Vurdere Anti-sopp aktivitet av isolerte alveolære makrofager ved konfokalmikroskopi

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En fremgangsmåte for å evaluere evnen av isolerte mus alveolære makrofager til å kontrollere veksten av fagocytterte Aspergillus spores ved konfokal mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Grimm, M. J., D'Auria, A. C., Segal, B. H. Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51678, doi:10.3791/51678 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lungene er et grensesnitt der vertsceller blir rutinemessig utsatt for mikrober og mikrobielle produkter. Alveolære makrofager er de første linjer fagocytiske celler som møter inhalert sopp og andre mikrober. Makrofager og andre immunceller gjenkjenne Aspergillus motiver etter patogen anerkjennelse reseptorer og initiere nedstrøms inflammatoriske responser. Den phagocyte NADPH oksidase genererer reaktive oksygen mellomprodukter (Rois) og er kritisk for host forsvar. Selv om NADPH oksidase er kritisk for nøytrofil-mediert vertsforsvar 1 - 3, er betydningen av NADPH oksidase i makrofager er ikke godt definert. Målet med denne studien var å avgrense den spesifikke rolle NADPH oksidase i makrofager i formidling host forsvar mot A. fumigatus. Vi fant ut at NADPH oksidase i alveolære makrofager styrer veksten av phagocytosed A. fumigatus spores fire. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å vurdere muligheten for en muslveolar makrofager (AMS) for å kontrollere veksten av phagocytosed Aspergillus sporer (conidia). Alveolære makrofager er farget in vivo og ti dager senere isolert fra mus ved bronchoalveolar lavage (BAL). Makrofager er belagt på glass dekkglass, deretter sådd med grønt fluorescerende protein (GFP)-uttrykke A. fumigatus sporer. På bestemte tidspunkter, blir cellene fiksert og antall intakte makrofager med fagocytterte sporer vurderes av konfokalmikroskopi.

Introduction

Alveolære makrofager er de første linjer fagocytiske celler som møter inhalerte mikrober. Makrofager gjenkjenner Aspergillus motiver etter patogen anerkjennelse reseptorer, svelges og begrense veksten av inhalert sporer (conidia), og sette i gang betennelsesreaksjoner. Den phagocyte NADPH oksidase konverterer molekylært oksygen til superoksydanion og nedstrøms reaktive oksygen mellomprodukter (Rois). Kronisk granulomatøs sykdom (CGD) er en arvelig lidelse av NADPH oksidase preget av alvorlige bakterie-og soppinfeksjoner, og ved overdreven inflammatoriske responser.

Selv om NADPH oksidase er kritisk for nøytrofil-mediert vertsforsvar 1 - 3, er betydningen av NADPH oksidase i makrofager er ikke godt definert. Tidligere studier har vist at alveolære makrofager svelges og drepe Aspergillus sporer, mens nøytrofile hovedsakelig rettet mot hyphal scenen fem. Imidlertid har det vært motstridende results som til rollen som NADPH oksidase i makrofag til å kontrollere veksten av A. fumigatus spores 6, 7.

Målet med denne metoden var å avgrense den spesifikke rolle NADPH oksidase i makrofager i formidling host forsvar mot A. fumigatus sporer. Vi fant ut at NADPH oksidase i alveolære makrofager styrer veksten av phagocytosed A. fumigatus spores fire. Til tettest modelverts respons på inhalert sopp, brukte vi alveolære makrofager høstes av bronchoalveolar kylling fra unstimulated mus umiddelbart etter offer. Bruken av isolerte alveolære makrofager aktivert oss til å fokusere på sine soppdrepende aktivitet i fravær av andre immunceller (f.eks rekruttert nøytrofile), som beskytter mot Aspergillus in vivo. I denne fremgangsmåten, ble det alveolære makrofager farget in vivo før høsting, slik som å minimalisere mengden av etter innhøsting manipulasjon. </ P>

En annen fordel med denne protokoll er bruken av et GFP-uttrykk A. fumigatus belastning. Denne soppen uttrykker GFP fra conidial scenen gjennom hyphal scenen og har ikke behov for ytterligere misfarging. For å oppnå bilder med større detalj, valgte vi konfokal mikroskopi som muliggjør rekonstruksjon av tredimensjonale strukturer fra de oppnådde bildene. Tredimensjonal rekonstruksjon gir muligheten til å skille mellom hyfer vokser rundt stedet for i eller gjennom en makrofag. Conidia kan også være nettopp erklæres som intracellulær versus ekstracellulært.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer utført på dyr i denne studien ble godkjent av Animal Care og bruk komité ved Roswell Park Cancer Institute og overholdt alle statlige, føderale og National Institutes of Health forskrifter.

