A preclínicos modelo murino de metástasis hepática

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Summary

Un modelo preclínico, murino de metástasis hepáticas realiza a través de una técnica de inyección hemispleen.

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Soares, K. C., Foley, K., Olino, K., Leubner, A., Mayo, S. C., Jain, A., Jaffee, E., Schulick, R. D., Yoshimura, K., Edil, B., Zheng, L. A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases. J. Vis. Exp. (91), e51677, doi:10.3791/51677 (2014).

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Abstract

Se han desarrollado numerosos modelos murinos para estudiar los cánceres humanos y avanzar en la comprensión de tratamiento y desarrollo del cáncer. Aquí, se describe un modelo preclínico, de páncreas murino tumoral de las metástasis hepáticas por medio de una inyección hemispleen de las células tumorales pancreáticas murinos singénicos. Este modelo imita muchas de las condiciones clínicas en pacientes con enfermedad metastásica en el hígado. Los ratones desarrollan consistentemente metástasis en el hígado permitiendo para la investigación del proceso metastásico, las pruebas de terapia experimental, la investigación y la inmunología tumoral.

Introduction

Adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) es la cuarta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos 1. La supervivencia de cinco años para los pacientes con PDA metastásico es 2-12% 1. Aunque la quimioterapia adyuvante y neoadyuvante para el cáncer de páncreas es hoy más eficaz que nunca, sigue existiendo una necesidad desesperada de nuevas terapias.

El desarrollo de nuevas terapias requiere modelos animales preclínicos fiables. Aunque los modelos de tumores subcutáneos son sencillos de usar, inconvenientes incluyen la incapacidad de estos tumores y metástasis a imitar la progresión tumoral y microambientes visto en los cánceres humanos. Modelos de ingeniería genética, tales como el ratón ingeniería genética que contiene Kras y p53 knock-in mutaciones oncogénicas (el modelo KPC) 2 y el modelo KPC con un trazador de linaje YFP (el modelo PKCY 3) permiten el estudio de tumores que ocurren naturalmente en immunocompeteratones NT. Además, el microambiente tumoral se altera y se asemeja más estrechamente a la observada en la progresión tumoral humano. Por desgracia, el calendario de desarrollo de tumores es variable dentro de estos modelos, lo que hace difícil el estudio de terapias experimentales. Además, el retrocruzamiento de estos ratones requiere una cantidad significativa de tiempo y compromiso financiero, que no siempre es factible. Por último, los modelos de PDA xenoinjerto de ratón implantadas, requieran ratones, que han alterado o microambientes tumorales ausentes inmunocomprometidos. Como resultado, la eficacia de terapias experimentales demostrado en estos modelos preclínicos a menudo no son reproducibles en ensayos clínicos humanos 4.

Este modelo de ratón hemisplenectomy utiliza células tumorales Panc02, que son una, inducida por metilcolantreno de páncreas línea celular de tumor altamente tumorigénico derivado de ratones C57BL / 6 5, 6. Además, otras líneas celulares PDA murinos derivan del micrófono KPCe se puede utilizar en este modelo. Schulick et al. Han desarrollado previamente una técnica hemisplenectomy y ha creado un modelo de ratón singénico de metástasis de cáncer de colon 7. Este modelo hemisplenectomy (Figura 1) ofrece la inoculación del tumor consistente e iguales en ratones inmunocompetentes se presta a la investigación de nuevos agentes terapéuticos 7-10.

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Protocol

Todos los experimentos con animales se ajustaban a las directrices del Comité para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins, y los animales fueron mantenidos de acuerdo con las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Laboratorio (AAALAC). El procedimiento quirúrgico se realiza bajo condiciones estériles en un quirófano que sufre un mínimo de quince cambios de aire por hora. Todos los instrumentos son esterilizados en autoclave antes del procedimiento y de nuevo con etanol al 70% entre cada ratón durante el procedimiento. Todos los ratones que no llegará a la intervención quirúrgica son sacrificados bajo CO 2 durante 3 minutos seguido por dislocación cervical, mientras que todavía en la anestesia.

1. Preparación de la célula

  1. Resuspender las células cultivadas en Panc02 fosfato salino tamponado a 2 x10 7 células / ml, y mantener en hielo.

2. Preparación Ratón

  1. Administrar ketaminae (100 mg / kg) mezclado con xilazina (10 mg / kg) por vía intraperitoneal a 8-12 semanas de edad C57BL / 6 ratones hembra en dosis divididas.
  2. Compruebe que la punta retirada pizca reflejo se abolió para asegurarse de que el ratón esté totalmente anestesiado.
  3. Administrar dosis adicionales de ketamina (100 mg / kg) mezclado con xilazina (10 mg / kg) según sea necesario para anestesiar totalmente los ratones.
  4. Aplicar Puralube Vet Ungüento para los ojos de los ratones para que no se seque mientras que los ratones están bajo anestesia.
  5. Afeitar el área quirúrgica de los ratones para evitar la contaminación de la herida.
  6. Preparar el área subcostal izquierdo de la incisión con etanol al 70% y luego yodo.
  7. Coloque un paño quirúrgico alrededor del abdomen para mantener la esterilidad.

3. laparotomía

  1. Hacer una incisión subcostal izquierda en línea con el oído izquierdo a través de la piel y a través del peritoneo usando un escalpelo.
  2. Expresar el bazo a través de la incisión aplicando p digitales simultánearesión a lo largo de los aspectos craneal y caudal de la incisión.
  3. Localizar los vasos sanguíneos esplénicos en el extremo inferior del bazo.
  4. Divida el bazo mediante la colocación de dos medianas clips de ligadura Horizon en el centro del bazo teniendo cuidado de no dañar los vasos sanguíneos del bazo en los polos del bazo.
  5. Coloque el polo superior del bazo de nuevo en el peritoneo para evitar la contaminación.

Inyección 4. Tumor

  1. Elaborar 150 l de solución salina tamponada con fosfato en un 26 T x 5/8 "de la jeringa.
  2. Elaborar 100 l de Panc02 (2 x10 6 células) en la misma jeringa manteniendo la jeringa en posición vertical en todo momento durante la inyección.
  3. Sumergir la aguja en una solución de etanol al 70%. La aguja se sumerge en etanol al 70% para asegurar la esterilidad.
  4. Inyectar las células lentamente en el hemispleen expuesta asegurándose la jeringa se mantiene en posición vertical en todo momento. El bisel de la Syringe debe observarse en todo momento a través de la cápsula esplénica para evitar la inyección de las células en el bazo. Un blanqueamiento del bazo y los vasos sanguíneos se debe observar después de la inyección.
  5. Elevar el bazo y aplicar un medio Horizonte clip debajo del bazo para ocluir los vasos sanguíneos esplénicos.
  6. Aplicar un pequeño clip Horizonte al aspecto más distal del páncreas y vasos esplénicos.
  7. Ligar el páncreas y los vasos esplénicos de la hemispleen cortando por encima de los clips Horizon.
  8. Coloca el ratón en su 'lado, y el riego de la incisión con agua destilada.

5. abdominal Clausura y recuperación de la anestesia

  1. Cierre del peritoneo con una puntada 4-0 consecutivo.
  2. Aplicar una a dos clips de la piel para cerrar la incisión de la piel.
  3. Administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina o 5-10 mg / kg por vía subcutánea Carprofeno para aliviar el dolor post quirúrgico.
  4. Coloca el ratón sobre una almohadilla térmica para recovery hasta móvil y el ratón demuestra patrones de respiración regulares. Los animales sólo se devuelven a la compañía de otros animales después de recuperarse plenamente de la intervención quirúrgica.

6. Necropsia Examen y cosecha del Hígado

  1. Entre 30 y 60 días después de la cirugía, los ratones comienzan a mostrar síntomas clínicos de metástasis y requerirán la eutanasia. Los signos de la enfermedad metastásica que requieren eutanasia humanitaria incluyen abdómenes agrandados y el desarrollo de ascitis. La eutanasia a los ratones por inhalación de CO 2.
  2. Después de la inhalación, realice dislocación cervical.
  3. Después de que el animal ha sido determinado que no responde, hacer una incisión a través del peritoneo para exponer el abdomen usando tijeras.
  4. El uso de pinzas y tijeras, corte suavemente el hígado fuera del abdomen.
  5. Coloque el hígado en compuesto OCT, y flash congelar con nitrógeno líquido. Guarde el hígado a -80 ° C. Alternativamente, el vivor puede fijarse en 16% neutros formalina tamponada a temperatura ambiente durante 24 horas y embebidos en parafina.

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Representative Results

Panc02 células tumorales inyectadas en el hemispleen (Figura 1) metástasis de hígado en forma 100% de los ratones, mientras que de pulmón y las metástasis peritoneales no se observan si la técnica se realiza correctamente. Esta técnica se ha realizado en más de un centenar de ratones usando células Panc02 en múltiples experimentos independientes, y reproducible, todos los ratones no tratados mueren con metástasis hepáticas de entre 30 y 60 días después del procedimiento hemisplenectomy (Figura 2). Para obtener significación estadística entre los grupos tratados y no tratados, se necesitan diez ratones por grupo. Sin embargo, este número puede variar con respecto a la línea celular y el esquema de tratamiento utilizado. Cuando se usan células Panc02 en este modelo, múltiples metástasis hepáticas pueden ser observados en la necropsia (Figura 3).

Células tumorales KPC, que son una línea celular de tumor pancreático singénico derivadas de ratones transgénicos que tienen tejidos específicos de Kras y p53 knock-inmutaciones 11, también se pueden usar en este modelo. El uso de estas células en metástasis hepáticas resultados similares (Figura 4). Sin embargo, al evaluar la formación de metástasis de hígado usando una línea celular diferente, el número de células inyectadas debe ajustarse hasta que todos los ratones no tratados desarrollan metástasis hepáticas. Células Panc02 se pueden utilizar como un control positivo para asegurar que la cirugía se realizó correctamente. Es importante destacar que, mientras que la extensión de la formación de metástasis hepáticas y la supervivencia pueden variar dependiendo de la línea celular utilizada, dentro de un experimento, todos los ratones no tratados desarrollan metástasis hepáticas en una carga similar y mueren a causa de estas metástasis de manera reproducible dentro de un corto período de tiempo. Por lo tanto, la normalización de la carga tumoral por ultrasonido no es necesario cuando se utiliza esta técnica.

Incapacidad para inducir resultados de metástasis de hígado en un hígado normal que aparece en la necropsia, lo que puede indicar que el procedimiento no se ha realizado correctamente. Sin embargo, fallado o delayed formación de metástasis puede resultar tras el tratamiento con terapias que suprimen o inhiben el crecimiento metastásico (Figura 5), dando como resultado una supervivencia prolongada. Por lo tanto, este modelo se puede utilizar para evaluar los efectos de diversos agentes terapéuticos sobre el crecimiento tumoral y la formación de metástasis.

Debido a que es técnicamente factible para evaluar el hígado por ultrasonidos, una pequeña ultrasonido animales (Figura 6) 12 se puede utilizar para evaluar la formación in vivo de metástasis en el hígado. Además, la formación de metástasis puede examinarse adicionalmente por histopatología tras la necropsia (Figura 7).

Figura 1
Figura 1. Esquema del modelo hemisplenectomy, que se utilizapara crear metástasis hepáticas de páncreas con células tumorales Panc02.

Figura 2
Figura 2. supervivencia Representante de C57BL / 6 ratones después de someterse a Panc02 hemisplenectomy el día 0 se muestra en la curva de Kaplan-Meier (n = 10). Los ratones inyectados con células tumorales Panc02 en este modelo todos mueren entre 30 y 60 días después de la procedimiento si no se administran terapias anti-neoplásicas.

Figura 3
Figura 3 El examen macroscópico del hígado después de la inyección de células Panc02 en el hemispleen revela metástasis hepáticas (indicated por flechas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4 El examen macroscópico del hígado después de la inyección de las células tumorales hemispleen KPC en el hemispleen revela metástasis hepáticas (flechas negras) que reemplazan el parénquima hepático normal (flecha blanca). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 >
Figura 5 El examen macroscópico del hígado después de una intervención terapéutica eficaz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. ecografía hepática utilizando un pequeño animal de ultrasonido Vevo 660 en un ratón con una gran lesión metastásica en el hígado (flecha negro) siguiendo el procedimiento hemisplenectomy. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7. tinción H & E de parafina embebido metástasis hepáticas formados por células Panc02 en el modelo hemisplenectomy. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este modelo murino preclínica de la metástasis del cáncer de páncreas al hígado a través de una técnica de inyección hemispleen es el primer modelo descrito que refleja muchas de las condiciones clínicas e inmunológicas de los pacientes con enfermedad metastásica en el hígado. Este modelo ofrece varias ventajas sobre otros modelos murinos. En primer lugar, a diferencia de modelos transgénicos de cáncer de páncreas en la que sólo el 30% de los ratones desarrollan metástasis en el hígado y el momento de la formación de metástasis es bastante variable, este modelo ofrece la ventaja de obtener consistentemente la metástasis al hígado en 100% de los ratones en una tiempo uniforme, lo que permite a los investigadores a estudiar la enfermedad metastásica en este entorno. Además, este modelo conserva un hemispleen ingenua para permitir el análisis inmunológico de sangre periférica en un modelo reproducible. Además, en la ausencia de terapias anti-neoplásicos, los ratones mueren a causa de la progresión del tumor en un punto de tiempo consistente dependiendo de la carga inicial del tumor, y la supervivencia es consistentede un experimento a otro. Finalmente, este modelo tiene una variedad de aplicaciones, incluyendo el estudio de la metástasis de hígado 13, inmunología tumoral 10, y las pruebas terapia experimental 9.

Los pasos críticos de esta técnica son la preparación de la suspensión celular, la inyección de células tumorales, la colocación de los clips horizonte, y la colocación de los clips de la piel. Para asegurar una operación exitosa y evitar la posible sesgo de los resultados, las siguientes modificaciones de los pasos críticos pueden ser necesarios. En primer lugar, durante la preparación de la suspensión de células, es imperativo que se obtuvo una única suspensión de células y se inyecta en la hemispleen. Minor aglutinación de las células tumorales se ocluir los vasos esplénicos y causar la muerte prematura durante la cirugía. Esto se puede evitar mediante la resuspensión de las células en un agente de desgranado y mediante la preparación de cada jeringa para inyección inmediatamente antes de la inyección. Adicionalmente, durante la preparación de lajeringa, es imperativo que las células no se mezclan con la solución salina tamponada con fosfato ras. Esto puede lograrse por primera elaboración de la solución salina tamponada con fosfato y luego dibujo muy lentamente por las células para evitar la mezcla, manteniendo la jeringa en posición vertical en todo momento. En segundo lugar, durante la etapa de inyección de las células tumorales, el bisel de la jeringa debe observarse en todo momento a través de la cápsula esplénica para evitar la inyección de las células en el bazo. Un blanqueamiento del bazo y los vasos sanguíneos debe ser observado tras la inyección, lo que indica que las células tumorales se han inyectado con éxito en el bazo. En los ratones más jóvenes con bazos más pequeños, puede ser necesario inyectar un volumen menor que el riesgo de ras las células desprendidas por el bazo. Si se sospecha de alguna fuga, coloque los ratones de su lado y se lava el bazo con agua destilada antes de suturar los ratones para ayudar a eliminar cualquier célula que pueda haber salido durante la etapa de inyección. Si no se retiran estas células se traduciráen el crecimiento tumoral en el sitio de la inyección, que puede causar la muerte antes de lograr metástasis adecuados. En tercer lugar, la colocación de los clips horizonte bajo el hemispleen es importante para asegurarse de que no hay sangrado después de la eliminación de la hemispleen. Clips adicionales Horizon se pueden usar para ocluir los vasos según sea necesario. La etapa crítica final de esta técnica es la colocación de los clips de la piel. Si los ratones se están siguiendo para la supervivencia, puede ser necesario suturar la piel de los ratones en lugar de utilizar clips de la piel. Ocasionalmente, los clips de la piel se caerán antes de la curación completa de la herida de la piel, lo que podría hacer que los ratones susceptibles a la infección. La sutura de la piel, separada del peritoneo, evitará este problema.

Si bien esta técnica es de gran valor para el estudio del proceso metastásico y enfermedad metastásica, este modelo tiene algunas limitaciones. En primer lugar, la naturaleza reproducible de este modelo hace que sea preferido sobre transgénicos y orthotopimodelos c para estudiar el proceso metastásico y el microambiente tumoral en los sitios metastásicos. Sin embargo, debido a la naturaleza del modelo, sólo los pasos finales del proceso metastásico, la extravasación y la colonización, pueden ser estudiados. Esto limita la utilidad de este modelo para estudiar el proceso metastásico completa y no permite la investigación de las señales que estimulan la intravasación de células tumorales. En segundo lugar, si bien es importante para conservar la función inmune completa en estos ratones mediante la retención de la mitad de la hemispleen, el análisis de los linfocitos en el hígado incluyen tanto los linfocitos de la normal del hígado, así como los linfocitos de la microambiente del tumor, lo que podría resultar en una representación sesgada del estado inmune verdadera dentro del microambiente del tumor. El uso de líneas celulares tumorales más agresivas que llevan a más extensas metástasis en el hígado podría ayudar a superar esta limitación del modelo. Además, si las metástasis se visualizan en la necropsia, puede ser posible para diseccionar las metástasis del hígado normal y analizar sólo los linfocitos se encuentran en las metástasis de elusión aún más este problema. En resumen, mientras que este modelo tiene varias desventajas, sino que también ofrece muchas ventajas sobre otros modelos y por lo tanto debe ser utilizado complementar estos modelos en el estudio de la enfermedad metastásica en el hígado.

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Disclosures

Los autores no tienen conflicto de interés relevante para revelar.

Acknowledgements

KF y KO son co primeros autores, junto con KS

Este trabajo fue apoyado en parte por el AHPBA Fellowship (KS), NIH K23 CA148964-01 (LZ), la Escuela de Medicina Johns Hopkins premio Clinical Scientist (LZ), Fundación Viragh y el Centro de Cáncer Skip Viragh pancreático en la Universidad Johns Hopkins (EMJ y LZ), la Fundación Nacional de Páncreas (LZ), la Fundación Lefkofsky Familia (LZ), el NCI SPORE en Gastrointestinal Cánceres P50 CA062924 (EMJ, LZ), la Fundación Lustgarten (LZ), y las subvenciones del Centro de Cáncer Sol Goldman pancreático (KS , BHE, LZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture media and components will vary depending on cell line
Phosphate Buffered Saline Gibco by Life Technologies 10010-023
15 ml centrifuge tubes Corning 430052
Curved Operating Scissor Roboz Surgical Store RS-6835
Micro Dissecting Graefe Forceps Roboz Surgical Store RS-5130
Needle holder (regular) World Precision Instruments, Inc
3-0 or 4-0 suture courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled Teleflex 137085
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled Teleflex 237115
Weck Horizon medium ligating clips Teleflex 002200
Weck Horizon small ligating clips Teleflex 001200
Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip Becton Dickinson 309625
Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip Becton Dickinson 309597
9 mm Autoclip Applier Mikron 427630
9 mm Autoclip Becton Dickinson 427631
Heating pad Sunbeam CAT93
70% Ethanol sold by numerous vendors
Ketamine Hydrochloride  Hospira 22395DD
Xylazine hydrochloride Sigma X1251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

6 Comments

  1. Thank you for your video and method. A small confusion, we draw up PBS first and then draw up tumor cells slowly to avoid mixing , but why mixing is needed to be avoided? What is the purpose of this step? If tumor cells mix with PBS in the syringe, what will happen? First PBS second tumor cells, so when we inject into the spleen, tumor cells will be sent into the spleen first, why we need to inject 150ul PBS?(This time the tumor cells have already been injected). Look forward to hearing from you! Regards!

    Reply
    Posted by: Mo C.
    October 18, 2016 - 4:28 PM
  2. The purpose of the PBS flush is to push the cells that were injected into the spleen into the liver by way of the splenic vasculature. If the flush is omitted, the injected cells will primarily colonize in the spleen, which will result in the mice dying prematurely and very few, if any, hepatic metastases will develop. If the PBS flush is performed correctly, all of the tumor cells will be flushed into the liver, which will also help reduce mouse-to-mouse variability and ensure that roughly the same number of cells make it to the liver to develop hepatic metastases. I hope this helps to clarify.

    Reply
    Posted by: Kelly F.
    October 18, 2016 - 4:58 PM
  3. It's very useful! And one more thing pls, "If the flush is omitted, the injected cells will primarily colonize in the spleen, which will result in the mice dying prematurely and very few", why do mice die when tumor cells colonize? Thank you for replying!

    Reply
    Posted by: Mo C.
    October 19, 2016 - 9:32 AM
  4. The mice will die prematurely because the tumors will grow very quickly, so the mice will die from the large tumors.

    Reply
    Posted by: Kelly F.
    October 20, 2016 - 3:16 PM
  5. This is not my field of expertise so please excuse my ignorance. What is the purpose of using this hemisplenectomy injection technique instead of injecting into the entire spleen and leaving it intact? Is it due to the aggressiveness of these cancer cells? Do you think this surgery is necessary when injecting agents other than tumor cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 21, 2017 - 12:13 PM
  6. If the spleen is injected, left intact and in situ, tumor growth will then occur in the spleen instead of being limited to liver only disease. I can not speak to agents other than tumor cells. This model was designed as aa preclinical, murine tumor model of hepatic metastases.

    Reply
    Posted by: Kevin S.
    June 22, 2017 - 9:25 AM

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