अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए संग्रह और लार के डीएनए निष्कर्षण

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Goode, M. R., Cheong, S. Y., Li, N., Ray, W. C., Bartlett, C. W. Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (90), e51697, doi:10.3791/51697 (2014).

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Abstract

Introduction

मानव आनुवंशिक अध्ययन के लिए उच्च गुणवत्ता डीएनए प्राप्त रोग जीन की खोज की प्रक्रिया में आवश्यक है. रक्त, लार संग्रह से अधिक महंगा होने के भी एक आक्रामक प्रक्रिया की आवश्यकता होती है और हालांकि, कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक अनंत डीएनए के स्रोत, या IPSCs के रूप में अमर सेल लाइनों बनाने के लिए इष्ट है, और सेल लाइनों उपलब्ध नहीं हैं कभी कभी जब रक्त डीएनए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, रक्त प्राप्त करने के लिए एक प्रशिक्षित phlebotomist की आवश्यकता है और रक्त लार 1 से एक कम आधा जीवन है. इसे एकत्र और इस तरह अच्छी तरह से अस्पतालों और प्रयोगशालाओं 2 के जलग्रहण क्षेत्र से परे संभावित विषय पूल में वृद्धि, एक phlebotomist के लिए आवश्यकता के बिना मेल के माध्यम से भेजा जा सकता है के बाद से लार से डीएनए प्राप्त करने के लिए कम खर्चीला और आसान है. विषयों के बजाय खून 3, 4 के लार का नमूना देने का विकल्प होता है जब अध्ययन नामांकन में सुधार किया जा सकता है. मात्रा और लार से डीएनए की गुणवत्ता के बारे में चिंताएं हमें इसके व्यापक सीमित हो सकता हैलार 2, 3, 4, 5 के महत्वपूर्ण मात्रा में प्राप्त नहीं किया था कि पुराने मुख swabs तरीकों पर डीएनए परीक्षण के लिए मिली लीटर प्रति 4.3 x 10 5 कोशिकाओं के एक औसत के साथ, पूरे लार की उपयुक्तता दिखा कई अध्ययनों से हाल ही के अध्ययन के बावजूद ई, 6. एक मामूली साहित्य माइक्रोएरे आधारित विधियों 8, सहित जीनोटाइपिंग अनुप्रयोगों के लिए पूरे लार व्युत्पन्न डीएनए की उपयुक्तता दिखा मौजूद है जबकि 9, 10, कोई पढ़ाई की जांच की है अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS). इस पूरे लार डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए लक्ष्य को आसानी से आम अभिकर्मकों और उपभोग्य साथ प्रयोगशालाओं में कार्यान्वित किया जाता है कि एक लागत प्रभावी तरीके से आनुवंशिकी अनुप्रयोगों के लिए मात्रा और गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए किया गया था.

लार से डीएनए निष्कर्षण कई प्रक्रियाओं की आवश्यकता है: 1) संग्रह और भंडारण, 2) सेल, 3) RNase उपचार, 4) प्रोटीन वर्षा, 5) इथेनॉल वर्षा, 6) डीएनए पुनर्जलीकरण. वर्णित डीएनए स्थिरीकरण बफर समाधान,पहले 2, पर्याप्त रूप से परिवर्तन के बिना काम करता है. RNase उपचार और डीएनए पुनर्जलीकरण कदम अनुकूलन करने के लिए कोई प्रयास नहीं किया गया था. प्रत्येक शेष कदम के लिए, उपज प्रभावित हो सकता है कि कई चर की पहचान की गई. प्रत्येक चर व्यक्तिगत रूप से चालाकी से किया गया था और उपज और गुणवत्ता में सुधार के लिए सांख्यिकीय मूल्यांकन किया गया था. उपज और / या डीएनए की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए दिखाया गया है कि चर के लिए, इष्टतम मूल्यों अंतिम प्रोटोकॉल में शामिल थे.

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Protocol

नोट: पहले लार के नमूने उपलब्ध कराने के लिए सभी विषयों राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में मानव विषयों के उपचार के लिए दिशा निर्देशों के अनुरूप सहमति सूचित दिया.

1 लार संग्रह और भंडारण

  1. लार संग्रह से पहले, इस विषय के मुंह विषय पानी के साथ अपने मुँह कुल्ला होने और खाने से परहेज या नमूना इकट्ठा करने से पहले 30 मिनट के लिए पीने से भोजन या अन्य विदेशी तत्वों से मुक्त है कि यह सुनिश्चित करें.
  2. टोपी या ट्यूब के अंदर छू से बचने के लिए सुनिश्चित करते हुए डीएनए स्थिरीकरण बफर 2 की 2.5 मिलीलीटर के साथ एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब खुला, और विषय बफर समाधान में लार के 2.5 मिलीलीटर थूक है. नोट: लार का अधिक से अधिक 2.5 मिलीलीटर एकत्रित डीएनए स्थिरीकरण बफर के लिए नमूने के एक अपर्याप्त अनुपात से नमूना गिरावट हो सकती है. बहुत कम लार एकत्रित प्रोटोकॉल से उम्मीद की पैदावार कम हो जाएगा. संग्रह संस्करणों का मूल्यांकन करने के लिए, टी की तरफ गिने ढ़ाल का उपयोगवह ट्यूब.
  3. टोपी की जगह और मिश्रण homogenized है जब तक उलटा द्वारा मिश्रण. जोरदार झटकों के लिए आवश्यक नहीं है. अल्पकालिक भंडारण या लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (> 3 महीने) के लिए आरटी पर नमूनों की दुकान.

2 प्रारंभिक तैयारी और सेल

  1. पहले निकासी शुरू करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान गर्मी, और एक बर्फ बाल्टी तैयार करते हैं. तीन 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब प्रत्येक निकाले नमूना के लिए आवश्यक हो जाएगा. तीन ट्यूब सेल और प्रोटीन गोली, अंतिम निकाले gDNA, और isopropanol और इथेनॉल supernatants पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  2. 15 सेकंड के लिए तो मध्यम गति से भंवर भंडारण से नमूने, और पलटना नमूने कई बार निकालते हैं.
  3. एक साफ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में नमूना की 2.5 एमएल बांटना, और सेल समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें. उलटा द्वारा नमूना 50 बार मिक्स, और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.

3 शाही सेना हटाना

  1. RNase एक प के 40 μl जोड़ें100 मिलीग्राम / एमएल पर ution, और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  2. 3 मिनट के लिए बर्फ पर 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान से नमूना निकालें और शांत.
    1. RNase एक ऊष्मायन के बाद, प्रोटोकॉल के डीएनए पुनर्जलीकरण चरण के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के तापमान में वृद्धि.

4 प्रोटीन और लिपिड निकालना

  1. , एमएल / 20 मिलीग्राम पर proteinase कश्मीर समाधान के 50 μl जोड़ें उलटा द्वारा कई बार मिश्रण, और 30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए आरटी पर सेते हैं. नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए एक संभावित रोक बिंदु है. निष्कर्षण पूरा किया जा सकता जब तक proteinase कश्मीर समाधान के अलावा, के बाद नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. अप करने के लिए 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण निकासी पैदावार या डीएनए की गुणवत्ता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव है दिखाया नहीं गया था. इस स्तर पर लंबे समय तक भंडारण का मूल्यांकन नहीं किया गया है.
  2. 10 मिनट के लिए बर्फ पर 20 उच्च गति पर सेकंड, और जगह के लिए सख्ती, भंवर प्रोटीन वर्षा समाधान के 1.7 मिलीलीटर जोड़ें. नमूने 3000 XG पर 10 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट, अपकेंद्रित्र के लिए बर्फ पर ठंडा है. उपजी प्रोटीन एक तंग गोली जारी रखने के लिए फार्म चाहिए. गोली तंग नहीं है या समाधान अभी भी बादल छाए रहेंगे, तो नमूने अधिक 5 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा किया जा सकता है और centrifugation दोहराया. नमूने एक तंग गोली सुनिश्चित करने के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए.

5 अलगाव और gDNA का शोधन

  1. एक साफ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में, pipet isopropanol के 5 मिलीग्राम और 20 मिलीग्राम / एमएल में शुद्ध ग्लाइकोजन समाधान के 8 μl.
  2. उपजी प्रोटीन गोली पीछे छोड़ने, isopropanol और ग्लाइकोजन समाधान युक्त ट्यूब में कदम 4.3 से gDNA युक्त सतह पर तैरनेवाला डालो. सतह पर तैरनेवाला जोड़े जाने के बाद, धीरे 3000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूना उलटा और अपकेंद्रित्र द्वारा 50 बार मिश्रण.
  3. एक साफ 15 मिलीलीटर ट्यूब में धीरे धीरे सतह पर तैरनेवाला डालो. सतह पर तैरनेवाला को हटाने के बाद, 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के लिए जोड़कई बार धीरे से कमाल की है और धीरे उपजी गोली से अधिक इथेनॉल ले जाकर गोली धोने. ट्यूब में इथेनॉल को बनाये रखें.
  4. प्रारंभिक धोने के बाद, 2,000 XG पर 1 मिनट और 20 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूना अपकेंद्रित्र. इस centrifugation कदम 4 डिग्री सेल्सियस या 20 डिग्री सेल्सियस या तो किया जा सकता है. तापमान का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव इस कदम के लिए दिखाया गया है.
  5. गोली की प्रारंभिक धोने और centrifugation के बाद धीरे धीरे ट्यूब से इथेनॉल धो डालना और त्यागने, तो चरणों 5.3 और 5.4 दोहरा द्वारा एक दूसरे धोने प्रदर्शन करते हैं.
  6. दूसरे धोने से सतह पर तैरनेवाला को हटाने के बाद, 15 मिनट के लिए शुष्क हवा को गोली अनुमति देते हैं.
    1. नमूना पूरी तरह से सूख नहीं किया गया है, एक और 15 मिनट के लिए शुष्क हवा.

GDNA के 6 रिहाइड्रेशन

  1. नमूना सूख गया है एक बार, सूखे gDNA गोली rehydrate के लिए Tris-EDTA के 300 μl जोड़ें.
  2. एक में मध्यम गति और स्थान पर 5 सेकंड के लिए भंवर नमूना1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस गर्म पानी से स्नान.
  3. पानी के स्नान से नमूने निकालें और आरटी पर ओ / एन सेते हैं.
    नोट: सभी उत्पादों और अभिकर्मकों सामग्री तालिका में सूचीबद्ध हैं प्रयोग किया जाता है, साथ ही तालिका 4.

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Representative Results

डीएनए बनती डीएनए एक्सट्रेक्शन की एक श्रृंखला का प्रदर्शन किया गया था निकासी के लिए इष्टतम मानकों का निर्धारण करने के लिए. एक एकल लार नमूना विभाजित है और प्रत्येक भाग एक दिया चर के लिए दो संभव मूल्यों में से एक के साथ परीक्षण किया गया था. प्रत्येक बनती परीक्षण के कम से कम आठ प्रतिकृति (जैसे, एक एकल लार के नमूने के साथ और प्रारंभिक 50 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के बिना दोनों निकासी का परीक्षण करने aliquoted था) प्रदर्शन किया गया. कुल डीएनए उपज, 260/280 मूल्य, 260/230 मूल्य, और विखंडन का आकलन करने के लिए electrophoresed डीएनए के दृश्य निरीक्षण: अनुकूलन चार मानक मैट्रिक्स के आधार पर किया गया था. चर के सभी संभव संयोजनों व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक चर के सीमांत प्रभाव का आकलन करने के लिए जगह चुनने (एन = 169 संयोजनों) सांख्यिकीय बातचीत का मूल्यांकन किया गया. प्रभाव एक बहु रास्ता दोहराया उपायों एनोवा का उपयोग कर परीक्षण किया गया और अनुमानित प्रभाव बराबर प्रतिगमन समीकरण से प्राप्त किए गए. सभी महत्वपूर्ण प्रभाव दृढ़ता से कहना के रूप में दिखाया गया है, 1 टेबल में संक्षेप हैंउपज में उम्र परिवर्तन या डीएनए गुणवत्ता (260/280 और 260/230) (लार इनपुट की मिलीलीटर प्रति एनजी / μl).

सेल (चरण 2) का आकलन करने से अनुकूलित किया गया था: एक 50 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन (1 घंटा) की 1) उपस्थिति / अनुपस्थिति proteinase कश्मीर गिरावट और भंडारण बफर द्वारा मध्यस्थता सेल समापन, 2 के लिए चला गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सेल सेल से पहले ) उपस्थिति / कदम (मध्यम गति, 15 सेकंड) vortexing द्वारा एक homogenization के अभाव, और 3) सेल समाधान ऊष्मायन समय (5 बनाम 30 मिनट). 30 मिनट सेल ऊष्मायन एक 3.5% (पी <.01) का औसत है, लेकिन कोई अन्य सेल चर उपज पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा से उपज में वृद्धि हुई. Vortexing एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण (पी <.001) लेकिन 0.03 व्यावहारिक छोटे से 260/280 अनुपात कम किया है.

प्रोटीन वर्षा (चरण 4) प्रोटीन तेज़ी दक्षता में सुधार, अमीनो एसिड चेन को बाधित करने के लिए proteinase कश्मीर पाचन से पहले है और डीएनए कब्जा कर रिहा. proteinase कश्मीर की राशि दस गुना विविध किया गया था.केन्द्रापसारण तापमान 4 डिग्री सेल्सियस 20 डिग्री सेल्सियस से कम हो गया था. Proteinase कश्मीर की राशि बढ़ाने से उपज (8.7%) और भी थोड़ा सुधार दोनों 260/280 और 260/230 के अनुपात में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण कमी के कारण होता है.

इथेनॉल वर्षा (चरण 5) की जांच प्रोटोकॉल का अंतिम चरण था. कुल centrifugation के समय (5 बनाम 30 मिनट 11) के रूप में था ग्लाइकोजन वाहक (0, 8 μl) की मात्रा, विभिन्न था. केवल centrifugation के समय काफी 290% की औसत वृद्धि के साथ, उपज प्रभावित. अब स्पिन भी 260/280 अनुपात थोड़ा (0.05) की कमी हुई. उपज पर ग्लाइकोजन का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव प्रयोगों के दौरान देखा गया था; इन एक्सट्रैक्शन में डीएनए की कुल मात्रा हालांकि ग्लाइकोजन आम तौर पर इस्तेमाल नहीं किया जाएगा कि पर्याप्त बड़ी थी. इन नमूनों में प्रभाव की कमी के बावजूद, यह अभी भी लार इनपुट मात्रा यहाँ या वहाँ अगर दिया की तुलना में कम है जब कम पैदावार के जोखिम को कम करने के लिए ग्लाइकोजन का उपयोग करने की सलाह देते हैई उपज कम हो जाएगा विश्वास करने के लिए किसी भी अन्य कारण है.

प्रतिनिधि डीएनए नमूने का दृश्य निरीक्षण (चित्रा 1) निकाले डीएनए बहुत किसी भी लार डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के लिए खंडित नहीं किया गया था कि संकेत दिया है, बल्कि अपमानित डीएनए का संकेत smearing के बिना एक उपयुक्त उच्च आणविक वजन बैंड दिखाया. RNase एक पाचन के बाद, प्रोटोकॉल 1.74 की औसत 260/280 का उत्पादन किया.

चित्रा 1
लार व्युत्पन्न डीएनए की 1. गुणवत्ता चित्रा. चार निष्कर्षण प्रक्रियाओं एक ही लार संग्रह करने के लिए लागू किया गया. (ए) नमूने एक 0.8% agarose जेल (250 एनजी डीएनए) पर electrophoresed गया. लार डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के सभी रूपों गिरावट के कोई सबूत के साथ उच्च आणविक वजन (> 20 KB) डीएनए में परिणाम. लेन: 1 डीएनए laddeआर, 2 और 3 Oragene prepIT L2P प्रोटोकॉल नमूने, 4 और 5 GENTRA Puregene शरीर के तरल पदार्थ प्रोटोकॉल, 6 और 7 अनुकूलित शाही सेना हटाने कदम बिना प्रोटोकॉल, 8 और 9 शाही सेना हटाने के कदम के साथ अनुकूलित प्रोटोकॉल. लेन 2-7 सीधे एक ही लार के नमूने पर अनुरूप प्रोटोकॉल हैं. लेन 8 और 9 शाही सेना हटाने कदम डीएनए गिरावट परिचय नहीं करता दिखा. (बी) नमूने एक 2% agarose जेल (150 एनजी डीएनए) पर electrophoresed गया. एक मामूली आरएनए शिखर 7 (सम्मेलनों के रूप में ऊपर) के माध्यम से 2 गलियों में जेल के तल के पास दिखाई है. लेन 8 और 9 शाही सेना हटाने कदम के प्रभाव को दिखाने के.

शाही सेना हटाने चरण (RNase एक साथ कदम 3) डीएनए की सही मात्रा का ठहराव के लिए महत्वपूर्ण है. एक qubit 2.0 fluorometer द्वारा मापा शाही सेना को डबल असहाय डीएनए के अनुपात द्वारा निर्धारित रूप में परीक्षण के दौरान लगातार उच्च आरएनए सामग्री, मनाया गया. RNase बिना नमूनों से औसत, न्यूक्लिक एसिड सामग्री पर एक उपचार 46.6% (± 0.4) आर एन के शामिलQubit की शाही सेना का पता लगाने के लिए संभव सबसे कम पढ़ रही है, जो "<20 एनजी / एमएल," के रूप में पढ़ा शाही सेना हटाने चरण लिया कि ए नमूने.

अतिरिक्त RNase एक कदम लागू किया गया था जब यह अनुकूलित प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त डीएनए उच्च throughput अनुक्रमण के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की थी. लक्षित resequencing डेटा प्राप्त करने के लिए, एक कस्टम Agilent SureSelect लक्ष्य संवर्धन किट अनुक्रम का 2.6 एमबी को लक्षित, 24 नमूने लिए आवेदन किया था. उच्च throughput अनुक्रमण लेन प्रति 12 बारकोड वाले (अनुक्रमित) नमूने पर आयोजित किया गया. अनुक्रम, GATK 13 आधार गुणवत्ता स्कोर recalibration, INDEL फिर से संगठित करना, डुप्लिकेट हटाने, SNP खोज और सभी 24 नमूने भर में एक साथ जीनोटाइपिंग की तो आवेदन सबसे अच्छा अभ्यास कठिन फ़िल्टरिंग पैरामीटर का उपयोग किया गया था hg19 संदर्भ जीनोम से 12 बीडब्ल्यूए गठबंधन गया पढ़ता 14 मूल्यों. सभी 24 नमूने उच्च गुणवत्ता NGS डेटा (तालिका 2) मिले. की है कि Illu पारित पढ़तामीना के मानक फिल्टर और क्यू था> 20, अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने में दुर्लभ SNP खोज के लिए आवश्यक सीमा के भीतर, क्यू> 100> 30x कवरेज के एक औसत पर लक्ष्य कवरेज गहराई प्रदान करने, अनुक्रम संवर्धन लक्ष्य क्षेत्रों के लिए गठबंधन 91.4%. औसत किनारा संतुलन 49.9% थी. Illumina माइक्रोएरे जीनोटाइप के साथ तुलना संस्करण कॉल 98.9% की एक क़बूल झुकेंगे.

उम्मीदवार चर एनजी / μl 260/280 260/230
भंवर एनएस -0.03 *** एनएस
X30 मिनट सेल ऊष्मायन 3.5% ** एनएस एनएस
Proteinase कश्मीर X10 -8.7% * -0.05 *** -0.03 ***
30 मिनट स्पिन 290.2%*** -0.05 *** एनएस
ग्लाइकोजन एनएस एनएस -0.37 ***

मात्रा / गुणवत्ता मेट्रिक्स पर अनुकूलित चर तालिका 1 प्रभाव आकार. सभी प्रभाव आकार स्तंभ शीर्ष लेख में सूचीबद्ध इकाइयों में हैं. एनोवा से पी मूल्यों: * पी <.05; पी ** <.01; *** पी <.001; महत्वपूर्ण नहीं एनएस

गुणवत्ता मीट्रिक मूल्य
लक्ष्य लंबाई 1,708 KB
टारगेट> 30x जिन 85.22%
DbSNP में SNPs 92.55%
ऐरे समझौता 98.99%

टारगेट संवर्धन से उच्च Throughput अनुक्रम तालिका 2 गुणवत्ता.

नई अनुकूलित प्रोटोकॉल आइटम Distributer सूचि # क्रय यूनिट लागत / यूनिट लागत / संग्रह
15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों फिशर 12-565-268 500 ट्यूब $ 233.50 $ 3.2690
सेल समाधान Qiagen 158908 1 एल $ 401.00 $ 3.2080
Proteinase कश्मीर सिग्मा P6556 1 ग्राम $ 713.00 $ 1.5686
प्रोटीन वर्षा समाधान Qiagen 158912 350 मिलीलीटर $ 350.00 $ 2.7200
Isopropanol फिशर A416-4 4 x 4 एल का केस $ 486.71 $ 0.2434
ग्लाइकोजन समाधान (20 मिलीग्राम / एमएल) ईज़ी Bioresearch S1003 1 मिलीलीटर $ 51.00 $ 0.8160
70% इथेनॉल फिशर 04-355-305 4 एक्स 1 लड़की का केस. $ 123.03 $ 0.0325
Tris EDTA (ते) फिशर BP2473-1 1 एल $ 68.67 $ 0.0412
NaCl फिशर AC194090010 1 किलो $ 34.65 $ 0.000004
Tris एचसीएल फिशर BP1757-100 100 मिलीलीटर $ 57.84 $ 0.0116
EDTA (0.5 एम) समाधान फिशर 03-500-506 100 मिलीलीटर $ 33.60 $ 0.0134
सोडियम डोडecyl सल्फेट फिशर BP166-100 100 ग्राम $ 59.95 $ 0.0060
कुल लागत $ 11.93
Oragene आइटम Distributer सूचि # क्रय यूनिट लागत / यूनिट लागत / संग्रह
15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों फिशर 12-565-268 500 ट्यूब $ 233.50 $ 0.9340
100% इथेनॉल फिशर BP2818-100 100 मिलीलीटर $ 34.29 $ 1.6459
70% इथेनॉल फिशर 04-355-305 4 एक्स 1 लड़की का केस. $ 123.03 $ 0.0081
Tris EDTA (ते) फिशर BP2473-1 1 एल $ 68.67 $ 0.0687
1.5 मिलीलीटर ट्यूब Genesee 22-281A 500 ट्यूब $ 22.85 $ 0.0457
Oragene संग्रह किट Oragene ओग-500 1 $ 25.00 $ 25.00
कुल लागत $ 27.70
Puregene आइटम Distributer सूचि # क्रय यूनिट लागत / यूनिट लागत / संग्रह
15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों फिशर 12-565-268 500 ट्यूब $ 233.50 $ 0.9340
सेल समाधान Qiagen 158908 1 एल $ 401.00 $ 4.0100
Proteinase कश्मीर Qiagen 158918 650 मिलीलीटर $ 73.10 $ 7.8723
प्रोटीन वर्षा समाधान Qiagen 158912 350 मिलीलीटर $ 350.00 $ 4.0000
Isopropanol फिशर A4164 4 x 4 एल का केस $ 486.71 $ 0.3650
ग्लाइकोजन समाधान Qiagen 158930 500 मिलीलीटर $ 64.30 $ 2.5720
70% इथेनॉल फिशर 04-355-305 4 एक्स 1 लड़की का केस. $ 123.03 $ 0.0975
डीएनए हाइड्रेशन समाधान Qiagen 158914 100 मिलीलीटर $ 69.80 $ 0.1396
NaCl फिशर AC19409-0010 1 किलो $ 34.65 $ 0.000004
Tris एचसीएल फिशर BP1757-100 100 मिलीलीटर $ 57.84 $ 0.0116
EDTA (0.5 एम) समाधान फिशर 03-500-506 100 मिलीलीटर $ 33.60 $ 0.0134
सोडियम dodecyl सल्फेट फिशर BP166-100 100 ग्राम $ 59.95 $ 0.0060
कुल लागत $ 19.99

अनुकूलित प्रोटोकॉल के 3 तालिका लागत की तुलना अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल के साथ पूरे लार के 2 मिलीग्राम से डीएनए निकालने के लिए. एकडीएनए निष्कर्षण के लिए आवश्यक करूँगा अभिकर्मकों और उपभोग्य 30 सितम्बर के रूप में इंटरनेट पर उपलब्ध मानक सूची कीमतों का उपयोग मूल्यांकन किया गया है, इस प्रोटोकॉल पूरे लार की 1.25 मिलीग्राम (से डीएनए निकालने के लिए लिखा है कि 2013 के नोट यानी, लार और बफर के 2.5 मिलीलीटर इस मूल्य लार संग्रह ट्यूब में कुल मात्रा का आधा का प्रतिनिधित्व करता है, के रूप में) 2.3 कदम देखते हैं. लागत तुलना के लिए, 2 मिलीलीटर यह एक आम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (Oragene) के साथ जुड़े राशि के रूप में चुना गया था.

डीएनए स्थिरीकरण बफर (250 मिलीलीटर)
घटक वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
1 एम NaCl 1.461 ग्राम 0.1 एम
Tris एचसीएल 2.5 0.01 एम
0.5M EDTA 5 0.01 एम
10% एसडीएस 12.5 </ TD> 0.014 एम
Proteinase कश्मीर समाधान (20 मिलीग्राम / एमएल) 2.5 6.92x10 -6 एम
DDH 2 हे 227.5
Proteinase कश्मीर समाधान (20 मिलीग्राम / एमएल)
घटक वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
Proteinase कश्मीर पाउडर 500 मिलीग्राम 6.92x10 -4 एम
DDH 2 हे 25
70% इथेनॉल (500 मिलीलीटर)
घटक वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
इथेनॉल 95% 368.5 12.63 एम
DDH 2 हे 131.5

टेबल अभिकर्मकों के लिए 4 व्यंजनों.

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Discussion

वर्तमान प्रक्रिया काफी डीएनए गुणवत्ता से समझौता किए बिना, मानक तरीकों की तुलना में उच्च आणविक वजन डीएनए की उपज में सुधार हुआ है कि एक अनुकूलित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल है. उपज अधिकांश पर सबसे बड़ा प्रभाव के साथ महत्वपूर्ण कदम व्यापक रूप से 11 से वितरित नहीं किया गया था कि एक को छोड़कर, यहाँ की समीक्षा की किसी भी प्रकाशित प्रोटोकॉल से इथेनॉल वर्षा के दौरान एक लंबी centrifugation कदम भी शामिल है जो कदम 5.2 थी. इस अब centrifugation के साथ जुड़े डीएनए गुणवत्ता में कोई परिवर्तन नहीं पूरे लार संग्रह से उपलब्ध डीएनए के सबसे आणविक वजन अपमानित और अधिक नहीं है यह दर्शाता है कि पता चला रहे थे.

पूरे लार संग्रह ऐसे संग्रह चरण में कम से कम करने की आवश्यकता है जो विदेशी contaminants के लिए संभावित,, और एक अंतर्निहित संक्रमण का संकेत हो सकता है कि नमूने में अत्यधिक प्रोटीन की उपस्थिति के रूप में नमूना गुणवत्ता में सीमाएँ हैं. प्रोटीन या विदेशी प्रदूषणों से बड़ी मात्रा में कर सकते हैंजिससे मात्रा का ठहराव गलत बनाने अंतिम निकाले डीएनए में रहते हैं. पुनर्जलीकरण (चरण 6) संदिग्ध होने के बाद अवशिष्ट प्रोटीन या दूषित पदार्थ हैं, तो एक नमूना नमूना इनपुट मात्रा को प्रतिबिंबित करने के लिए बढ़ाया अभिकर्मक संस्करणों के साथ प्रोटीन तेज़ी कदम पर शुरू से किया जा सकता है साफ. प्रोटोकॉल की एक और सीमा चरणों को पूरा करने के लिए आवश्यक समय की लंबाई है. कई नमूने समानांतर में चला जा सकता है; हालांकि, यह कोई 24 से अधिक समानांतर एक्सट्रैक्शन एक साथ चलाया जा सिफारिश की है. यह नमूना एक तंग गोली और फिर से भंग करने के छर्रों समय अनुमति दे सकता है और अधिक से अधिक 24 नमूने चल सुनिश्चित करने के लिए ठंडा रहना चाहिए जहां प्रोटीन तेज़ी कदम के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल माना सबसे अधिक लागत प्रभावी विधि (3 टेबल देखें). इस प्रोटोकॉल Puregene निकासी किट से उपयोग अभिकर्मकों करता है, Puregene प्रोटोकॉल में सिफारिश की तुलना में एक छोटे मात्रा प्रयोग किया जाता हैनिकासी उपज समझौता किए और बिना यह प्रोटोकॉल के सापेक्ष लागत बचत कि ड्राइव अभिकर्मकों में यह कमी है. निकासी के लिए गणना की लागत प्रत्येक आइटम के लिए सूची मूल्य का उपयोग करता है और किसी भी छूट को प्रतिबिंबित नहीं करता कि ध्यान दें. अनुकूलित प्रोटोकॉल के साथ निष्कर्षण लागत प्रति कंपनी की बिक्री प्रतिनिधियों के माध्यम से आगे थोक आदेश या छूट के साथ कम किया जा सकता है.

साक्ष्य भी इस प्रोटोकॉल अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए उपयुक्त है कि प्रदान की गई है. प्राप्त आंकड़ों रक्त नियमित रूप से उपलब्ध नहीं है, जहां कई बीमारियों में मानव आनुवंशिकी अनुसंधान के लिए लार के नमूने की उपयोगिता के आगे सबूत उपलब्ध कराता है. रक्त और सेल लाइन व्युत्पन्न डीएनए परीक्षण के लिए आनुवंशिक सामग्री के वरीय स्रोत बना हुआ है जबकि इस तरह के स्रोतों से उपलब्ध नहीं हैं, जब पूरे लार संग्रह एक व्यवहार्य विकल्प है, रोगी नामांकन उनके संग्रह या फ़स्त खोलना से प्रभावित है जब उपलब्ध या अव्यावहारिक नहीं है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml Centrifuge Tubes Fisher 12-565-268
Cell Lysis Solution Qiagen 158908
Proteinase K Sigma P6556
Protein Precipitation Solution Qiagen 158912
Isopropanol Fisher A416-4
Glycogen EZ-BioResearch S1003
70% Ethanol Fisher 04-355-305
Tris-EDTA (TE) Fisher BP2473-1
NaCl Fisher AC194090010
Tris HCl Fisher BP1757-100
EDTA (0.5 M) Solution Fisher 03-500-506
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 
Analog Vortex Mixer Fisher 02-215-365
Centrifuge 5810R Eppendorf 5811 000.010

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References

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