En. In vivo Macrophage Merking

Merk: PHK26 er et lipofilt fargestoff som vil bli tatt opp av fagocytiske celler i både sirkulasjon og i vev når gitt intravenøst ​​(iv). PKH26 ble benyttet for in vivo merking for å minimere mengden av etter innhøsting manipulering av makrofag. PKH-26 har fordelen av stabilt akkumuleres i alveolære makrofager løpet av lengere tidsperioder. Venter 10 dager etter administrasjon åpner for klarering av alle merkede celler fra sirkulasjon slik at bare alveolære makrofager stabilt merket med PKH26 8, 9. PKH26 er en rød fluorokrom som har eksitasjon (551 nm) og utslipp (567 nm) egenskaper kompatiblemed rodaminmolekyler eller fysoerytrin deteksjonssystemer. Enhver merking prosedyren kan introdusere gjenstand, inkludert tap av levedyktighet. Men, siden vi bruker samme metode for merking av makrofager i forskjellige muse genotyper (f.eks WT vs NADPH oksidase-mangel), effekten av disse gjenstandene ville være ensartet.

  1. Fortynne stamløsning av PKH26 (1 x 10 -3 M i etanol) 01:05 i fortynningsmiddel C gitt av produsenten.
  2. Belastnings 100 pl av fortynnet PKH26 inn i en 1/2 ml insulinsprøyte (29 g x 1/2 ") for hver mus.
  3. Administrere til mus ved iv injeksjon (enten halen blodåre eller retro orbital) minst 10 dager før høsting.

2. Høsting alveolære makrofager etter Bronchoalveolar Lavage (BAL)

Antallet mus som skal brukes for et eksperiment, kan variere. Et typisk utbytte av en unstimulated mus er i området fra 3-5 x 10 5 alveolære makrofager, men dette antallet kan variere sterkt based på faktorer slik som størrelsen på mus, opplevelsen av den som utfører lavage, og antallet instillasjoner av lavage fluid og volumet trekkes ut fra lungene. I denne protokollen lunge lavage utføres med en lukket brysthula som sammen med gjentatte 1 ml lavages bidrar til å øke celle yield.

  1. Avlive mus ved administrering av en dødelig dose av avertin bedøvelse (12,5 mg) intraperitonealt (ip) ved hjelp av aseptiske forhold for å holde løsningen sterilt.
  2. Spray mus grundig med 70% etanol.
  3. Fjern skinnet fra kranie slutten av dyr utsette thorax (figur 1A).
    1. Lag et lite snitt i huden rett under mellomgulvet.
    2. Sett fingeren inn i skjæret og dra huden vekk fra kranie enden av dyret (figur 1A).
    3. Skyv opp litt på hodet, utvide ventral side av halsen (figur 1A).
  4. Klipp et lite hull gjennom brystkasseninn i den høyre side av brystkassen til å slippe ut luften i lungene og også tillate visualisering av lungene under de etterfølgende trinn.
  5. Finn luftrøret, og nøye dissekere bort omkringliggende vev.
    1. Fjern spyttkjertler, sternohyoid muskler og strupehode, osv. med buede tang.
    2. Løft forsiktig med en buet tang og skjære bort med saks den tynne vevet som dekker luftrøret (adventitia) avslører den underliggende ringmerket brusk struktur.
  6. Sett kateter inn luftrøret.
    1. Ved hjelp av buede tang, plassere en sutur bak (rygg til) luftrøret og trekke en 10 cm lengde gjennom åpningen.
    2. Starter ovenfor cricoid (den tykkere ring av brusk) forsiktig etter en 22 G kateter ned i luftrøret stoppe der luftrøret forsvinner bak brystbenet.
    3. Fast knytte sutur rundt luftrør og kateter for en tettsittende passform. Fjern nålen fra kateteret.
  7. Monter 4-veis stoppekran.
    1. Fyllen 6 ml sprøyte med DPBS, 1% FBS og feste til 4-veis stoppekran som vist i figur 1B.
    2. Fest en tom 6 ml sprøyte på angitt posisjon på 4-veis stoppekran (Figur 1B).
    3. Fest åpen port på 4-veis stoppekran til kateter (Figur 1B). Vær nøye med å ikke løsne kateter fra luftrøret.
  8. Samle lavage væske fra lungene.
    Merk: Undersøkere kan velge å bruke lavere mengder lavage fluid for å minimalisere muligheten for skade på vevet. Det er viktig at den samme metode bli benyttet på samme måte i alle musegrupper.
    1. Vri håndtaket på vannkranen så den tomme sprøyten lukkes og sakte injisere ~ 1 ml DPBS, 1% FBS å blåse luft i lungene. Observer lunge inflasjon gjennom hullet kutt i trinn 2.4.
    2. Vær forsiktig med å overinflate lungene.
    3. Vri håndtaket på vannkranen, slik at den fulle sprøyten lukkes, og trekke seg nøye influensa id fra lungene.
    4. Observer lungene tømmes for luft gjennom hull i trinn 1.4. Kateteret kan trenge å bli flyttet litt tilbake eller tilbake for å få en god trekning. Ta spesielle forholdsregler for å holde kateteret i luftrøret.
    5. Gjenta trinn 2.8.1-2.8.4 5-6x inntil alle DPBS, 1% FBS har blitt injisert og trukket tilbake fra lungene. Merk: gjenoppretting av lungefluid vil ikke være 100% av injisert fluid.
  9. Tomme sprøyten med lavage fluid inn i et 50 ml konisk rør. Holde-celler ved romtemperatur.
  10. Pellet-celler ved sentrifugering ved 300 xg i 5 min ved romtemperatur og hell av supernatanten. Dette kan lagres for cytokin analyse hvis ønskelig.
  11. Suspender cellene i 1-5 ml RPMI 1640 med 10% FBS og telle på en hemocytometer. I det ustimulerte mus, er> 95% av cellene høstet ved BAL forventet å være makrofager, noe som kan bekreftes ved cytologi.

Tre. Dyrking og høsting Fungus

"> The Aspergillus fumigatus brukes i denne protokollen uttrykker GFP gjennom alle faser av sin livssyklus:. Sporer, germlings og hyfer Denne sopp belastningen ble gitt av Dr. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada.

  1. Plate conidia av en Aspergillus fumigatus stamme som uttrykker GFP på Sabouraud hjerne hjerte infusjon (BHI) agar skråkulturer med kloramfenikol (0.05 g / L) og Gentamicin (0,5 g / L).
  2. Inkuber i mørket løst avkortet i 7 til 10 dager ved romtemperatur.
  3. Innhøstings conidia ved vasking skrå med 10 ml 0,01% Tween 20 i DPBS. Lett skrape soppen med stripette å løsne. Skyll skrå flere ganger for å øke utbyttet.
  4. Passerer conidial suspensjonen gjennom en 100 mikrometer celle sil inn i en 50 ml konisk.
  5. Pellet conidia ved sentrifugering ved 400 xg i 10 min.
  6. Resuspender conidia i 50 ml DPBS og telle ved hjelp av en hemocytometer.
  7. Vask to ganger med DPBS og fortynne til ønskede konsentrasjonnen.

4. Fungal Challenge og konfokalmikroskopi

For å undersøke rollen til makrofag NADPH oksidase i vertsforsvaret, ble evnen av isolerte alveolare makrofager fra mus av tre genotyper for å kontrollere veksten av Aspergillus phagocytosed sporer evaluert. De genotyper brukt i denne studien omfatter; 1) villtype mus, 2) NCF1 * / * Mn-mus med en naturlig forekommende NCF1 mutasjon (NCF1 koder for P47 phox, en nødvendig komponent i phagocyte NADPH oksidase) forlater dem NADPH oksidase mangelfull, og 3) NCF1 * / * Mn + transgene mus (MN betegner transgenet husing villtype NCF1 under kontroll av human CD68-promoteren) der NADPH oksidase-aktivitet har blitt rekonstituert i monocytt / makrofag-populasjonen 10, 11.

Konfokal mikroskopi er best egnet for denne analysen på grunn av tilstedeværelsenog vekst av ikke-phagocytosed conidia på lysbildene. Den konfokal mikroskop vil muliggjøre visualisering av individuelle fly innenfor Z-aksen, og muliggjøre differensiering mellom sopp vokser rundt i stedet for inne i makrofag. Alle confocal bilder er anskaffet ved hjelp av en 63X oljeneddyppingsobjektivet linse. Z-stabler er anskaffet med en elektronisk zoom faktor på 2,5. Tykkelsen av en Z-stabelen er bestemt ved bruk av DAPI og lyse feltbilder for å lokalisere toppen og bunnen av banen. Z-stabler varierte 14-24 mikrometer med individuelle skiver ~ 1 mikrometer tykke. For kvantifisering av makrofager, ble enkelt skanninger av 1X elektronisk zoom utført på 10 felt per genotype. Intakte makrofager ble identifisert basert på henholdsvis PKH26 og DAPI farging av membranen og kjernen. Ble identifisert conidia basert på FITC uttrykk og lyse felt image.

  1. Forbered sterile dekkglass og plater
    1. Under et biologisk sikkerhetskabinett, suge 22 x 22 mm glass Dekk i 70% etanol for 5-10 min.
    2. Skyll Dekk i sterile PBS.
    3. Ved hjelp av sterile pinsetter, forsiktig plassere et enkelt dekkglass i bunnen av hver brønn i en steril enkeltvis pakket 6-brønns plate.
  2. Seed ~ 1 x 10 6 høstet PKH26 merket alveolære makrofager suspendert i 300 mL RPMI 1640, 10% FBS på hver dekkglass. Det nøyaktige antallet kan variere avhengig av innhøstingen yield.
  3. Tillat makrofag til å følge ved inkubering ved 37 ° C med 5% CO2 over natten.
  4. Følgende morgen, legge ~ 1 x 10 7 GFP-uttrykke A. fumigatus conidia suspendert i 100 pl forvarmede (37 ° C) RPMI 1640, 10% FBS.
  5. Returner platen til 37 ° C inkubator med 5% CO2.
  6. Cellene bør være fast i minst to timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C. Ved 3, 7 og 14 hr reparasjonsceller ved å tilsette et like stort volum av 2% formaldehyd til hver brønn (sluttkonsentrasjon 1% formaldehyd). Plasser Plater tiltidlige tidspunkter ved 4 ° C over natten. For det siste tidspunkt (14 timer), fikse-celler ved romtemperatur i 2 timer.
  7. Etter fiksering, forsiktig fjerne Dekk bruker pinsett og skyll i DPBS.
  8. Fjern overflødig væske ved å plassere kanten av dekkglass på en brettet Kimwipe.
  9. Påfør 6 mL fluorescens monteringsmedium med DAPI til et glass objektglass.
  10. Legg den ene kanten av dekkglass på lysbildet og forsiktig slippe med celle side ned i monteringsmedium. Montering medium vil spre seg og danne et jevnt lag under dekkglass. Det er ikke nødvendig å trykke på dekkglass.
  11. Forsegle kantene av dekkglass med klar neglelakk og la det lufttørke.
  12. Oppbevares forberedt lysbilder i en lysbilde boks (beskyttet mot lys) ved romtemperatur før du er klar til å analysere ved konfokalmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Samle alveolære makrofager etter BAL fra ustimulerte mus vil resultere i en> 95% ren populasjon basert på cytologi. Den 3 og 7 timer (figur 2) tidspunkt forut for hyphal stadium av soppvekst, og gi rom for en sammenligning av fagocytisk effektiviteten av conidia blant genotyper. Den 14-timers tidspunktet er der genotyper kan sammenlignes med hensyn til evnen til å hemme overgangen av phagocytosed conidia på vev-invasiv hyphal trinn (figur 3). Intakt makrofag kan identifiseres ved konfokal mikroskopi basert på PKH26 og DAPI farging av membranen og kjernen, henholdsvis (fig. 2 og 3). Konidier, og hyfene er identifisert basert på GFP ekspresjon (Fig. 2 og 3).

iles/ftp_upload/51678/51678fig1.jpg "/>
Figur 1. Anatomisk Retnings Referanser og 4-veis stoppekran. A) De anatomiske retnings referanser for en mus er vist. Cranial er i retning av hodet, mens hale er i retning av halen. Den ventrale side av en quadruped vender mot magen eller den nedre overflaten av dyret, mens den dorsale side, sett mot baksiden eller den øvre overflaten av dyret. B) 4-veis stoppekran har tre luer-forbindelser, og et håndtak som roterer 360 ° for å lede strømmen av fluider gjennom stoppekranen. Plassering av den tomme sprøyte hele sprøyten og kateteret er indikert. for å vise større bilde.

Fig. 2 Figur 2. Fagocytose av A. fumigatus sporer er lik mellom genotyper på 7 hr. å vurdere muligheten av isolerte alveolære makrofager med NADPH oksidase aktivitet for å begrense veksten av phagocytosed conidia, (A) vill-type, (B) NCF1 * / * Mn +, og (C ) NCF1 * / * Mn - mus ble administrert iv PKH26. Alveolære makrofager ble høstet ved BAL 10 dager senere og sådd med conidia av GFP-uttrykke A. fumigatus. Cellene ble fiksert ved 3, 7 og 14 timer etter tilsetning av conidia. Ved 3 (data ikke vist), og 7 timer både det totale antallet makrofager og makrofag med ≥ en phagocytosed conidia (piler) var lik blant de tre genotyper, som reflekterer lignende fagocytose effektivitet. Intakte makrofager blir identifisert basert på PKH26 (rød) og DAPI (blå) farging av membran ennd kjerner hhv. Fluorescens bildene fra en enkelt Z-planet er kledde med lyse felt image. Den lyse feltbildet består av lys som overføres gjennom hele prøven, og slik at når overlagret på det fluorescerende Z-ren tillater visualisering av celler og conidia innenfor hele Z-stabelen. Scale bar, 19 mikrometer. Klikk her for å se større bilde.

Figur 3
Fig. 3. Macrophage NADPH oksidase er nødvendig for å kontrollere veksten av A. . fumigatus sporer Konfokalmikroskopi av (A, D) wild-type, (B, E) NCF1 * / * Mn +, og (C, F) NCF1 * / * Mn - < / Sup> alveolære makrofager i 14 timer etter seeding med GFP + A. fumigatus conidia. Intakte makrofager er identifisert basert på PKH26 (rød) og DAPI (blå) fargingen av membraner og kjerner, respektivt. Solid piler viser intakte makrofager med minst en fagocytterte conidia og hule pilene peker på hyfer. Mange ams med minst en phagocytosed conidia ble observert med villtype og NCF1 * / * Mn + celler, men ikke med NADPH oksidase-mangel celler. GFP-signal i hyfer ble variabel basert på planet til z-stablet bildet vist. AC) Fluorescens bilder fra en enkelt Z-planet med den lyse feltbildet mulig visualisering av celler og hyfer innenfor hele Z-stabel. DF) Fluorescens-bilder fra en enkelt Z-planet uten at lyse felt bakgrunn muliggjøre identifisering av celler, men ikke det romlige forhold mellom celler og sopp i forskjellige Z-plan. Scale bar, 19 mikrometer..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved hjelp av denne metode for ex vivo analyse av antifungal aktivitet av makrofager sammen med in vivo sopp utfordring, vi tidligere demonstrert at NADPH oksidase i makrofager spiller en viktig rolle i forsvaret mot A. fumigatus fire. Bruken av isolerte alveolære makrofager gjør oss i stand til å fokusere på sine soppdrepende aktivitet i fravær av andre immunceller (f.eks rekruttert nøytrofile), som beskytter mot Aspergillus in vivo.

Forskjellige visualiserings strategier har blitt brukt til å evaluere macrophage antifungal aktivitet in vivo og ex vivo. Luther et al., Brukte konfokalmikroskopi å studere fagocytose av Aspergillus conidia av menneskelig (høstet fra lungetransplantasjon mottakere) og mus AMS 12. Geunes-Boyer et al. preget samspillet mellom Candida krusei og murine makrofager etter fagocytose. Deanvendes en makrofag cellelinje, RAW264.7 og primær makrofag fra peritoneum 13. Garcia-Rodas et al. viste at det overflateaktive middel protein-D binder seg til og letter fagocytose og overlevelse av Cryptococcus neoformans 14. SP-D binding ble også undersøkt in vivo ved hjelp av SP-D - / - mus intranasalt inokulert med Alexa Fluor 488-merket C. neoformans. Etter lunge lavage, ble AMS immunofluorescently merket og konfokalmikroskopi ble brukt til å analysere fagocytose.

Makrofager fra ulike anatomiske områder (f.eks alveolar, milten, peritoneal), generert med ulike stimuli (f.eks thioglycollate elicitation eller in vitro differensiering), eller fra cellelinjer (f.eks, RAW264.7) kan ha dramatisk forskjellige antimikrobielle og inflammatoriske responser 15 - 18. Derfor, for å i størst mulig grad å modellere vertsrespons til inhalert funGI, brukte vi alveolære makrofager høstes av bronchoalveolar kylling fra unstimulated mus umiddelbart etter offer.

Utgangspunktet vi brukte live-cell imaging å evaluere makrofag antifungal aktivitet fire. Alveolær makrofag ble belagt i kamret glassplater deretter sådd med GFP uttrykke Aspergillus. Etter tre timer ble non-fagocytterte conidia fjernes ved forsiktig vask for å tillate uhindret visualisering av phagocytosed conidia. Conidial spiring ble deretter overvåket av time-lapse bildebehandling på 30 min intervaller ved hjelp av sterke bilder for å visualisere makrofager og GFP fluorescens å visualisere sopp. Denne metoden har den fordelen av å anskaffe sekvensielle bilder av det samme primære cellekultur. Imidlertid kan tendensen til makrofag migrere over synsfeltet i løpet av anskaffelses tillatt for en kvalitativ enn en kvantitativ vurdering av conidiocidal aktivitet. En annen ulempe med levende celler avbildning er tHan uklarhet og detaljer som celler bevege seg inn og ut av planet av fokus.

For å oppnå bilder med større detalj vi valgte konfokal mikroskopi som muliggjør rekonstruksjon av tredimensjonale strukturer fra de oppnådde bildene. Tredimensjonal rekonstruksjon gir muligheten til å skille mellom hyfer vokser rundt stedet for i eller gjennom en makrofag. Med denne muligheten til å vise at cellene og sopp i tre dimensjoner, er fjerning av ikke-phagocytosed conidia i 3 timer ikke lenger er et nødvendig trinn. Conidia kan også være nettopp erklæres som intracellulær versus ekstracellulært.

For forbedret visualisering, ble alveolære makrofager merket in vivo med PKH26. Det fluorescerende fargestoff har en lang alifatisk hale som stabilt inkorporerer inn i lipid regioner av cellemembraner. Etter intravenøs injeksjon blir denne lipofilt fargestoff tatt opp av fagocytiske celler både i blodet og i vevet. Etter 10 dager, labeledet fagocytter er fjernet fra murine sirkulasjon og forbli bare i vev 9, noe som åpner for innsamling av allerede merket alveolar makrofag etter BAL. Med bruk av in vivo merking, etter slakting manipulering av alveolære makrofager er minimert.

En annen fordel med denne protokoll er bruken av et GFP-uttrykk A. fumigatus belastning. Denne soppen uttrykker GFP fra conidial scenen gjennom hyphal scenen og har ikke behov for ytterligere misfarging. Med dobbel farging av makrofager og Aspergillus, er vi i stand til å identifisere phagocytosed conidia.

En begrensende faktor i denne protokollen er makrofag utbytte fra BAL. Et typisk utbytte av en unstimulated mus er i området fra 3-5 x 10 5 alveolære makrofager, men dette antallet kan variere sterkt, avhengig av faktorer slik som størrelsen på mus, opplevelsen av den som utfører lavage, og antallet instillasjoner av lavage influensaid og volumet trekkes ut fra lungene. I denne protokollen, er lunge lavage utført med en lukket brysthulen som sammen med gjentatt 1 ml instillasjoner bidrar til å øke celle utbytte sammenlignet med en åpen brysthulen og færre instillasjoner. Muse tall kan også økes for å øke slakteutbytte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Allergy and Infectious Disease Grant R01AI079253 (til BHS), og av National Cancer Institute Cancer Center Support Grant CA016056 til Roswell Park Cancer Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol Sigma T48402 Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol Sigma A-1685 Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning 21-031-CV
NH4Cl Sigma A0171 Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3 Sigma P91444 Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA Sigma E6758 Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter BD 381523 Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock Fisher Scientific 50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 heat inactivated
Hema 3 Stain Set Fisher Scientific 22-122-911
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants BD 297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers BD Falcon 64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge Thermo Scientific
Cell culture incubator 37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass VWR 48366-227 glass coverslips
6-well Cell culture plates Corning 3506
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
  2. Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
  3. Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
  4. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
  5. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
  6. Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
  7. Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
  8. Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
  9. Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
  10. Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
  11. Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
  12. Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
  13. Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
  14. García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
  15. Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
  16. Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
  17. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
  18. Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics