Оценка противогрибковое действие изолированных альвеолярных макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Метод оценки способности изолированных мыши альвеолярных макрофагов контролировать рост фагоцитирующих спор Aspergillus с помощью конфокальной микроскопии.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Grimm, M. J., D'Auria, A. C., Segal, B. H. Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51678, doi:10.3791/51678 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Легких является интерфейсом, где клетки-хозяева регулярно подвергается микробов и микробных продуктов. Альвеолярные макрофаги являются первой линии фагоциты, которые сталкиваются ингаляционных грибки и другие микробы. Макрофаги и другие иммунные клетки распознают Aspergillus мотивы рецепторами распознавания патогена и инициировать вниз по течению воспалительных реакций. Фагоцитов НАДФН оксидазы генерирует реактивные промежуточные кислорода (Rois) и имеет решающее значение для защиты организма. Хотя NADPH оксидаза имеет решающее значение для нейтрофилов-опосредованной иммунной защиты 1 - 3, важность НАДФН-оксидазы в макрофагах не определена. Целью данного исследования было очертить конкретную роль НАДФН-оксидазы в макрофагах в посредничестве иммунную защиту против А. fumigatus. Мы обнаружили, что NADPH оксидазы в альвеолярных макрофагов контролирует рост фагоцитированы А. fumigatus споры 4. Здесь мы опишем метод для оценки способности мышьlveolar макрофаги (AMS), чтобы контролировать рост фагоцитированы Aspergillus спор (конидий). Альвеолярные макрофаги окрашивают в естественных условиях и десять дней спустя изолированы от мышей бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Макрофаги высевали на покровные стекла, затем вносят затравку зеленого флуоресцентного белка (GFP), экспрессирующих A. fumigatus споры. В определенные моменты, клетки фиксируют и количество интактных макрофагов с фагоцитирующих спор оценивают с помощью конфокальной микроскопии.

Introduction

Альвеолярные макрофаги являются первой линии фагоциты, которые сталкиваются ингаляционных микробы. Макрофаги признать Aspergillus мотивы рецепторами распознавания патогена, глотать и ограничить рост ингаляционных спор (конидий), и инициировать воспалительные реакции. Фагоцитов НАДФН оксидазы преобразует молекулярный кислород к супероксиданиона и вниз по течению реактивных промежуточных кислорода (Rois). Хроническая гранулематозная болезнь (КГД) является наследственным расстройством НАДФН-оксидазы характеризуется тяжелых бактериальных и грибковых инфекций и чрезмерными воспалительных реакций.

Хотя NADPH оксидаза имеет решающее значение для нейтрофилов-опосредованной иммунной защиты 1 - 3, важность НАДФН-оксидазы в макрофагах не определена. Предыдущие исследования показали, что альвеолярные макрофаги поглощают и убивают Aspergillus споры, в то время как нейтрофилы главным целевой этап гиф 5. Тем не менее, были противоречивыми Resulц как на роль НАДФН-оксидазы в макрофагов в борьбе с ростом А. fumigatus споры 6, 7.

Цель этого метода в том, чтобы очертить конкретную роль НАДФН-оксидазы в макрофагах в посредничестве иммунную защиту против А. fumigatus споры. Мы обнаружили, что NADPH оксидазы в альвеолярных макрофагов контролирует рост фагоцитированы А. fumigatus споры 4. Чтобы наиболее точно смоделировать реакцию хозяина к ингаляционных грибов, мы использовали альвеолярных макрофагов собирают бронхоальвеолярного лаважа с нестимулированных мышей сразу после жертвоприношения. Использование изолированных альвеолярных макрофагов позволило нам сосредоточиться на своей противогрибковой активности в отсутствие других иммунных клеток (например, завербованные нейтрофилов), которые защищают против Aspergillus в естественных условиях. В этом методе, альвеолярных макрофагов окрашивали в естественных условиях до сбора таким образом, чтобы свести к минимуму количество послеуборочной манипуляции. </ Р>

Еще одно преимущество этого протокола является использование GFP-экспрессирующих А. fumigatus штамм. Этот гриб выражает GFP из конидиального этапе через стадию гиф и не имеет необходимость дальнейшего окрашивания. Для получения изображения с более подробно, мы выбрали конфокальной микроскопии, который позволит реконструкцию трехмерных структур из полученных изображений. Трехмерная реконструкция дает возможность различать гифы растет во всем, а не в или через макрофагов. Конидии также может быть точно различают как внутриклеточный против внеклеточного.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры, проводимые на животных в этом исследовании были утверждены Комитетом уходу и использованию животных в Roswell Park института рака в общем и отвечает всем требованиям государства, федерального, и Национальные институты медико-санитарных правил.

