Evaluatie anti-schimmel activiteit van geïsoleerde alveolaire macrofagen door confocale microscopie

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Een werkwijze om het vermogen van geïsoleerde muis alveolaire macrofagen om de groei van Aspergillus gefagociteerde sporen bedienen door confocale microscopie evalueren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Grimm, M. J., D'Auria, A. C., Segal, B. H. Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51678, doi:10.3791/51678 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De long is een interface waarbij gastheercellen routinematig worden blootgesteld aan microben en microbiële producten. Alveolaire macrofagen zijn de eerste lijn fagocytcellen dat geïnhaleerde schimmels en andere microben tegenkomen. Macrofagen en andere immuuncellen herkennen Aspergillus motieven door pathogeen herkenning receptoren en initiëren downstream ontstekingsreacties. De fagocytensysteem NADPH oxidase genereert reactieve zuurstof tussenproducten (ROI) en is van cruciaal belang voor de afweer. Hoewel NADPH oxidase is essentieel voor neutrofiel-gemedieerde afweer 1 - 3, het belang van NADPH oxidase in macrofagen is niet goed gedefinieerd. Het doel van deze studie was om de specifieke rol van NADPH oxidase in macrofagen af te bakenen in het bemiddelen afweermechanismen tegen A. fumigatus. We vonden dat NADPH oxidase in alveolaire macrofagen regelt de groei van gefagociteerde A. fumigatus sporen 4. Hier beschrijven we een methode voor het beoordelen van het vermogen van de muis eenlveolar macrofagen (AM's) om de groei van Aspergillus gefagocyteerd sporen (conidia) regelen. Alveolaire macrofagen zijn gekleurd in vivo en tien dagen later geïsoleerd van muizen door bronchoalveolaire lavage (BAL). Macrofagen uitgeplaat op dekglaasjes, dan geënt met groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie A. fumigatus sporen. Op bepaalde tijdstippen worden cellen gefixeerd en het aantal intacte macrofagen met gefagociteerde sporen wordt beoordeeld door confocale microscopie.

Introduction

Alveolaire macrofagen zijn de eerste lijn fagocytcellen dat geïnhaleerde microben tegenkomen. Macrofagen herkennen Aspergillus motieven door pathogeen herkenning receptoren, innemen en beperken de groei van geïnhaleerde sporen (conidiën), en initiëren ontstekingsreacties. De fagocytensysteem NADPH oxidase zet moleculaire zuurstof om superoxide anion en downstream reactieve zuurstof tussenproducten (ROI). Chronische granulomateuze ziekte (CGD) is een erfelijke aandoening van het NADPH oxidase gekenmerkt door ernstige bacteriële en schimmelinfecties en overmatige ontstekingsreacties.

Hoewel NADPH oxidase is essentieel voor neutrofiel-gemedieerde afweer 1 - 3, het belang van NADPH oxidase in macrofagen is niet goed gedefinieerd. Voorafgaande studies hebben aangetoond dat alveolaire macrofagen innemen en doden Aspergillus sporen, terwijl neutrofielen voornamelijk richten op de hyphal fase 5. Er zijn tegenstrijdige results over de rol van NADPH oxidase in macrofagen in het beheersen van de groei van A. fumigatus sporen 6, 7.

Het doel van deze methode was om de specifieke rol van NADPH oxidase in macrofagen bakenen als mediator afweermechanismen tegen A. fumigatus sporen. We vonden dat NADPH oxidase in alveolaire macrofagen regelt de groei van gefagociteerde A. fumigatus sporen 4. Het nauwst model van de gastheer op geïnhaleerd schimmels, gebruikten we alveolaire macrofagen geoogst door bronchoalveolaire lavage van gestimuleerde muizen onmiddellijk na offer. Het gebruik van geïsoleerde alveolaire macrofagen stelde ons in staat om zich te concentreren op hun antifungale activiteit in de afwezigheid van andere immuuncellen (bijv. aangeworven neutrofielen) die verdedigen tegen Aspergillus in vivo. Bij deze werkwijze werden alveolaire macrofagen gekleurd vivo voor zo oogst om de hoeveelheid post-harvest manipulatie minimaliseren. </ P>

Een ander voordeel van dit protocol is het gebruik van een GFP-expressie A. fumigatus stam. Deze schimmel uitdrukking GFP uit de conidiale stadium door de hyphal podium en heeft geen behoefte aan verdere kleuring. Om beelden met meer detail bieden we kozen confocale microscopie die de reconstructie van driedimensionale structuren van de verkregen beelden maakt. Drie-dimensionale reconstructie geeft de mogelijkheid om tussen hyfen groeien rond plaats of door een macrofaag. Conidia kan ook juist onderscheiden als intracellulaire versus extracellulair.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures uitgevoerd op dieren in deze studie werden goedgekeurd door het Comite Animal Care en gebruik bij Roswell Park Cancer Institute en aan alle provinciale, federale en National Institutes of Health regelgeving.

1. In vivo Macrophage Labeling

Opmerking: PHK26 is een lipofiele kleurstof die door fagocyten wordt afgelezen in omloop en in de weefsels bij intraveneuze toediening (iv). PKH26 werd gebruikt voor in vivo labeling van de hoeveelheid na de oogst manipulatie van de macrofaag minimaliseren. PKH-26 heeft het voordeel stabiel accumuleren in alveolaire macrofagen gedurende lange perioden. Wacht 10 dagen na toediening zorgt voor de goedkeuring van alle gelabelde cellen uit de circulatie waardoor alleen alveolaire macrofagen stabiel gelabeld met PKH26 8, 9. PKH26 is een rode fluorochroom dat excitatie (551 nm) en emissie (567 nm) kenmerken compatibel ismet rhodamine of fycoerytrine detectiesystemen. Iedere etikettering procedure kan artefact introduceren, waaronder het verlies van levensvatbaarheid. Aangezien we dezelfde aanpak voor de etikettering van macrofagen uit andere muis genotypen (bijv. WT versus NADPH oxidase-deficiënt), de effecten van deze artefacten zou uniform.

  1. Verdun voorraad oplossing van PKH26 (1 x 10 -3 M in ethanol) 1:05 in verdunningsmiddel C die door de fabrikant.
  2. Belasting 100 pl verdund PKH26 in een 1/2 ml insulinespuit (29 G x 1/2 ") voor elke muis.
  3. Dienen aan muizen door iv injectie (ofwel staart ader of retro orbitale) ten minste 10 dagen voor de oogst.

2. Oogsten alveolaire macrofagen door bronchoalveolaire lavage (BAL)

Het aantal muizen gebruikt voor een experiment kan variëren. Een kenmerkende opbrengst van de gestimuleerde muizen in het traject van 3-5 x 10 5 alveolaire macrofagen, maar dit aantal kan sterk variëren based van factoren zoals grootte van de muis, de ervaring van de persoon die de lavage en het aantal instillaties van lavage vloeistof en uit longen opgetrokken volume. In dit protocol long lavage wordt uitgevoerd met een gesloten borstholte die samen met 1 ml herhaalde spoelingen helpt cel opbrengst te verhogen.

  1. Euthanaseren muis door het toedienen van een dodelijke dosis van avertin verdoving (12,5 mg) intraperitoneaal (ip) met behulp van aseptische omstandigheden aan de oplossing steriel te houden.
  2. Spray muis grondig met 70% ethanol.
  3. Verwijder het vel van de craniale einde van dierlijke blootstelling van de thorax (figuur 1A).
    1. Maak een kleine snede in de huid net onder het middenrif.
    2. Steek een vinger in de uitsparing en trek de huid weg van het craniale einde van het dier (Figuur 1A).
    3. Push up iets op het hoofd, de uitbreiding van de ventrale zijde van de nek (Figuur 1A).
  4. Knip een klein gaatje door de ribbenkastin de rechterkant van de thorax aan de longen leeglopen en laten ook visualisatie van de longen tijdens de volgende stappen.
  5. Zoek de luchtpijp, en zorgvuldig ontleden weg omringende weefsel.
    1. Verwijder de speekselklieren, sternohyoid spieren en strottenhoofd, enz. gebogen pincet.
    2. Til met een gebogen pincet en knip met een schaar het dunne weefsel dat de luchtpijp (adventitia) onthullen de onderliggende geringd kraakbeen structuur.
  6. Plaats katheter in de luchtpijp.
    1. Met behulp van gebogen pincet, plaatst een hechting achter (dorsale naar) de luchtpijp en een 10 cm lengte te trekken door de opening.
    2. Vanaf boven de cricoid (de verdikte ring van kraakbeen) zorgvuldig begeleiden een 22 G katheter en de luchtpijp te stoppen waar de luchtpijp verdwijnt achter het borstbeen.
    3. Stevig binden hechtdraad rond de luchtpijp en de katheter voor een goede pasvorm. Verwijder de naald uit de katheter.
  7. Monteer 4-weg kraan.
    1. Vulleneen 6 ml spuit met DPBS, 1% FBS en hechten aan 4-weg kraan zoals in figuur 1B.
    2. Sluit een lege 6 ml spuit op de aangegeven positie op de 4-weg kraan (Figuur 1B).
    3. Bevestig open poort op de 4-weg kraan om katheter (Figuur 1B). Wees voorzichtig om katheter niet verdrijven uit luchtpijp.
  8. Verzamel lavage vocht uit de longen.
    Opmerking: Onderzoekers kunnen kiezen lagere hoeveelheden spoelvloeistof om mogelijke beschadiging aan het weefsel te minimaliseren. Het is belangrijk dat dezelfde benadering consistent toegepast in alle groepen muizen.
    1. Draai de hendel op de kraan, zodat de lege spuit is afgesloten en injecteer langzaam ~ 1 ml DPBS, 1% FBS aan de longen te blazen. Observeer long inflatie door het gat gesneden in stap 2.4.
    2. Wees voorzichtig dat u de longen Blaas.
    3. Draai de hendel op de kraan zodat de volledige spuit is gesloten, en voorzichtig trekken de griep id uit de longen.
    4. Let op de longen leeglopen door het gat gesneden in stap 1.4. De katheter kan nodig zijn om iets vooruit of achteruit worden verplaatst naar een goede draw te krijgen. Neem speciale voorzorgsmaatregelen om de katheter in de luchtpijp te houden.
    5. Herhaal stappen 2.8.1-2.8.4 5-6x totdat alle DPBS, 1% FBS werd geïnjecteerd en naar de longen onttrokken. Opmerking: herstel van longvocht zal niet 100% van de geïnjecteerde vloeistof.
  9. Lege spuit met spoelvloeistof in een 50 ml conische buis. Laat cellen bij kamertemperatuur.
  10. Pellet cellen door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 min bij kamertemperatuur en giet supernatant. Dit kan worden opgeslagen voor cytokine analyse indien gewenst.
  11. Resuspendeer cellen in 1-5 ml RPMI 1640 met 10% FBS en te tellen op een hemocytometer. In de gestimuleerde muis,> 95% van de cellen geoogst door BAL verwachting macrofagen, die kan worden bevestigd door cytologie zijn.

3. Kweken en oogsten Fungus

"> De Aspergillus fumigatus in dit protocol gebruikte uitdrukking GFP in alle stadia van de levenscyclus:. Sporen, germlings en ​​hyfen Deze schimmel stam werd verzorgd door dr. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada.

  1. Plaat conidia van een Aspergillus fumigatus stam die GFP op Sabouraud hersenen hart infusie (BHI) agarslants met chlooramfenicol (0,05 g / L) en Gentamicine (0,5 g / l).
  2. Incubeer in het donker losjes afgedekt gedurende 7 tot 10 dagen bij kamertemperatuur geroerd.
  3. Oogst conidia door wassen inslag met 10 ml 0,01% Tween 20 in DPBS. Licht schrapen de schimmel met de stripette los te maken. Spoel de schuine meerdere malen om de opbrengst te verhogen.
  4. Ga conidiale suspensie door een 100 urn zeef cel in een 50 ml conische.
  5. Pellet conidia door centrifugeren bij 400 g gedurende 10 minuten.
  6. Hersuspenderen conidia in 50 ml DPBS en te tellen met behulp van een hemocytometer.
  7. Twee keer wassen met DPBS en vul aan tot de gewenste concentratietratie.

4. Schimmel Challenge en confocale microscopie

Om de rol van macrofagen NADPH oxidase in afweer onderzoeken het vermogen van geïsoleerde alveolaire macrofagen van muizen drie genotypen om de groei van Aspergillus sporen gefagocyteerd controle geëvalueerd. De genotypen in deze studie omvatten; 1) wild-type muizen, 2) Ncf1 * / * Mn-muizen met een natuurlijk voorkomende mutatie Ncf1 (Ncf1 codeert voor p47 phOx een vereist bestanddeel van de fagocyt NADPH oxidase) waardoor ze NADPH-oxidase deficiëntie, en 3) Ncf1 * / * Mn + transgene muizen (MN duidt het transgen huisvesten wildtype Ncf1 onder controle van de menselijke CD68-promoter) wanneer NADPH-oxidase activiteit is opgelost in de monocyt / macrofaag populatie 10, 11.

Confocale microscopie is het meest geschikt voor deze test door de aanwezigheiden groei van niet-gefagocyteerde conidia op de glijbaan. De confocale microscoop zal voor visualisatie van afzonderlijke niveaus in de Z-as en staat onderscheid tussen schimmel groeit rond plaats binnen macrofagen. Alle confocale beelden worden verkregen met behulp van een 63x olie-immersie lens. Z-stacks worden verworven met een elektronische zoomfactor van 2,5. De dikte van een Z-stack wordt bepaald met DAPI en helderveld beelden naar de bovenkant en onderkant van het veld te vinden. Z-stacks varieerde 14-24 urn met afzonderlijke segmenten ~ 1 urn dik. Voor de kwantificering van macrofagen, werden enkele scans van 1X elektronische zoom uitgevoerd op 10 velden per genotype. Intact macrofagen werden geïdentificeerd op basis van respectievelijk PKH26 en DAPI kleuring van het membraan en de kern. Conidia werden geïdentificeerd op basis van beelden helder veld FITC expressie en.

  1. Bereid steriele dekglaasjes en platen
    1. Onder een biologische veiligheid kabinet, geniet 22 x 22 mm dekglaasjes in 70% ethanol voor 5-10 minuten.
    2. Spoel dekglaasjes in steriele PBS.
    3. Met steriele pincet, plaats voorzichtig een dekglaasje op de bodem van elk putje van een steriele afzonderlijk verpakt 6-wells plaat.
  2. Zaad ~ 1 x 10 6 geoogst PKH26 gelabeld alveolaire macrofagen gesuspendeerd in 300 ul RPMI 1640, 10% FBS op elke dekglaasje. Het exacte aantal kan variëren naargelang de oogstopbrengst.
  3. Laat macrofaag te houden door incubatie bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende de nacht.
  4. De volgende morgen, voeg ~ 1 x 10 7-GFP expressie A. fumigatus conidia gesuspendeerd in 100 pl voorverwarmde (37 ° C) RPMI 1640, 10% FBS.
  5. Terug plaat 37 ° C incubator met 5% CO2.
  6. De cellen moeten minimaal 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C worden vastgesteld Op 3, 7 en 14 uur fix cellen door toevoeging van een gelijk volume 2% formaldehyde aan elk putje (eindconcentratie 1% formaldehyde). Plaats platen voor devroege tijdstippen bij 4 ° C gedurende de nacht. Voor het laatste tijdstip (14 uur), vast cellen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
  7. Na fixatie, verwijder voorzichtig dekglaasjes behulp van een tang en spoel in DPBS.
  8. Overtollige vloeistof door het plaatsen van de rand van het dekglaasje op een gevouwen Kimwipe.
  9. Solliciteer 6 pl fluorescentie montage medium met DAPI een microscoopglaasje.
  10. Leg een rand van het dekglaasje op de dia en voorzichtig druppel met cel naar beneden in het fixeermiddel. Montage medium zal verspreiden en vormen een gelijkmatige laag onder het dekglaasje. Er is geen noodzaak om druk op het dekglaasje.
  11. Seal randen van dekglaasje met duidelijke nagellak en laat aan de lucht drogen.
  12. Archief bereid dia's in een dia box (beschermd tegen licht) bij kamertemperatuur totdat klaar om te analyseren door confocale microscopie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Verzamelen alveolaire macrofaag door BAL van gestimuleerde muizen zal resulteren in een> 95% zuivere populatie op basis van cytologie. De 3 en 7 uur (figuur 2) tijdstippen vooraf aan de hyfen stadium van schimmelgroei en maken een vergelijking van fagocytische efficiëntie van conidia tussen genotypen. De 14 uur tijdstip is waar genotypen vergelijkbaar wat betreft de mogelijkheid om de overgang van gefagociteerde conidia de weefsel-invasieve hyfen fase (figuur 3) remmen. Intact macrofaag kan worden geïdentificeerd door confocale microscopie van PKH26 en DAPI kleuring van het membraan en de kern respectievelijk (figuren 2 en 3). Sporen en hyfen zijn geïdentificeerd op basis van GFP-expressie (Figuren 2 en 3).

iles/ftp_upload/51678/51678fig1.jpg "/>
Figuur 1. Anatomische Directional Verwijzingen en de 4-weg kraan. A) De anatomische directionele verzoeken om een muis worden getoond. Craniale in de richting van de kop, terwijl caudaal in de richting van de staart. De ventrale zijde van een viervoeter is naar de buik of het onderoppervlak van het dier, terwijl de dorsale zijde tegen de achterkant of het bovenoppervlak van het dier. B) de 4-weg kraan heeft drie luer-aansluitingen en een handgreep die roteert 360 ° om de stroom van vloeistoffen door de plugkraan. Plaatsing van de lege spuit, de volledige spuit en de katheter worden aangegeven. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2 Figuur 2. Fagocytose van A. fumigatus sporen vergelijkbaar tussen genotypen 7 uur. Om het vermogen van geïsoleerde alveolaire macrofagen met NADPH-oxidase activiteit om de groei van gefagociteerde conidia beperken evalueren (A) wild-type (B) Ncf1 * / * Mn + en (C ) Ncf1 * / * Mn - muizen werden toegediend iv PKH26. 10 dagen later werden alveolaire macrofagen geoogst door BAL en geënt met conidia van GFP-expressie A. fumigatus. Cellen werden vastgesteld op 3, 7 en 14 uur na toevoeging van conidia. Bij 3 (gegevens niet getoond) en 7 uur zowel het totale aantal macrofagen en macrofaag met ≥ 1 gefagocyteerd conidia (pijlen) waren vergelijkbaar in de drie genotypen, reflecterende soortgelijke fagocytose efficiëntie. Intact macrofagen worden geïdentificeerd op basis van PKH26 (rood) en DAPI (blauw) kleuring van het membraan eennd kernen respectievelijk. De fluorescentie beelden van een enkele Z-plane worden overlay met een afbeelding het helder veld. Het beeld heldere veld bestaat uit licht dat door het gehele monster en dus, als overlain op de tl-Z-vlakte maakt visualisatie van cellen en conidia binnen de gehele Z-stack. Schaal bar, 19 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 3
Figuur 3. Macrofagen NADPH oxidase is vereist om de groei van A. beheersen . fumigatus sporen confocale microscopie van (A, D) wild-type, (B, E) Ncf1 * / * Mn +, en (C, F) Ncf1 * / * Mn - < / Sup> alveolaire macrofagen in 14 uur na het zaaien met GFP + A. fumigatus conidia. Intact macrofagen worden geïdentificeerd op basis van PKH26 (rood) en DAPI (blauw) kleuring van membranen en kernen, respectievelijk. Solid pijlen intact macrofagen met ten minste een gefagociteerde conidia en holle pijlen wijzen naar hyfen. Talrijke AMs met tenminste 1 gefagocyteerd conidia werden waargenomen met wildtype en Ncf1 * / * Mn + cellen, maar niet met NADPH oxidase-deficiënte cellen. GFP signaal hyfen is variabel op basis van het vlak van de z gestapelde beeld weergegeven. AC) Fluorescentie beelden van een Z-vlak met beeld helderveld mogelijk visualisatie van cellen en hyfen binnen de gehele Z-stack. DF) Fluorescentie afbeeldingen uit een enkele Z-vlak zonder helderveld achtergrond identificatie mogelijk maken van cellen, maar niet de ruimtelijke relatie van cellen en schimmels in verschillende Z-vlakken. Schaal bar, 19 micrometer..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Met deze aanpak voor ex vivo analyse van de antifungale activiteit van macrofagen met in vivo schimmel uitdaging we eerder aangetoond dat NADPH oxidase in macrofagen een belangrijke rol in de verdediging tegen A. speelt fumigatus 4. Het gebruik van geïsoleerde alveolaire macrofagen kunnen wij concentreren op hun antifungale activiteit in de afwezigheid van andere immuuncellen (bijvoorbeeld geworven neutrofielen) die verdedigen tegen Aspergillus in vivo.

Verschillende visualisatie strategieën zijn gebruikt om macrofaag antischimmelactiviteit evalueren in vivo en ex vivo. Luther et al.., Gebruikt confocale microscopie om fagocytose van Aspergillus conidia bestuderen door de mens (geoogst van longtransplantatie) en muis AMs 12. Geunes-Boyer et al.. kenmerk de interactie tussen Candida krusei en murine macrofagen na fagocytose. Zegebruikt een macrofaag cellijn, RAW264.7 en primaire macrofagen van het buikvlies 13. Garcia-Rodas et al.. bleek dat surfactant proteïne-D bindt aan en vergemakkelijkt de fagocytose en overleving van Cryptococcus neoformans 14. SP-D binding werd ook onderzocht in vivo in SP-D - / - muizen intranasaal geïnoculeerd met Alexa Fluor 488-gelabeld C. neoformans. Na long lavage, werden amendementen immunofluorescently gelabeld en confocale microscopie werd gebruikt om fagocytose te analyseren.

Macrofagen uit verschillende anatomische locaties (bijv. alveolaire, milt, peritoneale), gemaakt met verschillende stimuli (bv. thioglycollaat uitlokking of in vitro differentiatie), of uit cellijnen (bijv. RAW264.7) drastisch verschillende antimicrobiële en ontstekingsreacties 15 hebben - 18. Daarom nauwst model de gastheer respons op geïnhaleerd fungi, gebruikten we alveolaire macrofagen geoogst door bronchoalveolaire lavage van gestimuleerde muizen onmiddellijk na offer.

In eerste instantie gebruikt we live-cell imaging macrofagen antischimmelactiviteit 4 evalueren. Alveolaire macrofagen werden uitgezet in chambered glasplaatjes vervolgens bezaaid met GFP-expressie Aspergillus. Na 3 uur werden de niet-gefagocyteerde conidia verwijderd door voorzichtig wassen om onbelemmerd visualisatie van gefagocyteerde conidia toestaan. Conidiale kieming werd vervolgens gecontroleerd door time-lapse imaging in intervallen van 30 minuten met behulp van helder licht afbeeldingen om macrofagen en GFP-fluorescentie te visualiseren om schimmels te visualiseren. Deze werkwijze heeft het voordeel van het verwerven van opeenvolgende beelden van hetzelfde primaire celkweek. De neiging van de macrofaag om over het gezichtsveld trekken in wording termijn voor een kwalitatieve dan een kwantitatieve beoordeling van conidiocidal activiteit. Een ander nadeel van levende cellen beeldvorming thij gebrek aan helderheid en detail als cellen in en uit het vlak van focus.

Om beelden met meer detail vinden we kozen confocale microscopie die de reconstructie van driedimensionale structuren van de verkregen beelden maakt. Drie-dimensionale reconstructie geeft de mogelijkheid om tussen hyfen groeien rond plaats of door een macrofaag. Met dit vermogen om de cellen en schimmels zie driedimensionaal, verwijdering van niet-gefagocyteerde conidia op 3 uur niet langer een noodzakelijke stap. Conidia kan ook juist onderscheiden als intracellulaire versus extracellulair.

Voor een verbeterde visualisatie, werden alveolaire macrofagen in vivo gemerkt met PKH26. Deze fluorescente kleurstof is een lange alifatische staart die stabiel opgenomen in de lipide gebieden van celmembranen. Bij intraveneuze injectie, wordt deze lipofiele kleurstof opgenomen door fagocytische cellen, zowel in de bloedsomloop en weefsels. Na 10 dagen, Labeleidde fagocyten zijn verwijderd uit muizen circulatie en blijven alleen in de weefsels 9, waardoor het verzamelen van al gelabeld alveolaire macrofagen door BAL. Met het gebruik van in vivo labeling, na de oogst manipulatie van alveolaire macrofagen wordt geminimaliseerd.

Een ander voordeel van dit protocol is het gebruik van een GFP-expressie A. fumigatus stam. Deze schimmel uitdrukking GFP uit de conidiale stadium door de hyphal podium en heeft geen behoefte aan verdere kleuring. Met dubbele kleuring van macrofagen en Aspergillus, zijn we in staat om gefagocyteerde conidia identificeren.

Een beperkende factor in dit protocol is de macrofaag opbrengst van de BAL. Een kenmerkende opbrengst van de gestimuleerde muizen in het traject van 3-5 x 10 5 alveolaire macrofagen, maar dit aantal kan sterk variëren, afhankelijk van factoren zoals grootte van de muis, de ervaring van de persoon die de lavage en het aantal instillaties van lavage griepid en de longen uit opgetrokken volume. In dit protocol wordt long lavage uitgevoerd met een gesloten borstholte die samen met 1 ml herhaalde instillatie helpt cel opbrengst te verhogen in vergelijking met een open borstholte en minder instillatie. Muis nummers kan ook worden verhoogd oogst opbrengst te verhogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten Grant R01AI079253 (tot BHS), en door het National Cancer Institute Cancer Support Grant CA016056 naar Roswell Park Cancer Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol Sigma T48402 Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol Sigma A-1685 Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning 21-031-CV
NH4Cl Sigma A0171 Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3 Sigma P91444 Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA Sigma E6758 Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter BD 381523 Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock Fisher Scientific 50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 heat inactivated
Hema 3 Stain Set Fisher Scientific 22-122-911
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants BD 297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers BD Falcon 64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge Thermo Scientific
Cell culture incubator 37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass VWR 48366-227 glass coverslips
6-well Cell culture plates Corning 3506
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
  2. Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
  3. Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
  4. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
  5. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
  6. Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
  7. Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
  8. Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
  9. Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
  10. Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
  11. Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
  12. Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
  13. Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
  14. García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
  15. Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
  16. Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
  17. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
  18. Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics