Um Modelo murino de metástases hepáticas pré-clínica

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Summary

A modelo pré-clínico, murino de metástases hepáticas realizado através de uma técnica de injeção hemispleen.

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Soares, K. C., Foley, K., Olino, K., Leubner, A., Mayo, S. C., Jain, A., Jaffee, E., Schulick, R. D., Yoshimura, K., Edil, B., Zheng, L. A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases. J. Vis. Exp. (91), e51677, doi:10.3791/51677 (2014).

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Abstract

Numerosos modelos murinos foram desenvolvidas para estudar os cancros humanos e avançar o entendimento de tratamento e o desenvolvimento do cancro. Aqui, um modelo pré-clínico, murino tumor pancreático de metástases hepáticas através de uma injecção de células tumorais hemispleen pancreáticos de murino singeneicas é descrito. Este modelo imita muitas das condições clínicas em pacientes com doença metastática para o fígado. Ratos consistentemente desenvolvem metástases no fígado, permitindo a investigação do processo metastático, testes terapia experimental, e a pesquisa da imunologia tumoral.

Introduction

Adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos 1. A sobrevida em cinco anos para pacientes com PDA metastático é 2-12% 1. Embora a quimioterapia adjuvante e neoadjuvante para câncer de pâncreas é mais eficaz do que nunca hoje em dia, ainda há uma necessidade desesperada de novas terapias.

O desenvolvimento de novas terapêuticas necessita de modelos animais pré-clínicos fidedignos. Embora os modelos de tumores subcutâneos são simples de utilizar, desvantagens incluem a incapacidade destes tumores e a metástase imitar a progressão do tumor e microambientes visto em cancros humanos. Modelos geneticamente modificados, tais como o rato geneticamente modificadas contendo Kras e p53 knock-in mutações oncogénicas (o modelo KPC) 2 e o modelo KPC com um marcador de linhagem YFP (o modelo PKCY 3) permitem o estudo de tumores que ocorrem naturalmente em immunocompetecamundongos NT. Além disso, o micro-ambiente do tumor é inalterada e é mais parecida com a observada na progressão de tumores humanos. Infelizmente, o tempo de desenvolvimento do tumor é variável dentro desses modelos, o que torna difícil de estudar terapias experimentais. Além disso, backcrossing desses ratos requer uma quantidade significativa de tempo e recursos financeiros, o que nem sempre é viável. Por fim, os modelos de mouse xenotransplante PDA implantados tornem indispensável ratos, que foram alterados ou microambientes tumorais ausentes imunocomprometidos. Como resultado, a eficácia de terapias experimentais demonstraram nestes modelos pré-clínicos são muitas vezes não reprodutíveis em ensaios clínicos humanos 4.

Este modelo de rato hemiesplenectomia utiliza células tumorais Panc02, que são um, metilcolantreno induzida linha celular de tumor pancreático altamente tumorigénicas derivadas de C57BL / 6 5, 6. Além disso, outras linhas celulares PDA murino derivado do mic KPCe pode ser utilizado neste modelo. Schulick et al. Já desenvolveu uma técnica hemiesplenectomia e criou um modelo singênico rato de metástases de câncer de cólon 7. Este modelo hemiesplenectomia (Figura 1) oferece a inoculação do tumor consistente e iguais em camundongos imunocompetentes prestando-se à investigação de novos agentes terapêuticos 7-10.

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Protocol

Todos os experimentos com animais conformados com as orientações do Comitê de Cuidados e Uso da Universidade Johns Hopkins animal, e os animais foram mantidos de acordo com as diretrizes da Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório de Cuidados (AAALAC). O procedimento cirúrgico é realizado sob condições estéreis, numa sala de operações, que passa por um mínimo de quinze trocas de ar por hora. Todos os instrumentos são esterilizados em autoclave antes do procedimento e novamente com etanol a 70%, entre cada um dos ratinhos durante o procedimento. Todos os ratos que não se espera para sobreviver ao procedimento cirúrgico são sacrificados sob CO 2 durante 3 min, seguido por deslocação cervical, enquanto ainda sob anestesia.

1. celular Preparação

  1. Ressuspender as células em cultura in Panc02 salina tamponada com fosfato a 2 x10 7 células / ml, e manter em gelo.

2. Rato Preparação

  1. Administrar cetamina-E (100 mg / kg) misturado com xilazina (10 mg / kg) por via intraperitoneal com 8-12 semanas de idade C57BL / 6 fêmeas, em doses divididas.
  2. Verifique se o dedo do pé retirada pitada reflexo é abolido para garantir que o mouse é totalmente anestesiado.
  3. Administrar doses suplementares de cetamina (100 mg / kg) misturado com xilazina (10 mg / kg), conforme necessário para anestesiar completamente os ratinhos.
  4. Aplicar Puralube Vet Pomada para os olhos dos camundongos para evitar a secagem quando os ratos estão sob anestesia.
  5. Raspar a área cirúrgica dos ratinhos a fim de evitar a contaminação da ferida.
  6. Prep a área subcostal esquerda da incisão com etanol a 70% e depois de iodo.
  7. Coloque um campo cirúrgico em torno do abdômen para manter a esterilidade.

3. Laparotomia

  1. Fazer uma incisão subcostal esquerda em linha com a orelha esquerda através da pele e através do peritoneu utilizando um bisturi.
  2. Expresse o baço através da incisão através da aplicação p digitais simultânearessão ao longo dos aspectos cranial e caudal da incisão.
  3. Localizar os vasos sanguíneos do baço na extremidade inferior do baço.
  4. Divida o baço, colocando dois Horizonte médias clips ligadura no centro do baço tomando cuidado para não danificar os vasos sanguíneos do baço nos pólos do baço.
  5. Inserir o pólo superior do baço de volta para o peritoneu para evitar a contaminação.

4 Tumor Injeção

  1. Desenha-se 150 ul de solução salina tamponada com fosfato para um 26 L x 5/8 "seringa.
  2. Elaborar 100 l de Panc02 (2 x10 6) células para a mesma seringa manter a seringa na posição vertical em todos os momentos durante a injecção.
  3. Mergulhar a agulha numa solução de etanol a 70%. A agulha é imersa em etanol a 70% para assegurar a esterilidade.
  4. Injetar as células lentamente no hemispleen exposto tendo a certeza da seringa é mantido na vertical em todos os momentos. O bisel da syringe devem ser observados em todos os momentos através da cápsula do baço para evitar a injeção das células sob o baço. A clareamento dos vasos baço e de sangue devem ser observados após a injecção.
  5. Eleve o baço e aplicar um meio Horizon clipe sob o baço para ocluir os vasos sanguíneos do baço.
  6. Aplicar um pequeno clipe Horizon para o aspecto mais distal do pâncreas e vasos esplênicos.
  7. Ligadura do pâncreas e vasos esplênicos da hemispleen cortando acima dos clips horizonte.
  8. Posicione o mouse sobre o seu 'lado, e irrigar a incisão com água destilada.

5. Abdominal Encerramento e recuperação da anestesia

  1. Feche o peritônio com um ponto 4-0 em execução.
  2. Aplicar 2-3 clips de pele para fechar a incisão na pele.
  3. Administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina ou 5-10 mg / kg por via subcutânea Carprofen para aliviar a dor pós-cirúrgica.
  4. Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento para recovery até celular eo mouse demonstra padrões respiratórios regulares. Os animais só são devolvidos para a companhia de outros animais depois de se recuperar totalmente do procedimento cirúrgico.

6. Necropsia Exame e colheita do Fígado

  1. Entre 30 a 60 dias após a cirurgia, os ratos começam a mostrar sintomas clínicos de metástase e vai exigir a eutanásia. Sinais de doença metastática que requerem a eutanásia humanitária incluem abdomens dilatados eo desenvolvimento de ascite. Eutanásia ratos por inalação de CO2.
  2. Após a inalação, realizar deslocamento cervical.
  3. Depois que o animal tenha sido determinada a ser não responsivo, fazer uma incisão através do peritônio para expor o abdômen com uma tesoura.
  4. Utilizando uma pinça e uma tesoura, cortou delicadamente o fígado para fora do abdômen.
  5. Coloque o fígado em composto outubro, eo flash congelar usando nitrogênio líquido. Armazenar o fígado a -80 ° C. Alternativamente, o ao vivor pode ser fixado em 16% de formalina neutra tamponada a TA durante 24 h e embebido em parafina.

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Representative Results

Células tumorais Panc02 injetados na hemispleen (Figura 1) formar metástases hepáticas em 100% dos ratos, enquanto metástases pulmonares e peritoneal não são observados se a técnica é realizada corretamente. Esta técnica foi realizada em mais de cem ratos usando células Panc02 em vários experimentos independentes, e reprodutível, todos os ratos não tratados morrem com metástases hepáticas entre 30 e 60 dias após o procedimento hemiesplenectomia (Figura 2). Para obter significância estatística entre os grupos tratados e não tratados, dez camundongos por grupo são necessários. No entanto, este número pode variar em relação à linha de células e esquema de tratamento utilizado. Quando as células são usadas Panc02 neste modelo, múltiplas metástases do fígado pode ser observada após a necropsia (Figura 3).

Células tumorais KPC, que são uma linha celular de tumor pancreático singeneico derivado de ratos transgénicos específicos de tecidos tendo Kras e p53 knock-in11, as mutações também podem ser usadas neste modelo. Utilizando estas células resulta em metástases hepáticas semelhantes (Figura 4). No entanto, quando se avalia a formação de metástases do fígado utilizando uma linha celular diferente, o número de células injectadas deve ser titulada até que todos os ratinhos não tratados desenvolver metástases hepáticas. Panc02 células pode ser utilizada como um controlo positivo para assegurar que a operação foi executada correctamente. É importante notar que enquanto que a extensão da formação de metástases do fígado e sobrevivência podem variar, dependendo da linha celular utilizada, dentro de uma experiência, todos os ratos não tratados desenvolvem metástases do fígado a uma carga semelhante e morrem destas metástases reprodutivelmente dentro de um curto período de tempo. Portanto, a normalização da carga tumoral por ultra-som não é necessário quando se utiliza esta técnica.

A falta de induzir resultados metástase hepática em um fígado normal, aparecendo em cima de necropsia, o que pode indicar que o procedimento não foi realizado corretamente. No entanto, falharam ou delayed formação de metástases podem resultar após o tratamento com as terapias que suprimem ou inibem o crescimento metastático (Figura 5), o que resulta em sobrevivência prolongada. Por isso, este modelo pode ser usado para avaliar os efeitos de vários agentes terapêuticos para o crescimento de tumores e a formação de metástases.

Porque é tecnicamente viável para avaliar o fígado por ultra-som, uma pequena ultrassom no animal (Figura 6) 12 pode ser utilizado para avaliar a formação de metástases in vivo no fígado. Além disso, a formação de metástases podem ser examinadas por histopatologia seguinte necropsia (Figura 7).

Figura 1
Figura 1 Representação esquemática do modelo hemiesplenectomia, que é usadopara criar metástases hepáticas pancreáticos com células tumorais Panc02.

Figura 2
Figura 2. sobrevivência representativas de murganhos C57BL / 6 após serem submetidos Panc02 hemiesplenectomia no dia 0 é mostrado na curva de Kaplan-Meier (n = 10). Ratinhos injectados com células tumorais Panc02 neste modelo irá todos morrem entre 30 e 60 dias após a procedimento se terapias anti neoplásicas não são administrados.

Figura 3
Figura 3 O exame macroscópico do fígado após injeção de células Panc02 no hemispleen revela metástases hepáticas (indicated por setas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4 O exame macroscópico do fígado após a injecção de células tumorais hemispleen KPC no hemispleen revela metástases hepáticas (setas pretas), que substituem o parênquima hepático normal (seta branca). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 >
Figura 5 O exame macroscópico do fígado após intervenção terapêutica eficaz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6 ultra-sonografia hepática com Vevo 660 pequenos animais ultra-som em um rato com uma grande lesão metastática no fígado (seta preta), seguindo o procedimento hemiesplenectomia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7 H & E coloração de parafina metástases hepáticas formados por células Panc02 no modelo hemiesplenectomia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este modelo murino pré-clínico de metástase do câncer pancreático para o fígado através de uma técnica de injeção hemispleen é o primeiro modelo descrito que espelha muitas das condições clínicas e imunológicas de pacientes com doença metastática para o fígado. Este modelo apresenta várias vantagens em relação aos outros modelos de murino. Em primeiro lugar, ao contrário dos modelos transgénicos de cancro pancreático, em que apenas 30% dos ratinhos desenvolvem metástases do fígado e a temporização de formação de metástases é bastante variável, este modelo tem a vantagem de se obter consistentemente metástase para o fígado em 100% dos ratinhos, numa tempo uniforme, permitindo aos investigadores para estudar a doença metastática neste cenário. Além disso, este modelo mantém uma hemispleen ingénuos para permitir a análise imunológica de sangue periférico em um modelo reprodutível. Além disso, na ausência de terapias anti-neoplásicos, os ratos morrem de progressão do tumor em um ponto de tempo consistente, dependendo da carga inicial do tumor e a sobrevivência é consistentea partir de uma experiência para a outra. Finalmente, este modelo tem uma variedade de aplicações, incluindo o estudo da metástase do fígado 13, imunologia tumoral 10, e ensaios de terapia experimental 9.

Os passos críticos desta técnica são a preparação da suspensão de células, a injecção de células tumorais, a colocação dos grampos de Horizon, e a colocação dos agrafos para pele. Para garantir o sucesso da operação e evitar potencial inclinação dos resultados, as seguintes modificações dos passos críticos podem ser necessários. Em primeiro lugar, durante a preparação da suspensão de células, é imperativo que uma única suspensão de células ser obtido e injectado no hemispleen. Menor aglutinação de células tumorais irá obstruir os vasos do baço e provocar a morte prematura durante a cirurgia. Isto pode ser evitado através da ressuspensão das células em um agente declumping e por preparação de cada seringa para injecção imediatamente antes da injecção. Além disso, durante a preparação doseringa, é imperativo que as células não se misturar com o tampão fosfato solução salina. Isto pode ser conseguido, em primeiro lugar puxando-se o soro fisiológico tamponado com fosfato e em seguida, muito lentamente, a elaboração das células para evitar a mistura, mantendo-se a seringa na posição vertical, em todos os momentos. Em segundo lugar, durante o passo de injecção de células tumorais, o bisel da seringa deve ser observado em todos os momentos dentro da cápsula do baço para evitar a injecção de células sob o baço. Um branqueamento dos vasos sanguíneos do baço e deve ser observada após a injecção, o que indica que as células de tumor foram injectados com sucesso no baço. Em ratos mais jovens com baços menores, pode ser necessário injectar um volume menor do que o risco de descarga das células libertadas pelo baço. Se houver suspeita de algum vazamento, coloque os ratos do seu lado e lavar o baço com água destilada antes de suturar os ratos para ajudar a remover quaisquer células que podem ter vazado durante a etapa de injeção. A não remoção dessas células resultaráno crescimento do tumor no local da injecção, o que pode causar a morte antes de atingir a metástases adequados. Em terceiro lugar, a colocação dos grampos Horizon sob a hemispleen é importante para assegurar que não há nenhuma hemorragia depois da remoção do hemispleen. Clips Horizon adicionais podem ser usados ​​para obstruir vasos, conforme necessário. O passo crítico final desta técnica é a colocação dos agrafos para pele. Se os ratos são a seguir para a sobrevivência, pode ser necessário suturar a pele de ratos, em vez de usar agrafos para pele. Ocasionalmente, os grampos da pele vai cair antes da cura completa da ferida na pele, o que pode tornar a ratinhos susceptíveis a infecção. Sutura da pele, separado do peritônio, vai evitar esse problema.

Embora esta técnica é de valor inestimável para o estudo do processo metastático e doença metastática, este modelo tem algumas limitações. Em primeiro lugar, a natureza reprodutível deste modelo torna-o mais preferido transgénico e orthotopic modelos para estudar o processo metastático e o microambiente do tumor em metástases. No entanto, devido à natureza do modelo, apenas os passos finais do processo de metástase, colonização e extravasamento, podem ser estudados. Isto limita a utilidade deste modelo para o estudo do processo metastático cheia e não permite a investigação sobre os sinais que estimulam intravasamento de células tumorais. Em segundo lugar, ao mesmo tempo que é importante para manter a função imunológica completa nestes ratinhos pela retendo parte da hemispleen, análise de linfócitos no fígado incluem tanto os linfócitos de fígado normal, assim como os linfócitos do microambiente do tumor, o que poderia resultar em uma representação enviesada do verdadeiro estado imune dentro do microambiente do tumor. O uso de linhas celulares de tumores mais agressivos que levam a mais extensas metástases para o fígado pode ajudar a superar esta limitação do modelo. Além disso, se as metástases são visualizados após a necropsia, pode ser posse dissecar as metástases do fígado normal e analisar apenas os linfócitos encontrados nas metástases contornando ainda mais este problema. Em resumo, embora este modelo tem várias desvantagens, também oferece muitas vantagens sobre outros modelos e deve, portanto, ser usado complementar esses modelos quando se estuda a doença metastática para o fígado.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse relevantes para divulgar.

Acknowledgements

KF e KO são co primeiros autores, juntamente com KS

Este trabalho foi financiado em parte pelo AHPBA Fellowship (KS), NIH K23 CA148964-01 (LZ), Johns Hopkins School of Medicine Clinical Scientist Award (LZ), Fundação Viragh e do Centro de Câncer Ir Viragh pâncreas na Universidade Johns Hopkins (EMJ e LZ), a Fundação Nacional de Pâncreas (LZ), o Lefkofsky Família Foundation (LZ), o SPORE NCI em Gastrointestinal Cânceres P50 CA062924 (EMJ, LZ), a Fundação Lustgarten (LZ), e as bolsas Sol Goldman pâncreas Cancer Center (KS , BHE, LZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture media and components will vary depending on cell line
Phosphate Buffered Saline Gibco by Life Technologies 10010-023
15 ml centrifuge tubes Corning 430052
Curved Operating Scissor Roboz Surgical Store RS-6835
Micro Dissecting Graefe Forceps Roboz Surgical Store RS-5130
Needle holder (regular) World Precision Instruments, Inc
3-0 or 4-0 suture courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled Teleflex 137085
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled Teleflex 237115
Weck Horizon medium ligating clips Teleflex 002200
Weck Horizon small ligating clips Teleflex 001200
Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip Becton Dickinson 309625
Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip Becton Dickinson 309597
9 mm Autoclip Applier Mikron 427630
9 mm Autoclip Becton Dickinson 427631
Heating pad Sunbeam CAT93
70% Ethanol sold by numerous vendors
Ketamine Hydrochloride  Hospira 22395DD
Xylazine hydrochloride Sigma X1251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

6 Comments

  1. Thank you for your video and method. A small confusion, we draw up PBS first and then draw up tumor cells slowly to avoid mixing , but why mixing is needed to be avoided? What is the purpose of this step? If tumor cells mix with PBS in the syringe, what will happen? First PBS second tumor cells, so when we inject into the spleen, tumor cells will be sent into the spleen first, why we need to inject 150ul PBS?(This time the tumor cells have already been injected). Look forward to hearing from you! Regards!

    Reply
    Posted by: Mo C.
    October 18, 2016 - 4:28 PM
  2. The purpose of the PBS flush is to push the cells that were injected into the spleen into the liver by way of the splenic vasculature. If the flush is omitted, the injected cells will primarily colonize in the spleen, which will result in the mice dying prematurely and very few, if any, hepatic metastases will develop. If the PBS flush is performed correctly, all of the tumor cells will be flushed into the liver, which will also help reduce mouse-to-mouse variability and ensure that roughly the same number of cells make it to the liver to develop hepatic metastases. I hope this helps to clarify.

    Reply
    Posted by: Kelly F.
    October 18, 2016 - 4:58 PM
  3. It's very useful! And one more thing pls, "If the flush is omitted, the injected cells will primarily colonize in the spleen, which will result in the mice dying prematurely and very few", why do mice die when tumor cells colonize? Thank you for replying!

    Reply
    Posted by: Mo C.
    October 19, 2016 - 9:32 AM
  4. The mice will die prematurely because the tumors will grow very quickly, so the mice will die from the large tumors.

    Reply
    Posted by: Kelly F.
    October 20, 2016 - 3:16 PM
  5. This is not my field of expertise so please excuse my ignorance. What is the purpose of using this hemisplenectomy injection technique instead of injecting into the entire spleen and leaving it intact? Is it due to the aggressiveness of these cancer cells? Do you think this surgery is necessary when injecting agents other than tumor cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 21, 2017 - 12:13 PM
  6. If the spleen is injected, left intact and in situ, tumor growth will then occur in the spleen instead of being limited to liver only disease. I can not speak to agents other than tumor cells. This model was designed as aa preclinical, murine tumor model of hepatic metastases.

    Reply
    Posted by: Kevin S.
    June 22, 2017 - 9:25 AM

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