1. В естественных условиях макрофагов Маркировка

Примечание: PHK26 является липофильным краситель, который будет рассмотрен фагоцитами как в обращении и в тканях при внутривенном введении (IV). PKH26 был использован для маркировки в естественных условиях, чтобы свести к минимуму количество послеуборочной манипуляции макрофагов. PKH-26 имеет то преимущество, стабильно накапливаются в альвеолярных макрофагов в течение длительных периодов. Ожидание 10 дней после введения позволяет урегулирования всех меченых клеток из обращения, оставляя только альвеолярных макрофагов стабильно помечены PKH26 8, 9. PKH26 является красный флуорохромом, что имеет возбуждение (551 нм) и выбросов (567 нм) характеристики совместимыеродамином или обнаружения фикоэритрин систем. Любая процедура маркировки можно ввести артефакт, в том числе потери жизнеспособности. Однако, так как мы используем тот же подход для маркировки макрофагов в различных генотипов мыши (например, WT против NADPH-оксидаза-дефицитных), эффекты этих артефактов будет равномерным.

  1. Развести исходного раствора PKH26 (1 × 10 -3 М в этаноле) 1:05 в разбавителе C, предоставленной изготовителем.
  2. Нагрузка 100 мкл разбавленного PKH26 в 1/2 мл инсулиновый шприц (29 G х 1/2 ") для каждой мыши.
  3. Администрирование для мышей внутривенной инъекции (либо в хвостовую вену или ретро орбитальной) минимум за 10 дней до сбора урожая.

2. Сбор альвеолярных макрофагов по бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ)

Количество мышей, чтобы использовать для эксперимента могут варьироваться. Типичный выход из нестимулированной мыши находится в диапазоне 3-5 × 10 5 альвеолярных макрофагов, однако это число может значительно варьироваться барельефред от таких факторов, как размер мыши, опыта человека, выполняющего промывание, и количество инстилляции промывной жидкости и объемом отводимой из легких. В этом протоколе легких промывание выполняется с закрытой грудной полости, которые наряду с повторными 1 мл промываний помогает увеличить доходность клеток.

  1. Усыпить мышь путем введения смертельную дозу анестетика AVERTIN (12,5 мг) внутрибрюшинно (IP) с использованием асептических условий для поддержания стерильного раствора.
  2. Спрей мышь полностью с 70% этанола.
  3. Удалить кожу по передней части животного подвергая грудную клетку (рис. 1А).
    1. Сделайте небольшой надрез в коже только под диафрагмой.
    2. Вставьте палец в разрез и потяните кожу от черепной конце животного (рис. 1А).
    3. Поднимите слегка по голове, расширяя брюшной стороне шеи (рис. 1А).
  4. Вырезать небольшое отверстие через грудную клеткув правой стороне грудной клетки выкачать легкие, а также позволит визуализацию легких во время следующих шагов.
  5. Найдите трахею, и тщательно отсечь окружающие ткани.
    1. Удалите слюнных желез, грудинно-подъязычный мышцы и гортань, и т.д. с изогнутыми щипцами.
    2. Осторожно поднимите с изогнутым пинцетом и отрезать ножницами тонкую ткань, покрывающую трахею (адвентиции) выявления основной кольцами структуру хряща.
  6. Вставьте катетер в трахею.
    1. Использование изогнутых щипцов, место шва за (от спины к) трахеи и тянуть длину 10 см через отверстие.
    2. Начиная выше перстневидным (утолщенной кольца хряща) тщательно направлять 22 г катетер вниз трахеи остановки, где трахея исчезает за грудиной.
    3. Плотно связать нить вокруг трахеи и катетера для плотного прилегания. Удалить иглу из катетера.
  7. Соберите 4-ходовой кран.
    1. Заполнятьодин 6 мл шприц с DPBS, 1% FBS и приложить к 4-ходовой кран, как указано на рисунке 1b.
    2. Прикрепите пустую 6 мл шприц по указанной позиции на 4-ходовой кран (рис. 1В).
    3. Прикрепите открытый порт на 4-ходовой кран к катетера (рис. 1В). Будьте осторожны, чтобы не сместить катетер из трахеи.
  8. Сбор промывной жидкости из легких.
    Примечание: Следователи могут решить использовать более низкие объемы промывной жидкости, чтобы свести к минимуму возможность повреждения ткани. Важно, что такой же подход применяться последовательно во всех группах мышей.
    1. Поверните ручку на кран так пустой шприц закрыт и медленно вдохнуть ~ 1 мл DPBS, 1% FBS раздувать легкие. Соблюдайте инфляции легких через разрез дырок в шаге 2.4.
    2. Будьте осторожны, не overinflate легкие.
    3. Поверните ручку на кран так, чтобы полный шприц закрыт, и тщательно снять грипп ID из легких.
    4. Соблюдайте легкие выкачать через разрез дырок в шаге 1.4. Катетер может должны быть перемещены немного назад или вперед, чтобы получить хорошую ничью. Соблюдайте особую осторожность, чтобы сохранить катетер в трахею.
    5. Повторяйте шаги 2.8.1-2.8.4 5-6х, пока все DPBS, 1% FBS была введена и выведены из легких. Примечание: восстановление легких жидкости не будет 100% от вводимой жидкости.
  9. Пустой шприц с промывной жидкости в 50 мл коническую трубку. Сохранить клетки при комнатной температуре.
  10. Гранул клетки центрифугированием при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и слейте супернатант. Это при желании могут быть сохранены для анализа цитокинов.
  11. Ресуспендируют клеток в 1-5 мл RPMI 1640 с 10% FBS и рассчитывать на гемоцитометре. В нестимулированной мыши,> 95% клеток, полученных путем BAL, как ожидается, макрофаги, которые могут быть подтверждены цитологии.

3. Культивирование и сбор урожая Гриб

"> Aspergillus fumigatus используется в данном протоколе выражает GFP на всех этапах его жизненного цикла:. Споры, germlings и гифы Это грибковая штамм предоставлены доктором Марго Мур, Университета Саймона Фрейзера, Барнаби, Британская Колумбия, Канада.

  1. Тарелка конидии из fumigatus штамма Aspergillus, выражающей GFP на Сабуро мозга и сердца инфузии (BHI) скошенный агар с хлорамфеникол (0,05 г / л) и гентамицин (0,5 г / л).
  2. Инкубируют в темноте в течение неплотно закрывают 7 до 10 дней при комнатной температуре.
  3. Урожай конидии по стиральной уклоном с 10 мл 0,01% Tween 20 в DPBS. Слегка очистить грибок с stripette, чтобы ослабить. Промыть наклонной несколько раз увеличить выход.
  4. Pass конидий суспензии через сито 100 мкм клеток в 50 мл коническую.
  5. Гранулы конидии центрифугированием при 400 х г в течение 10 мин.
  6. Ресуспендируйте конидии в 50 мл DPBS и считать с помощью гемоцитометра.
  7. Мыть два раза с DPBS и разбавляют до требуемых концентрацийцентрации.

4. Грибковые вызов и конфокальной микроскопии

Чтобы исследовать роль макрофагов НАДФН-оксидазы в защите хозяина, способность изолированных альвеолярных макрофагов мышей трех генотипов по контролю рост фагоцитированы Aspergillus спор оценивали. Генотипы используемые в этом исследовании, включают; 1) мышей дикого типа, 2) Ncf1 * / * Mn-мыши с природной Ncf1 мутации (Ncf1 кодирует p47 phox, требуемом компоненте фагоцитов НАДФН-оксидазы), оставляя им НАДФН оксидазы недостаточным, и 3) Ncf1 * / * Mn + трансгенных мышей (MN обозначает трансген, несущего дикого типа Ncf1 под контролем промотора человеческого CD68), где NADPH-оксидаза активность была восстановленного в популяции моноцитов / макрофагов 10, 11.

Конфокальной микроскопии лучше всего подходит для этого анализа в связи с наличиеми рост не фагоцитированы конидий на слайдах. Конфокальный микроскоп позволит для визуализации отдельных плоскостях в пределах Z-оси, и позволяют дифференцировать гриба растущего вокруг, а не внутри макрофагов. Все конфокальные изображения получены с помощью масла погружения объектив 63x. Z-стеки приобретаются с электронным коэффициент увеличения 2,5. Толщина Z-стека определяется с использованием DAPI и изображения в светлом поле, чтобы определить верхний и нижней части поля. Z-стеки колебалась от 14 до 24 мкм с отдельными кусочками толщиной ~ 1 мкм. Для количественного макрофагов, одиночные сканы 1X электронного масштабирования проводились на 10 полей, на генотип. Интактные макрофаги были определены на основе PKH26 и DAPI окрашивания мембраны и ядра соответственно. Конидии были определены на основе FITC выражения и яркого поля изображения.

  1. Подготовить стерильные покровные и тарелки
    1. Под Кабинетом биологической безопасности, смочите 22 х 22 мм покровные стекла в 70% этанол в течение 5-10 мин.
    2. Промыть покровные в стерильной PBS.
    3. Использование стерильного пинцета, осторожно поместить одну покровное в нижней части каждой лунки стерильного упакованного отдельно 6-луночный планшет.
  2. Семя ~ 1 х 10 6 собирают PKH26 помечены альвеолярных макрофагов, взвешенные в 300 мкл RPMI 1640, 10% FBS на каждую покровное. Точное количество может варьироваться в зависимости от урожайности.
  3. Разрешить макрофагов придерживаться путем инкубации при 37 ° С с 5% CO 2 в течение ночи.
  4. На следующее утро, добавить ~~~HEAD=iobj 1 х 10 7 GFP-экспрессирующих A. fumigatus конидии суспендируют в 100 мкл предварительно нагретого (37 ° C) RPMI 1640, 10% FBS.
  5. Вернуться пластину до 37 ° С инкубатор с 5% CO 2.
  6. Клетки должны быть закреплены в течение минимум 2 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° С. Через 3, 7 и 14 час исправления клеток добавлением равного объема 2% формальдегида в каждую лунку (конечная концентрация 1% формальдегид). Место пластины дляточки в начале времени при 4 ° С в течение ночи. Для окончательного момент времени (14 ч), зафиксировать клетки при комнатной температуре в течение 2 часов.
  7. После фиксации аккуратно удалить покровные с помощью щипцов и промойте в DPBS.
  8. Удаление избытка жидкости, поместив край покровного стекла в сложенном Kimwipe.
  9. Применить 6 флуоресценции мкл монтажную среду с DAPI в предметное стекло микроскопа.
  10. Lay один край покровного стекла на предметном стекле и осторожно падение с стороне клеточной вниз в монтажную среду. Монтаж среду будет распространяться и образуют ровный слой под покровное. Там нет необходимости нажимать на покровное.
  11. Уплотнение края покровного стекла с прозрачным лаком для ногтей и дайте высохнуть на воздухе.
  12. Магазин не подготовлены слайды в слайд-коробки (защищенном от света месте) при комнатной температуре до готовности анализировать с помощью конфокальной микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сбор альвеолярных макрофагов на BAL из стимулированных мышей приведет к чистота> 95% населения на основе цитологии. 3 и 7 ч (рис. 2) моменты времени предшествовать этап гиф роста грибов и позволяют для сравнения эффективности фагоцитарной конидий между генотипами. Момент времени 14 ч, где генотипы можно сравнить с точки зрения способности ингибировать переход фагоцитированы конидий к ткани-инвазивной стадии гиф (рис. 3). Неповрежденными макрофагов может быть идентифицирован по конфокальной микроскопии на основе PKH26 и DAPI окрашивания мембраны и ядра, соответственно (фиг. 2 и 3). Конидии и гифы определены на основе GFP выражения (рис. 2 и 3).

iles/ftp_upload/51678/51678fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Анатомический Направленные Ссылки и 4-ходовой кран.) Анатомические направленного ссылки для мыши показаны. Cranial в направлении головы, в то время как хвостовой находится в направлении хвоста. Брюшная сторона четвероногого является к животу или нижней поверхности животного, в то время как спинной стороны обращена к задней или верхней поверхности животного. B) 4-позиционный кран имеет три LUER соединения и ручкой, что вращается 360 °, чтобы направить поток жидкости через кран. Размещение пустой шприц, полный шприц и катетер указаны. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2 Рисунок 2. Фагоцитоз А. fumigatus споры похожа между генотипами на 7 часов. Чтобы оценить способность изолированных альвеолярных макрофагов с NADPH оксидазы деятельности ограничить рост фагоцитированы конидий, (А) дикого типа, (Б) Ncf1 * / * Mn + и ) Ncf1 * / * Mn - мышам вводили внутривенно PKH26. Альвеол рные макрофаги собирали BAL через 10 дней и высевают с конидий GFP-экспрессирующих А. fumigatus. Клетки фиксировали через 3, 7 и 14 ч после добавления конидий. На 3 (данные не показаны) и 7 ч и общее количество макрофагов и макрофагов с ≥ 1 фагоцитированы конидии (стрелки) были подобны среди этих трех генотипов, что отражает аналогичную эффективность фагоцитоза. Интактные макрофаги определены на основе PKH26 (красный) и DAPI (синий) окрашивания мембраны ай ядра соответственно. Флуоресцентные изображения из одного Z-плоскости накладываются с яркой поля изображения. Яркое изображение поля состоит из света, прошедшего через весь образец и поэтому, когда перекрываются на флуоресцентном Z-равнине позволяет визуализировать клеток и конидий в пределах всего Z-стека. Шкала бар, 19 мкм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3
Рисунок 3. Макрофагов NADPH-оксидаза требуется, чтобы контролировать рост A. . fumigatus споры конфокальной микроскопии (A, D) дикого типа, (В, Е) Ncf1 * / * Mn + и (C, F) Ncf1 * / * Мп - < / SUP> альвеолярных макрофагов в 14 часов после посева с GFP + A. fumigatus конидии. Интактные макрофаги определены на основе PKH26 (красный) и DAPI (синий) окрашивание мембран и ядер, соответственно. Твердые стрелки показывают нетронутыми макрофаги как минимум с одним фагоцитирующих конидий и полые стрелки указывают на гиф. Многочисленные AMs с по меньшей мере 1 фагоцитированы конидии наблюдались с дикого типа и Ncf1 * / * Mn + клеток, но не с НАДФН-оксидазы-дефицитных клеток. GFP сигнал в гиф был переменная основана на плоскости г стеками показаны на рисунке. AC) флуоресцентные изображения из одного Z-плоскости с яркой поля изображения позволяют наблюдать клетки и гифы в пределах всего Z-стека. DF) Флуоресцентные изображения из одного Z-плоскости без ярком фоне поля позволяют идентифицировать клетки, но не пространственное соотношение клеток и грибов в разных Z-плоскостей. Шкала бар, 19 мкм..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Используя этот подход для экс естественных анализа противогрибковой активности макрофагов вместе с в естественных грибковой вызов, мы ранее показали, что NADPH оксидазы в макрофагах играет важную роль в защите от А. fumigatus 4. Использование изолированных альвеолярных макрофагов позволяет нам сосредоточиться на их противогрибковой активности в отсутствие других иммунных клеток (например, на работу нейтрофилы), которые защищают против Aspergillus в естественных условиях.

Различные стратегии визуализации были использованы для оценки противогрибковой активностью макрофагов в естественных условиях и экс виво. Лютер и др.., Используется конфокальной микроскопии для изучения фагоцитоза Aspergillus конидий человеком (заготовленной от реципиентов легких) и AMs мыши 12. Geunes-Бойер и др.. характеризуется взаимодействие между Candida krusei и макрофагах мышей следующее фагоцитоза. Онииспользовал макрофагов клеточной линии, RAW264.7 и первичной макрофагов из брюшины 13. Гарсия-Родас и др.. показали, что поверхностно-активное вещество белок-D связывается с и облегчает фагоцитоз и выживание Cryptococcus neoformans 14. SP-D связывания также была исследована в естественных условиях с использованием SP-D - / - мышей интраназально инокулированные Alexa Fluor 488-меченого С. neoformans. После легкого промывания, AMs были immunofluorescently маркированы и конфокальной микроскопии был использован для анализа фагоцитоз.

Макрофаги из разных анатомических областей (например альвеолярного, селезенки, брюшины), генерируемых различными стимулами (например, тиогликолята выявление или в пробирке дифференциации), или из клеточных линий (например, RAW264.7) может иметь совершенно разные антимикробные и воспалительные реакции 15 - 18. Поэтому, чтобы наиболее точно смоделировать реакцию хозяина к вдыхаемого забавыги, мы использовали альвеолярных макрофагов собирают бронхоальвеолярного лаважа с нестимулированных мышей сразу после жертвоприношения.

Первоначально мы использовали изображений живых клеток для оценки макрофагов противогрибковой активностью 4. Альвеолярных макрофагов высевали в камерных стеклах затем затравку GFP выражения Aspergillus. После 3 часов, не фагоцитированы конидии удаляют осторожного промывания, чтобы позволить беспрепятственное визуализацию фагоцитированы конидий. Конидиального прорастание затем контролируется покадровой обработки изображений со скоростью 30-минутными интервалами, используя яркий свет изображения для визуализации макрофагов и флуоресценции GFP визуализировать грибы. Этот метод имеет то преимущество, приобретая последовательных изображений одной и той же первичной культуры клеток. Тем не менее, тенденция к макрофагов мигрировать через поле зрения в ходе приобретения позволило качественный, а не количественной оценки conidiocidal деятельности. Другим недостатком изображений живых клеток является тон отсутствие ясности и подробно, как клетки перемещаются в и из плоскости фокуса.

Для получения изображения с более подробно мы выбрали конфокальной микроскопии, который позволит реконструкцию трехмерных структур из полученных изображений. Трехмерная реконструкция дает возможность различать гифы растет во всем, а не в или через макрофагов. С помощью этого возможностью просмотра клетки и грибок в трех измерениях, устранение не-фагоцитированы конидий на 3 часа больше не является необходимым шагом. Конидии также может быть точно различают как внутриклеточный против внеклеточного.

Для повышения визуализации, альвеолярных макрофагов были помечены в естественных условиях с PKH26. Этот флуоресцентный краситель имеет длинную алифатическую хвост, который стабильно включает в регионах липидных клеточных мембран. При введении внутривенно, это липофильный краситель занимают фагоцитирующих клеток и в кровотоке и в тканях. После 10 дней, Лабево главе фагоциты очищаются от мышиного обращении и остаются только в тканях 9, что позволяет для сбора уже с надписью альвеолярных макрофагов по БАЛ. С использование маркировки в естественных условиях, послеуборочной манипуляции альвеолярных макрофагов сводится к минимуму.

Еще одно преимущество этого протокола является использование GFP-экспрессирующих А. fumigatus штамм. Этот гриб выражает GFP из конидиального этапе через стадию гиф и не имеет необходимость дальнейшего окрашивания. С двойной окрашивания макрофагов и Aspergillus, мы в состоянии определить фагоцитированы конидии.

Ограничивающим фактором в этом протоколе есть выход макрофагов из БАЛ. Типичный выход из нестимулированной мыши находится в диапазоне 3-5 × 10 5 альвеолярных макрофагов, однако это число может значительно варьироваться в зависимости от таких факторов, как размер мыши, опыта человека, выполняющего промывание, и количество инстилляции из промывной гриппаID и объем выведены из легких. В этом протоколе, легких промывание выполняется с закрытой грудной полости, которые вместе с повторными 1 мл инстилляции помогает увеличить выход клеток по сравнению с открытой грудной полости и меньше инстилляции. Номера мыши также может быть увеличена для увеличения урожайности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Грант R01AI079253 (к BHS) и Национальным институтом рака онкологический центр поддержки Грант CA016056 в Roswell Park института рака.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol Sigma T48402 Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol Sigma A-1685 Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning 21-031-CV
NH4Cl Sigma A0171 Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3 Sigma P91444 Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA Sigma E6758 Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter BD 381523 Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock Fisher Scientific 50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 heat inactivated
Hema 3 Stain Set Fisher Scientific 22-122-911
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants BD 297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers BD Falcon 64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge Thermo Scientific
Cell culture incubator 37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass VWR 48366-227 glass coverslips
6-well Cell culture plates Corning 3506
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
  2. Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
  3. Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
  4. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
  5. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
  6. Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
  7. Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
  8. Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
  9. Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
  10. Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
  11. Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
  12. Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
  13. Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
  14. García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
  15. Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
  16. Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
  17. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
  18. Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics