代谢率的测量

Biology

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Summary

代谢紊乱都属于在人体中的最常见的疾病之一。该基因听话的模式生物D.果蝇可用于鉴定调节代谢的新基因。本文介绍一种比较简单的方法,它允许通过测量它们的CO 2的生产研究代谢率的苍蝇。

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Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. J. Vis. Exp. (88), e51681, doi:10.3791/51681 (2014).

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Abstract

代谢紊乱是一个常见的​​问题影响到人类的健康。因此,了解调节新陈代谢机制是一个重要的科学任务。在人类许多疾病的致病基因有一只苍蝇同源,使果蝇的研究涉及不同疾病的发展信号通路的良好模型。此外, 果蝇的可追踪性简化了遗传筛选确定了可调节新陈代谢新的治疗靶点提供帮助。为了执行这样一个屏幕的简单和快速的方法,以确定变化苍蝇的代谢状态是必要的。在一般情况下,二氧化碳是生产的底物氧化和能量消耗,提供约代谢状态的信息的良好指标。在这个协议中,我们介绍一个简单的方法来测量从苍蝇的CO 2的输出。该技术可以潜在地有助于影响代谢率的遗传扰动的识别。

Introduction

生化的Kreb的周期产生的ATP通过乙从碳水化合物,脂肪,以及产生CO 2的蛋白衍生的氧化。在果蝇中 ,O 2的输入是直接相关的CO 2输出,并反映代谢1的电平。因此,CO 2输出的测量已成功应用于涉及到老龄化和新陈代谢2-5的研究。在这里,我们的实验室已修改先前设计的实验装置,使CO 2的产量可达18样品中,而不需要任何专门的设备测量。其他和我们先前已经用这种方法来显示代谢率有缺陷的肌营养不良症相关蛋白,Dystroglycan基因(DG)6-8差异苍蝇。

O用于氧化代谢2转化成CO 2,这是因为排出的呼吸废物。营建管理手工制作的呼吸计化描述,它允许对O 2的消耗速率的测定。苍蝇被放置在一个密闭容器内利用吸收排出的CO 2的物质,从气相有效消除它。在气体体积(减小压力)的变化是由流体的附着在封闭式呼吸的玻璃毛细管的位移测量。

这种技术比其他的主要优点是成本。以前的研究已经测量的CO 2产量果蝇使用气体分析仪及技术先进的呼吸测量系统1,9。尽管更复杂的设备,在这里所描述的方法的灵敏度是类似于报告的值( 表1)。此外,其他几个小组已经使用这种技术的变化,以确定相对代谢率在果蝇 4-6。因此,该测定法可以用来生成reliab乐,有关果蝇的代谢没有购买专门设备,可以设定在任何实验室,可用于教育目的重复性的数据。

一般而言,接受的技术,以确定生物体的新陈代谢是测量CO 2的生产时,O 2消耗,或两者3,4,9。不过,它可以假定1当量的O 2产生1当量的CO 2,CO 2的精确率,生成依赖的代谢底物利用10上。因此,为了准确地确定代谢率在能量单位,有必要同时测量O 2的消耗和CO 2的产生。由于这个原因,这里描述的方法是特别相关的比较,在动物中,而不是绝对值之间的CO 2产量的差异。我们的技术集成了多种动物的CO 2生产过一段恬E(1-2小时),因此返回的平均动物的活动。如果有理由相信,本实验的动物比对照动物少活性的测定可以反映不同水平的活性,而不一定代谢。

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Protocol

呼吸计1。准备

  1. 削减1,000微升枪头,用刀片,允许插入50微升毛细管微量的,试图让枪头尽量伸直。
  2. 将一块泡沫进入吸管和推下来的枪头。
  3. 加入少量的CO 2吸收剂的和由第二片泡沫的包含它。
  4. 在其中微量插入移液管尖端的地方涂上胶水。
  5. 离开呼吸过夜,让胶水干。
    一个呼吸的原理图如图1A所示。

2,准备测量室

  1. 通过将水与曙红中的比例,这将导致明显的着色制备腔室的溶液。
  2. 倒入曙红/水溶液进入腔室。
  3. 标签的腔室的侧面中的一个具有厘米级。

  1. 标记用标记的个体呼吸计。
  2. 用另一种方法为CO 2,并放置3-5蝇每个呼吸中所期望的基因型的麻醉苍蝇。
  3. 用橡皮泥腻子封住呼吸计紧紧顶部。
  4. 让苍蝇从麻醉中恢复约15分钟。
  5. 制备1呼吸无蝇,这将被用作大气控制。

4,执行实验

  1. 通过将1.5毫升的Eppendorf管夹持器是在顶部和底部处的腔室的顶部开挂呼吸计在腔室中。
  2. 插入呼吸计用微量移液器尖端向下进入腔使笔尖浸入到有色溶液。
  3. 加入凡士林盖中盖和室之间由温度和压力fluct提供更强的隔离uations。
  4. 盖上盖子,并允许在系统中平衡15分钟。
  5. 取室的照片确保液体的每个微管内的电平是可见的,所以是尺度(参见例如在图1B中示出)。
  6. 经过1-2小时,拍摄另一张照片。
  7. 当实验结束后,从呼吸计中删除苍蝇和权衡,如果需要或必要时进一步将他们转移回瓶中。

5,分析结果

  1. 公开收购使用ImageJ软件11的图像。
  2. 在每张照片使用规模,在软件中设置的像素缩放。
  3. 测量距离率(Dd),液体从一开始(D1)拍摄的图像一个确定的参考点和旅游实验结束(D2)。示意图例示于图1C中
  4. 计算所产生的CO 2(微升/小时/飞)与式量:

图1

以厘米为单位R =半径微量管
ΔD=距离的液体向上移动在测试样品中测得厘米的微
ΔC=距离的液体向上移动的阴性对照样品的微管(无蝇)
苍蝇使用n =数
h =小时

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Representative Results

为了证明该方法是我们测量的CO 2产量从野生型( 俄勒冈州R)的雄蝇在18,25,和29°C和苍蝇突变为危险品敏感。苍蝇提出了在25℃,然后转移到实验温度连续5天前测量。如预期此变温动物物种,CO 2的生成量随温度的升高( 图2)。我们已经在过去表明,无糖饮食降低了野生型的代谢率和DG突变果蝇7。 DG的损失导致增加新陈代谢水平( 图2)。

图1
图1:设置为CO 2的生产苍蝇测量。A.示意图显示吨他建造个人呼吸的。B. 二氧化碳测量过程中室的照片。字母标记呼吸计的位置。垂直数字表示刻度以厘米为单位。C.示意图示出在实验过程中的变化。绿线表示的参考点(D1),蓝色表示2小时(D2)后的液体的最终位置。 ΔD是液体中的微量已行进的距离。

图2
图2的CO 2生产中的苍蝇在不同温度和DG的突变体。房屋正温度与CO 2的生产在果蝇关联并在DG的突变体被显著增加。误差棒表示SEM从四个独立的实验,,*** P≤0.01。

(μL/飞×时间) 二手设备参考
2-3 CO 2 CO 2气体分析仪 (范Voorhies,Khazaeli 等人,2004)
4.68±1.04的CO 2 二氧化碳呼吸计量系统 (Khazaeli,凡Voorhies 等人,2005)
2.9-6.2 O 2 同样设计的呼吸计 (赫伯特,Clancy 等人 ,2004)
2.20±0.15 O 2 这里描述的手工制作的呼吸计 (Kucherenko,Marrone 等,2011)
*表中的值是从该研究报告的苍蝇,在25℃下测定的数值

表1的比较用于测量二氧化碳产量的果蝇不同的技术。

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Discussion

在这个协议中,我们描述了一种廉价,可靠的方法,用于测量CO 2的生产中的苍蝇。我们发现,这个实验是容易的,能够快速进行,并产生可再现的数据是在与其他研究1,6,9协议。这里列出的协议,可以很容易地修改,以适应任何实验室的预算和可用的材料。每个个体呼吸的结构可以只要该室保持气密进行调整。然而,更长,更薄微量提供比短的更精确。只要没有显著环境温度和压力的变化,危及该实验中使用的外部腔室可以是可选的。这可以通过与阴性对照和内生物样品测量的大变异性的分析来确定。另外,在CO 2吸收剂可以是任何种类的,只要它是无毒的F在于( 例如 ,氢氧化钾)。这是最重要的有一个阴性对照,以确保技术工作正常。最常见的问题是为呼吸不被完全密封。如果是这样的话,那么测量将是相媲美,阴性对照。可能出现由于苍蝇还没有来得及从麻醉中恢复或已经灭亡了额外的问题。

在这个协议中最关键的一步是呼吸的建筑。如上面所指出的,呼吸必须气密。微量的,以较大的移液室中的附件必须用正确的胶来完成。更橡胶状粘合剂的效果最好。所以建议检查在显微镜下呼吸计,观察胶合结构中的任何妥协结束后。此外,呼吸后苍蝇已放置里面的密封是非常重要的。使用的腻子ħ如已发现的工作最好,不常出现故障。石蜡已经发现工作得不好,应该避免。用于测量气体体积的液体也很重要,并应测压。因此,水是最好的选择。使用油墨不建议,因为它可以在毛细血管硬化,使呼吸没用。同样重要的是,不使用音响的女性,因为我们注意到,他们的CO 2的生产会有很大变化。此外苍蝇的年龄是重要的,因此该比较苍蝇应该是相同的年龄。在我们的测试中,我们用了5天之久的男性。苍蝇的遗传背景也很重要。时相比,突变体对照苍蝇应该是相同的遗传背景。该数据也可以通过测量苍蝇的质量进行测定,如果有在苍蝇的大小显著差异后呈现为(微升/小时/毫克)。在我们的手中,一个野生型飞重0.80±0.11毫克(N = 180)。还应该指出,在实验过程中定时,获得了平均代谢率的值。我们还发现,有可能测量单个飞,但我们使用3-5蝇达到最高的精度。在呼吸苍蝇可用空间是足够的,他们不觉得拥挤,但在同一时间,他们没有足够的空间走集约:所以有缺陷的趋地性应该不会对CO 2的生产水平没有任何影响。

苍蝇早已被确定为主要的模式生物,研究对涉及发育生物学,细胞生物学,神经生物学和人类疾病之一。最近的一些研究表明,果蝇可以很容易地用于研究能量平衡,以及(在12,13审查)。这里提出的方法可以很容易地用在遗传筛选,以确定可能参与控制我的新分子成分tabolic国家购买更准确,更昂贵的设备前。到目前为止,大多数这样的屏幕均只进行细胞培养,表明更先进的研究是必要的。

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Disclosures

我们什么都没有透露。

Acknowledgments

我们要感谢德国马普学会为我们的研究提供资金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes VWR 612-1413
Soda Lime Wako CDN6847
Eosine  Sigma 031M4359 Any dye that can create visible colorization of liquid can be used
Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber VWR 21432-761 Any transparent glass chamber that can be closed with the lid
Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit Flinn FB1438
Power Gel Glue Pritt
1 ml pipett tips Any
Foam Any
Plaesticine Putty Any
Scalpel Any
Tweezers Any

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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