La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

Immunology and Infection

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Summary

Un método para evaluar la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratón para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados por microscopía confocal.

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Grimm, M. J., D'Auria, A. C., Segal, B. H. Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51678, doi:10.3791/51678 (2014).

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Abstract

El pulmón es una interfaz donde células huésped están expuestos rutinariamente a los microbios y productos microbianos. Los macrófagos alveolares son las células fagocíticas de primera línea que se encuentran los hongos y otros microbios inhalados. Los macrófagos y otras células inmunes reconocen motivos de Aspergillus por receptores de reconocimiento de patógenos e iniciar respuestas inflamatorias aguas abajo. La oxidasa NADPH fagocítica genera intermediarios reactivos del oxígeno (ROI) y es fundamental para la defensa del huésped. Aunque la NADPH oxidasa es crítico para la defensa del huésped mediada por neutrófilos 1 - 3, la importancia de la NADPH oxidasa en macrófagos no está bien definido. El objetivo de este estudio fue definir el papel específico de la NADPH oxidasa en macrófagos en la mediación de la defensa del huésped contra A. fumigatus. Se encontró que la NADPH oxidasa en macrófagos alveolares controla el crecimiento de fagocitado A. fumigatus esporas 4. Aquí se describe un método para evaluar la capacidad de un ratónmacrófagos lveolar (AMS) para controlar el crecimiento de las esporas de Aspergillus fagocitados (conidios). Los macrófagos alveolares se tiñeron in vivo y diez días después aisladas de ratones por lavado broncoalveolar (BAL). Los macrófagos se cultivaron sobre cubreobjetos de vidrio, y luego sembraron con la proteína verde fluorescente (GFP) que expresan A. esporas fumigatus. En momentos determinados, las células se fijan y el número de macrófagos intactas con esporas fagocitados se evaluaron por microscopía confocal.

Introduction

Los macrófagos alveolares son las células fagocíticas de primera línea que se encuentran con microbios inhalados. Los macrófagos reconocen motivos Aspergillus por los receptores de reconocimiento de patógenos, ingieren y limitan el crecimiento de las esporas inhaladas (conidios), e inician la respuesta inflamatoria. La NADPH oxidasa de los fagocitos convierte oxígeno molecular para el anión superóxido y intermediarios reactivos del oxígeno aguas abajo (Rois). La enfermedad granulomatosa crónica (CGD) es un trastorno hereditario de la NADPH oxidasa se caracteriza por infecciones bacterianas y fúngicas graves y por las respuestas inflamatorias excesivas.

Aunque la NADPH oxidasa es crítico para la defensa del huésped mediada por neutrófilos 1 - 3, la importancia de la NADPH oxidasa en macrófagos no está bien definido. Estudios anteriores han demostrado que los macrófagos alveolares ingerir y destruir las esporas de Aspergillus, mientras que los neutrófilos se dirigen principalmente a la etapa de las hifas 5. Sin embargo, ha habido Resul en conflictoTS como para el papel de la NADPH oxidasa en macrófagos en el control del crecimiento de A. fumigatus esporas 6, 7.

El objetivo de este método era para delinear el papel específico de la NADPH oxidasa en los macrófagos en la mediación de la defensa del huésped frente a A. esporas fumigatus. Se encontró que la NADPH oxidasa en macrófagos alveolares controla el crecimiento de fagocitado A. fumigatus esporas 4. Para modelar más de cerca la respuesta del huésped a los hongos inhalados, utilizamos los macrófagos alveolares cosechadas por lavado broncoalveolar de los ratones estimulados inmediatamente después del sacrificio. El uso de los macrófagos alveolares aislados nos ha permitido centrarse en su actividad antifúngica en ausencia de otras células del sistema inmune (por ejemplo, neutrófilos reclutados) que defienden contra Aspergillus in vivo. En este método, los macrófagos alveolares se tiñeron in vivo antes de la cosecha a fin de minimizar la cantidad de manipulación posterior a la cosecha. </ P>

Otra ventaja de este protocolo es el uso de un GFP-expresando A. cepa fumigatus. Este hongo expresa GFP desde la etapa de conidios por la etapa de hifas y no tiene necesidad de una mayor tinción. Para obtener imágenes con mayor detalle, se optó por la microscopía confocal, que permite la reconstrucción de las estructuras tridimensionales a partir de las imágenes obtenidas. Reconstrucción tridimensional da la capacidad de diferenciar entre las hifas en crecimiento alrededor en lugar de en o a través de un macrófago. Las conidias también puede ser precisamente distingue como intracelular frente extracelular.

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Protocol

Todos los procedimientos realizados en animales en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo en el Instituto del Cáncer Roswell Park y cumplan con todo el estado, federal, y los Institutos Nacionales de la normativa de salud.

1. In vivo de macrófagos Etiquetado

Nota: PHK26 es un colorante lipófilo que se tomará por las células fagocíticas, tanto en la circulación y en los tejidos cuando se administra por vía intravenosa (iv). PKH26 se utilizó para el etiquetado in vivo para minimizar la cantidad de manipulación posterior a la cosecha de los macrófagos. PKH-26 tiene la ventaja de acumular de manera estable en los macrófagos alveolares durante periodos prolongados. Esperar 10 días después de la administración permite la limpieza de todas las células de la etiqueta de la circulación dejando sólo macrófagos alveolares de forma estable marcada con PKH26 8, 9. PKH26 es un fluorocromo rojo que tiene de excitación (551 nm) y emisión (567 nm) características compatiblescon los sistemas de detección de rodamina o ficoeritrina. Cualquier procedimiento de etiquetado puede introducir artefactos, incluyendo la pérdida de viabilidad. Sin embargo, puesto que utilizamos el mismo enfoque para el etiquetado de los macrófagos en diferentes genotipos de ratón (por ejemplo, WT frente a la NADPH-oxidasa deficiente), los efectos de estos artefactos serían uniforme.

  1. Diluir la solución madre de PKH26 (1 x 10 -3 M en etanol) 1:05 en diluyente C proporcionada por el fabricante.
  2. De carga 100 l de PKH26 diluida en una jeringa de 1/2 ml de insulina (29 g x 1/2 ") para cada ratón.
  3. Administrar a los ratones por inyección iv (vena de la cola o bien retro-orbital) al menos 10 días antes de la cosecha.

2. Recolección de los macrófagos alveolares de lavado broncoalveolar (BAL)

El número de ratones a utilizar para un experimento puede variar. Un rendimiento típico de un ratón no estimulada está en el intervalo de 3-5 x 10 5 macrófagos alveolares, sin embargo este número puede variar en gran medida based de factores tales como el tamaño del ratón, la experiencia de la persona que realiza el lavado, y el número de instilaciones de líquido de lavado y el volumen retirado de los pulmones. En este protocolo de lavado pulmonar se realiza con una cavidad torácica cerrada que junto con repetidos lavados de 1 ml ayuda a aumentar el rendimiento de células.

  1. La eutanasia del ratón mediante la administración de una dosis letal de anestésico Avertin (12,5 mg) por vía intraperitoneal (IP) usando condiciones asépticas para mantener la solución estéril.
  2. Pulverizar ratón a fondo con etanol al 70%.
  3. Retire la piel desde el extremo craneal de animales exponiendo el tórax (Figura 1A).
    1. Hacer un pequeño corte en la piel justo debajo del diafragma.
    2. Inserte el dedo en el corte y tire de la piel lejos del extremo craneal del animal (Figura 1A).
    3. Empuje ligeramente hacia arriba en la cabeza, que se extiende la parte ventral del cuello (fig. 1A).
  4. Corte un pequeño agujero a través de la caja torácicaen el lado derecho del tórax para desinflar los pulmones y también permitir la visualización de los pulmones durante los siguientes pasos.
  5. Busque la tráquea, y cuidadosamente diseccionar el tejido circundante.
    1. Retire las glándulas salivales, los músculos esternohioideo y laringe, etc con pinzas curvas.
    2. Levante con cuidado con unas pinzas curvas y cortar con tijeras el tejido delgado que cubre la tráquea (adventicia) que revela la estructura del cartílago anillado subyacente.
  6. Inserte catéter en la tráquea.
    1. Con unas pinzas curvas, colocar una sutura detrás (dorsal a) la tráquea y tirar de una longitud de 10 cm a través de la abertura.
    2. Comenzando por encima del cricoides (el anillo engrosado del cartílago) guiar cuidadosamente el catéter 22 G por la tráquea parando donde la tráquea se desaparece detrás del esternón.
    3. Firmemente atar sutura alrededor de la tráquea y el catéter para un ajuste perfecto. Retire la aguja del catéter.
  7. Ensamble de 4 vías llave de paso.
    1. Llenaruno 6 ml de jeringa con DPBS, 1% de FBS y se unen a 4 vías llave de paso tal como se indica en la Figura 1B.
    2. Adjuntar un vacío 6 ml jeringa en la posición indicada en la 4 vías llave de paso (Figura 1B).
    3. Conecte el puerto abierto en el 4 vías llave de paso para catéter (Figura 1B). Tenga cuidado de no desconectar el catéter de la tráquea.
  8. Recoger el líquido del lavado de los pulmones.
    Nota: Los investigadores pueden optar por usar menores volúmenes de líquido de lavado para reducir al mínimo la posibilidad de daños en el tejido. Es importante que el mismo enfoque puede aplicarse de manera coherente en todos los grupos de ratones.
    1. Gire la manija de la llave de paso por lo que la jeringa vacía se cierra y se inyecte lentamente ~ 1 ml de DPBS, 1% de SFB para inflar los pulmones. Observar la inflación de pulmón a través del agujero en el paso 2.4.
    2. Tenga cuidado de no inflar demasiado los pulmones.
    3. Gire la manija de la llave de paso para que la jeringa llena se cierra, y retirar con cuidado la gripe Identificación de los pulmones.
    4. Observar los pulmones se desinflan a través del agujero cortado en el paso 1.4. El catéter puede necesitar ser movido ligeramente hacia atrás o hacia delante para conseguir un buen sorteo. Tomar la precaución especial para mantener el catéter dentro de la tráquea.
    5. Repetir los pasos 2.8.1-2.8.4 5-6x hasta que todo el DPBS, 1% de FBS ha sido inyectado y retirado de los pulmones. Nota: la recuperación del líquido pulmonar no será del 100% del fluido inyectado.
  9. Vaciar la jeringa con el líquido de lavado en un tubo cónico de 50 ml. Mantener las células a temperatura ambiente.
  10. Precipitar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y se vierte el sobrenadante. Esto puede ser guardado para el análisis de citoquinas si se desea.
  11. Resuspender las células en 1-5 ml de RPMI 1640 con 10% de FBS y contar en un hemocitómetro. En el ratón sin estimular,> 95% de las células recogidas por BAL se espera que sean los macrófagos, que pueden ser confirmados mediante citología.

3. El cultivo y cosecha Hongo

"> El Aspergillus fumigatus utilizada en este protocolo expresa GFP en todas las etapas de su ciclo de vida:. Esporas, hifas y esporofitos Esta cepa fúngica fue proporcionada por el Dr. Margo Moore, de la Universidad Simon Fraser, Burnaby, BC, Canadá.

  1. Placa de conidios de una cepa de Aspergillus fumigatus que expresan GFP en Sabouraud infusión de cerebro corazón (BHI) agar tubos inclinados con cloranfenicol (0,05 g / L) y gentamicina (0,5 g / L).
  2. Incubar en la oscuridad taparon sin apretar durante 7 a 10 días a temperatura ambiente.
  3. Cosecha conidios por inclinación lavado con 10 ml de 0,01% de Tween 20 en DPBS. Ligeramente raspar el hongo con el STRIPETTE para aflojar. Enjuague la inclinación varias veces para aumentar el rendimiento.
  4. Pase suspensión de conidios a través de un filtro de células de 100 micras en una cónica 50 ml.
  5. Pellet conidios por centrifugación a 400 xg durante 10 min.
  6. Conidios Resuspender en 50 ml de DPBS y contar utilizando un hemocitómetro.
  7. Lavar dos veces con DPBS y diluir a concentraciones deseadastración.

4. Fungal Challenge y microscopía confocal

Para investigar el papel de la NADPH oxidasa de los macrófagos en la defensa del huésped, se evaluó la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratones de tres genotipos para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados. Los genotipos utilizados en este estudio incluyen; 1) ratones de tipo salvaje, 2) NCF1 * / * Mn-ratones con una mutación NCF1 de origen natural (NCF1 codifica para p47 phox, un componente necesario de la NADPH oxidasa de los fagocitos) dejándolos deficiente de NADPH oxidasa, y 3) NCF1 * / * Mn + ratones transgénicos (MN indica la transgén albergar NCF1 de tipo salvaje bajo el control del promotor de CD68 humano), donde la actividad de la NADPH oxidasa se ​​ha reconstituido en la población de monocitos / macrófagos 10, 11.

La microscopía confocal es el más adecuado para este ensayo debido a la presenciay el crecimiento de los conidios no fagocitado en las diapositivas. El microscopio confocal permitirá la visualización de los planos individuales dentro del eje Z, y permitir la diferenciación entre hongo que crece alrededor en lugar de en el interior de los macrófagos. Todas las imágenes de confocal se adquieren utilizando una lente de inmersión en aceite de 63X. Z-pilas se adquieren con un factor de zoom electrónico de 2,5. El espesor de una pila Z se determina utilizando DAPI y las imágenes de campo claro para localizar la parte superior y la parte inferior del campo. Z-pilas variaron de 14 a 24 micras con rodajas individuales ~ 1 m de espesor. Para la cuantificación de los macrófagos, las exploraciones individuales de zoom electrónico 1X se realizaron en 10 campos por genotipo. Se identificaron macrófagos intacta en virtud de PKH26 y tinción DAPI de la membrana y el núcleo, respectivamente. Los conidios fueron identificados sobre la base de la expresión FITC y la imagen de campo brillante.

  1. Preparar cubreobjetos y placas estériles
    1. En virtud de una cabina de seguridad biológica, remoje 22 x 22 mm cubreobjetos de vidrio en el 70% etanol durante 5-10 min.
    2. Enjuague cubreobjetos en PBS estéril.
    3. Usando una pinza estéril, coloque suavemente un único portaobjetos en la parte inferior de cada pocillo de una placa de 6 pocillos estériles envasados ​​individualmente.
  2. Semilla ~ 1 x 10 6 cosechado PKH26 etiquetado macrófagos alveolares en suspensión en 300 l de RPMI 1640, 10% de FBS a cada cubreobjetos. El número exacto puede variar dependiendo del rendimiento de la cosecha.
  3. Permitir que los macrófagos se adhiera mediante la incubación a 37 ° C con 5% de CO 2 durante la noche.
  4. A la mañana siguiente, añadir aproximadamente 1 x 10 7 GFP-expresando A. fumigatus conidias suspendió en 100 l pre-calentado (37 ° C) de RPMI 1640, 10% de FBS.
  5. Placa de Regreso a 37 ° C incubadora con 5% de CO 2.
  6. Las células deben ser fijados por un mínimo de 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. A los 3, 7, y 14 hr células de arreglo mediante la adición de un volumen igual de 2% de formaldehído a cada pocillo (concentración final 1% de formaldehído). Coloque las placas para elmomentos de la hora temprana a 4 ° C durante la noche. Para el punto de tiempo final (14 horas), fijar las células a temperatura ambiente durante 2 horas.
  7. Después de la fijación, retire suavemente cubreobjetos con unas pinzas y enjuague en DPBS.
  8. Eliminar el exceso de líquido colocando el borde del cubreobjetos sobre un Kimwipe doblado.
  9. Aplicar medio de montaje 6 l de fluorescencia con DAPI a un portaobjetos de microscopio de vidrio.
  10. Coloque un borde del cubreobjetos sobre el portaobjetos y colocar suavemente con las células hacia abajo en el medio de montaje. Medio de montaje se extienda y formar una capa uniforme debajo del cubreobjetos. No hay necesidad de presionar sobre el cubreobjetos.
  11. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y dejar secar al aire.
  12. Tienda prepara diapositivas en una caja de diapositivas (protegido de la luz) a temperatura ambiente hasta que se vaya a analizar por microscopía confocal.

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Representative Results

Recogida de los macrófagos alveolares por BAL de ratones no estimulados se traducirá en una población> 95% de pureza basado en citología. El 3 y 7 horas (Figura 2) puntos de tiempo preceden a la etapa de hifas de crecimiento de hongos y permiten una comparación de la eficiencia fagocítica de los conidios entre los genotipos. El punto de tiempo de 14 horas es donde genotipos se pueden comparar con respecto a la capacidad para inhibir la transición de conidios fagocitado a la etapa de hifas invasiva de tejidos (Figura 3). Macrófagos intacto puede ser identificado por microscopía confocal basándose en la tinción DAPI PKH26 y de la membrana y el núcleo, respectivamente (Figuras 2 y 3). Los conidios e hifas se identifican sobre la base de la expresión de GFP (figuras 2 y 3).

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Se muestran la figura 1. Anatómico direccionales Referencias y el 4-Way Llave de paso. A) Las referencias direccionales anatómicos para un ratón. Craneal es en la dirección de la cabeza, mientras caudal es en la dirección de la cola. El lado ventral de un cuadrúpedo es hacia el vientre o la superficie inferior del animal, mientras que el lado dorsal es hacia la parte trasera o la superficie superior del animal. B) La llave de paso de 4 vías tiene tres conexiones luer y un mango que gira 360 ° para dirigir el flujo de fluidos a través de la llave de paso. La colocación de la jeringa vacía, la jeringa llena y el catéter se indican. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2 Figura 2. Fagocitosis de A. esporas fumigatus es similar entre los genotipos a las 7 horas. Para evaluar la capacidad de los macrófagos alveolares aislados con actividad de NADPH oxidasa para limitar el crecimiento de conidios fagocitado, (A) de tipo salvaje, (B) NCF1 * / * Mn +, y (C NCF1) * / * Mn - ratones se les administró PKH26 IV. Los macrófagos alveolares se recogieron mediante lavado broncoalveolar 10 días más tarde y se sembraron con conidios de expresión de GFP-A. fumigatus. Las células se fijaron a los 3, 7, y 14 horas después de la adición de los conidios. En 3 (datos no mostrados) y 7 horas tanto el número de macrófagos totales y de macrófagos con ≥ 1 fagocitados conidios (flechas) fueron similares entre los tres genotipos, reflejando la eficiencia de la fagocitosis similares. Macrófagos intactos se identifican sobre la base de PKH26 (rojo) y DAPI (azul) tinción de la membrana unnúcleos ª respectivamente. Las imágenes de fluorescencia de un solo plano Z se superponen la imagen de campo claro con. La imagen de campo claro se compone de la luz transmitida a través de toda la muestra y por lo que cuando sobrepuesto sobre el fluorescente Z-llano permite la visualización de las células y los conidios dentro de la totalidad de Z-stack. La barra de escala, 19 micras. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3
Se requiere la Figura 3. Macrófagos de NADPH oxidasa para controlar el crecimiento de A. . esporas fumigatus La microscopía confocal de (A, D) de tipo salvaje, (B, E) NCF1 * / * Mn +, y (C, F) NCF1 * / * Mn - < / Sup> macrófagos alveolares en 14 horas después de la siembra con GFP + A. conidios fumigatus. Macrófagos intactos se identifican sobre la base de PKH26 (rojo) y DAPI (azul) tinción de las membranas y los núcleos, respectivamente. Las flechas continuas muestran los macrófagos intactas con al menos uno de conidios fagocitados y flechas huecas apuntan a hifas. Numerosas medidas de acompañamiento con al menos 1 fagocitados conidios se observaron con los de tipo salvaje y NCF1 * / * células Mn +, pero no con las células-oxidasa NADPH deficiente. Señal de GFP en hifas fue variable basado en el plano de la imagen de z-apiladas muestran. AC) Las imágenes de fluorescencia de un solo plano Z de la imagen de campo claro con permitir la visualización de las células y las hifas dentro de la totalidad de Z-stack. DF) Las imágenes de fluorescencia de un solo plano Z sin el fondo del campo brillante permitir la identificación de las células, pero no la relación espacial de las células y hongos en diferentes Z-planos. La barra de escala, 19 micras..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Discussion

El uso de este enfoque para el análisis ex vivo de la actividad antifúngica de los macrófagos junto con in vivo de exposición fúngica, Hemos demostrado anteriormente que la NADPH oxidasa en macrófagos desempeña un papel importante en la defensa contra A. fumigatus 4. El uso de los macrófagos alveolares aislados nos permite centrarse en su actividad antifúngica en ausencia de otras células inmunes (por ejemplo, los neutrófilos reclutados) que defienden contra Aspergillus in vivo.

Varias estrategias de visualización se han utilizado para evaluar la actividad antifúngica de los macrófagos in vivo y ex vivo. Luther et al., Utilizado microscopía confocal para estudiar la fagocitosis de Aspergillus conidia por AMs ratón-humano (cosechada de los receptores de trasplante de pulmón) y 12. Geunes-Boyer et al. caracteriza la interacción entre Candida krusei y macrófagos murinos tras la fagocitosis. Ellosutiliza una línea celular de macrófagos, RAW264.7 y macrófagos primarios del peritoneo 13. García-Rodas et al. mostró que la proteína surfactante-D se une y facilita la fagocitosis y la supervivencia de Cryptococcus neoformans 14. SP-D de unión también se investigó in vivo usando la SP-D - / - ratones por vía intranasal inoculados con Alexa Fluor 488 marcado con C. neoformans. Después de lavado pulmonar, AMS se immunofluorescently etiquetado y microscopía confocal se utilizó para analizar la fagocitosis.

Los macrófagos de diferentes sitios anatómicos (por ejemplo, alveolar, esplénica, peritoneales), generados con diferentes estímulos (por ejemplo, tioglicolato de elicitación o en la diferenciación in vitro), o de líneas celulares (por ejemplo, RAW264.7) pueden tener dramáticamente diferentes respuestas inflamatorias antimicrobianos y 15 - 18. Por lo tanto, para modelar más de cerca la respuesta del huésped a la diversión inhaladogi, utilizamos los macrófagos alveolares cosechadas por lavado broncoalveolar de los ratones estimulados inmediatamente después del sacrificio.

Inicialmente se utilizaron imágenes de células vivas para evaluar la actividad antifúngica de los macrófagos 4. Macrófagos alveolares se sembraron en placas de vidrio septadas entonces sembraron con GFP expresando Aspergillus. Después de 3 horas, conidios no fagocitados se eliminaron mediante lavado suave para permitir la visualización sin obstrucciones de conidios fagocitado. La germinación de los conidios se controló luego por time-lapse en intervalos de 30 minutos a partir de imágenes de luz brillante para visualizar los macrófagos y la fluorescencia de GFP para visualizar los hongos. Este método tiene la ventaja de la adquisición de imágenes secuenciales de la misma cultivo de células primarias. Sin embargo, la tendencia de los macrófagos a migrar a través del campo de visión durante el curso de adquisición permitido para un cualitativa en lugar de una evaluación cuantitativa de la actividad conidiocidal. Otra desventaja de imágenes de células vivas es tque la falta de claridad y detalle que las células se mueven dentro y fuera del plano de foco.

Para obtener imágenes con mayor detalle elegimos microscopía confocal que permite la reconstrucción de estructuras tridimensionales a partir de las imágenes obtenidas. Reconstrucción tridimensional da la capacidad de diferenciar entre las hifas en crecimiento alrededor en lugar de en o a través de un macrófago. Con esta capacidad de ver las células y hongos en tres dimensiones, la eliminación de conidios no fagocitado en 3 horas ya no es un paso necesario. Las conidias también puede ser precisamente distingue como intracelular frente extracelular.

Para la visualización mejorada, macrófagos alveolares fueron etiquetados en vivo con PKH26. Este colorante fluorescente tiene una cola alifática larga que incorpora de manera estable en las regiones de lípidos de las membranas celulares. Cuando se inyecta por vía intravenosa, este colorante lipófilo es absorbido por las células fagocíticas, tanto en el torrente sanguíneo y en los tejidos. Después de 10 días, labefagocitos encabezados se eliminan de la circulación murino y se mantienen sólo en los tejidos 9, lo que permite la recopilación de etiquetado ya los macrófagos alveolares BAL. Con se minimiza el uso del etiquetado in vivo, la manipulación posterior a la cosecha de los macrófagos alveolares.

Otra ventaja de este protocolo es el uso de un GFP-expresando A. cepa fumigatus. Este hongo expresa GFP desde la etapa de conidios por la etapa de hifas y no tiene necesidad de una mayor tinción. Con la doble tinción de macrófagos y Aspergillus, somos capaces de identificar conidios fagocitado.

Un factor limitante en este protocolo es el rendimiento de los macrófagos de la BAL. Un rendimiento típico de un ratón no estimulada está en el intervalo de 3-5 x 10 5 macrófagos alveolares, sin embargo este número puede variar en gran medida sobre la base de factores tales como el tamaño del ratón, la experiencia de la persona que realiza el lavado, y el número de instilaciones de la gripe lavadoIdentificación y el volumen retirado de los pulmones. En este protocolo, lavado pulmonar se realiza con una cavidad torácica cerrada que junto con instilaciones repetidas 1 ml ayuda a aumentar el rendimiento de células en comparación con una cavidad torácica abierta y un menor número de instilaciones. Números de ratón también se puede aumentar para aumentar el rendimiento de la cosecha.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de Grant R01AI079253 (a BHS) y por el Instituto Nacional del Cáncer Centro del Cáncer de subvención de apoyo CA016056 al Instituto del Cáncer Roswell Park.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol Sigma T48402 Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol Sigma A-1685 Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning 21-031-CV
NH4Cl Sigma A0171 Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3 Sigma P91444 Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA Sigma E6758 Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter BD 381523 Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock Fisher Scientific 50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 heat inactivated
Hema 3 Stain Set Fisher Scientific 22-122-911
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants BD 297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers BD Falcon 64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge Thermo Scientific
Cell culture incubator 37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass VWR 48366-227 glass coverslips
6-well Cell culture plates Corning 3506
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope

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References

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