. A small confusion, we draw up PBS first and then draw up tumor cells slowly to avoid mixing , but why mixing is needed to be avoided? What is the purpose of this step? If tumor cells mix with PBS in the syringe, what will happen? First PBS second tumor cells, so when we inject into the spleen, tumor cells will be sent into the spleen first, why we need to inject 150ul PBS?(This time the tumor cells have already been injected). Look forward to hearing from you! Regards!

    Reply
    Posted by: Mo C.
    October 18, 2016 - 4:28 PM
  2. The purpose of the PBS flush is to push the cells that were injected into the spleen into the liver by way of the splenic vasculature. If the flush is omitted, the injected cells will primarily colonize in the spleen, which will result in the mice dying prematurely and very few, if any, hepatic metastases will develop. If the PBS flush is performed correctly, all of the tumor cells will be flushed into the liver, which will also help reduce mouse-to-mouse variability and ensure that roughly the same number of cells make it to the liver to develop hepatic metastases. I hope this helps to clarify.

    Reply
    Posted by: Kelly F.
    October 18, 2016 - 4:58 PM
  3. It's very useful! And one more thing pls, "If the flush is omitted, the injected cells will primarily colonize in the spleen, which will result in the mice dying prematurely and very few", why do mice die when tumor cells colonize? Thank you for replying!

    Reply
    Posted by: Mo C.
    October 19, 2016 - 9:32 AM
  4. The mice will die prematurely because the tumors will grow very quickly, so the mice will die from the large tumors.

    Reply
    Posted by: Kelly F.
    October 20, 2016 - 3:16 PM
  5. This is not my field of expertise so please excuse my ignorance. What is the purpose of using this hemisplenectomy injection technique instead of injecting into the entire spleen and leaving it intact? Is it due to the aggressiveness of these cancer cells? Do you think this surgery is necessary when injecting agents other than tumor cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 21, 2017 - 12:13 PM
  6. If the spleen is injected, left intact and in situ, tumor growth will then occur in the spleen instead of being limited to liver only disease. I can not speak to agents other than tumor cells. This model was designed as aa preclinical, murine tumor model of hepatic metastases.

    Reply
    Posted by: Kevin S.
    June 22, 2017 - 9:25 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics