Jsubtomo을 사용하여 전자 Cryotomography 재건에서 바이러스 성 봉투 ​​당 단백질 스파이크의 평균화

Immunology and Infection
 

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Huiskonen, J. T., Parsy, M. L., Li, S., Bitto, D., Renner, M., Bowden, T. A. Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo. J. Vis. Exp. (92), e51714, doi:10.3791/51714 (2014).

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Abstract

싸여 바이러스는 숙주 세포에 진입을 중재하기 위해 표면에 막 당 단백질을 사용합니다. 이러한 당 단백질 '스파이크'의 입체 구조 해석은 종종 바이러스 성 병인을 이해하고 약물 디자인 기술적 도전하지만 중요하다. 여기서, 프로토콜은 전자 크라이 단층 촬영 데이터의 계산 평균을 통해 바이러스 스파이크 구조 결정을 위해 제공됩니다. 전자 극저온 단층 촬영은 거의 네이티브, 냉동 수화 상태에서 막 바이러스와 같은 다형성 생물 표본의 3 차원 단층 촬영 볼륨 복원 또는 단층 촬영을 유도하는 데 사용되는 전자 현미경의 기술입니다. 이러한 단층 촬영 낮은 해상도에서이기는하지만, 세 가지 차원에 대한 관심의 구조를 알 수있다. 서브 볼륨, 또는 하위 단층 촬영 전산 평균, 이러한 바이러스 당 단백질 스파이크 같은 구조적 모티프를 반복의 높은 해상도 세부 사항을 얻을 필요가있다. 알리에 대한 자세한 계산 방법gning 및 Jsubtomo 소프트웨어 패키지를 이용하여 서브 - 단층 촬영을 평균하는 개략되어있다. 이 접근법은 비리 막에 고차 스파이크 투 스파이크 상호 작용의 연구 (A)의 20 ~ 40 범위의 해상도와 연구 바이러스 성 스파이크 당 단백질의 구조의 시각화를 가능하게한다. 일반적인 결과는 Bunyamwera 바이러스, 가족 Bunyaviridae에서 포락선 바이러스되게됩니다. 이 가족은 인간과 동물의 건강에 위협이 병원균의 구조적 다양한 그룹입니다.

Introduction

전자 크라이 단층 복잡한 생물학적 시료의 3 차원 (3D)의 재구성 연산을 허용하는 전자 크라이 현미경 이미징 기술이다. 적절한 표본은 전체 원핵 세포 5 및 전체 진핵 세포 6 심지어 얇은 지역에 정제 된 거대 분자 복합체 일, 필라멘트 2, 코팅 된 소포 3, 다형성 막 바이러스 4 이르기까지 다양합니다. 틸트 계, 3 차원 단층 볼륨, 또는 단층 촬영 데이터의 컬렉션 후, Bsoft 78 IMOD 포함한 여러 확립 소프트웨어 패키지를 이용하여 계산 될 수있다.

전자 크라이 단층 제한 대응 단층 볼륨의 생물학적 해석에 의한 생체 시료의 연구에 내재 두 측면. 인해 상당한 방사선 손상을 도입하기 전에 생체 재료에 적용 할 수있는 제한된 전자 도즈, 시그나하려면 우선단층 촬영 데이터에 L 잡음비은 일반적으로 아주 낮다. 둘째, 데이터를 수집하는 동안 샘플로 경사 형상의 결과로서, 객체의 몇몇보기는 단층 부피 소위 '누락 쐐기'이슈 선도 유지 부재. 단층 볼륨이 성공적 일 수 9-12의 평균 수와 같은 거대 분자 복합체로서 동일한 구조를 반복 포함한다면, 이러한 제한을 모두 극복 할 수있다.

단층 복원에서 구조를 평균에 앞서, 관심 객체 발견하고 같은 방향으로 정렬되어야합니다. 이러한 구조를 찾는 것은 종종 주형으로 13 일치 함 접근법을 사용하여 단층 부피 주형 구조의 상호 - 상관에 의해 달성 될 수있다. 이 매칭 처리에 사용되는 템플릿은 극저온 전자 현미경 또는 3D 재구성 결합 전자 크라이 단층로부터 유도 될 수 있거나 밀도에서 시뮬레이션지도가 될 수있다원자 구조. 몇몇 연산 패키지 (11)는 이들 작업을 수행하기 위해 개발되었다.

이러한 HIV-1과 같은 막 바이러스의 당 단백질 스파이크의 평균, 그 구조 14-16 공부에 특히 성공적으로 접근하고있다. 구조에 대한 이해는 바이러스 호스트 상호 작용의 두 분자 기초를 공개하고 바이러스 백신 디자인 개발을 안내하기위한 필수입니다. 고분자 결정학 개별 바이러스 당 단백질과 그 복합체의 구조 분석 (4보다 일반적으로 더 나은) 고해상도에 대한 선택의 기술은 있지만,이 방법에 의한 X-선 구조 비리에 천연 멤브레인 환경에서 분리 된 단백질 아르 . 따라서, 그러한 비리 온의 맥락에서 바이러스 당 단백질의 고차 구조 등의 중요한 사항, 부족한 남아있다. 한편, 전자 현미경 및 크라이 단일 입자 재건전체 싸여 바이러스의 면체 대칭 (17, 18)와 비리로 제한됩니다. 서브 볼륨 조정과 함께 전자 cryotomography 따라서 현장에서 불규칙한 모양, 다형성 바이러스의 당 단백질 스파이크의 연구를 허용하는 상호 보완적인 기술로 떠오르고있다.

우리는 Jsubtomo 단층 서브 볼륨의 감지, 정렬 및 평균화 (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo)라는 소프트웨어를 개발했다. Jsubtomo은 세포 및 바이러스 성 구조 19-26의 번호의 구조 결정에 이용되었다. 여기서는 판정 바이러스 표면 스파이크 구조 있도록 상세한 프로토콜을 설명합니다. 소음의 상관 관계에 의해 과도하게 세분화 평균 구조를 회피하기 위해, '황금 표준'정제 방식은 10,27을 채용하고 있습니다. 마지막으로, 시각화 및 전형 결과의 해석을위한 전략을 논의한다.

Protocol

계산 정렬 및 바이러스 당 단백질 스파이크 이후의 평균에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 프로토콜은도 1에 도시 된 워크 플로우를 따르며 초기 템플릿 구조 및 금 표준 구조를 사용하여 정제 용 스파이크 자동 검색을 결합한다.

이 프로토콜에 대한 입력 데이터는 비리의 단층 복원의 집합입니다. 한 단층 촬영은 하나 이상의 비리가 포함되어 있습니다. 처음에는 스파이크의 작은 부분 집합을 수동으로 포착하고 평균 2 개의 독립적 인 모델을 수정하는 데 사용됩니다. 이 모델은 자동으로 비리의 모든에 스파이크를 찾는 데 사용됩니다. 마지막으로, 두 개의 독립적 인 세목이 실행되고 결과의 평균을 비교하고, 최종 구조를 생성하기 위해 결합된다.

정제 방법은 Jsubtomo 패키지에서 프로그램을 사용하여 설명된다. Bsoft 패키지 (28)로부터 프로그램은 일반적으로 이미지 페이지에 사용되는rocessing 작업 및 분자 그래픽 패키지 UCSF 키메라 (29)는 결과를 시각화하는 데 사용됩니다. 이탤릭체 및 파일 형식으로 제공됩니다 개별 프로그램의 이름은 대문자 파일 이름 확장자로 표시된다.

그림 1
그림 1 :.. 다형성 막 바이러스로부터 스파이크 단지 당 단백질의 구조를 결정하기위한 일반적인 전략 숫자는 프로토콜의 다른 섹션에 해당하는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 풀 사이즈 단층 촬영에서 바이러스 하위 볼륨을 추출

  1. 단층 촬영에서 수동으로 바이러스 입자를 선택합니다.
    1. bshow에서 단층 파일을 엽니 다. 중심이 바이러스 partic의 좌표를 정의제작은 입자 따기 도구를 사용하여. 모든 비리가 처리 될 때까지이 단계를 반복합니다. 저장 바이러스는 STAR 파일에서 조정합니다.
    2. 모든 단층 촬영이 처리 될 때까지 단계를 반복 1.1.1. 픽셀 비리 직경의 메모를 확인합니다.
      참고 : 스파이크 ( "80,10000 -bandpass"매개 변수) 80-A의 해상도로 단층 촬영을 필터링 단층 촬영에서 볼 로우 패스에 bfilter 사용하기 어려운 경우.
  2. 개별 볼륨의 파일에 대한 비리 서브 볼륨을 추출하고, 추출 모드 (파라미터 "--mode 추출물") jsubtomo.py 실행합니다. 입력 파일과 같은 단계 1.1.1에 저장 STAR 파일을 사용합니다.
    1. 데이터 세트에서 가장 큰 비리보다 25 % 더 큰 크기 (파라미터 "--size") ~ 보내기. 비리 온은 직경이 200 ~ 픽셀 사용 사이즈 250 × 250 × 250 화소 인 경우.
    2. 비리 볼륨의 출력 파일은 MAP-형식이됩니다. 또한, (parame 각 비리 볼륨에 대한 동반 STAR-파일을 작성터 "--output").
  3. (매개 변수 "-rescale 0.1") bimg에 비리 볼륨을 정상화.

두 개의 독립적 인 초기 모델의 2 세대

  1. 비리 서브 볼륨에서 스파이크의 부분 집합을 선택합니다.
    1. bshow의 비리 서브 볼륨 MAP 파일을 엽니 다. 중심 도구 창을 통해 액세스 입자 픽킹 도구를 사용 스파이크 좌표 정의. 모든 명확하게 구별 스파이크가 처리 될 때까지이 단계를 반복합니다. 저장 스파이크 STAR 파일에서 조정합니다.
    2. 필요한 경우, 대략 200 당단백 스파이크가 처리 될 때까지 다른 단계와 비리 2.1.1을 반복한다. 픽셀 스파이크 차원을합니다.
      참고 : ~ 200 스파이크는 대략적인 가이드 라인 아르 등 일부 응용 프로그램이 필요할 수 있습니다. 가능하면 다른 방향에서 스파이크를 선택하는 것을 목표로하고 있습니다. 만 평면도를 따기 마십시오.
  2. jviews.p을 실행하여 스파이크 초기 뷰 벡터를 할당y를 입력합니다. 입력 파일과 같은 단계 2.1.1에서 생성 된 STAR 파일을 사용합니다.
    참고 :이보기 벡터는 비리를 기준으로 스파이크의 방향을 근사.
    1. 중앙이 구형 비리에 대한 견해를 할당 할 좌표 사용합니다. 비리 온은 250 × 250 × 250 픽셀의 크기 상자 (단계 120 후에) 중심 경우, 예를 들어, 좌표 중심은 125,125,125 픽셀 (옵션 "--Radial 125125125")이다.
    2. , 사상 비리에 대한 견해를 할당 입력 파일과 단계 2.1.1에 정의 된 STAR 파일을 사용하여 bshow의 각 비리 서브 볼륨을 엽니 다. 필라멘트 채취 도구를 사용하여 필라멘트의 두 끝점을 정의하고 STAR 파일을 저장한다. 모든 STAR의 파일이 업데이트 될 때까지이 단계를 반복하여 입력 파일 (--option 세그먼트)으로 업데이트 STAR 파일을 사용 jviews.py 실행합니다.
  3. jsubtomo_create_mask.py 사용하여 현실 공간 마스크를 생성합니다. 실제 공간 마스크 같은 dimens입니다 있는지 확인평균 구조에 사용되는 바와 같이, 이온 (2.6.2 참조), 스파이크 및 하부 공막의 패치를 모두 포함 할 수있을만큼 충분히 크다.
  4. jsubtomo_create_wedgemask.py 사용하여 상호 공간 마스크를 생성합니다. 상호 공간 마스크는 하나의 축 단층 촬영 데이터 수집으로 인한 '실종 쐐기'지역에서 지역을 제외하는 데 사용됩니다. (2.6.2 참조) 평균 구조에 사용되는가 동일한 치수 있는지 확인하십시오.
  5. jsubtomo_evenodd.py 단계 2.2에서 생성 STAR 파일을 사용하여 "1"및 "2"세트에 속하는 비리 정의 파일 선택 (SEL 파일)을 생성한다.
  6. jsubtomo_create_averages.py 사용이 초기 평균을 생성합니다.
    1. 입력 파일로 단계 250에서 생성 SEL 파일을 사용한다.
    2. 크기 (매개 변수 "--size") 스파이크의 최대 치수보다 큰 적어도 32 픽셀. 예는 스파이크가, 경우 ~ 40 픽셀 긴 보내기사용 크기 72 X 72 X 72 픽셀.
    3. 스파이크의 장축 주위에 원통형의 평균에 근사하도록, 높은 평균에 대칭 (예컨대, C100) (파라미터 "--symmetry의 C100")을 적용한다. 초기 평균의 노이즈를 줄 대칭성을 사용합니다.
    4. 프로젝트 (매개 변수 "--suffix")의 출력 파일의 고유 한 이름을 제공합니다.
    5. 배경 (매개 변수 "--mask")을 멀리 마스크 단계 2.3에서 생성 된 실제 공간 마스크를 사용하십시오. 누락 된 쐐기 (파라미터 "--Mask")의 존재에 의해 도입 된 신호의 손실을 고려하여 2.4 단계에서 생성 된 공간 상호 마스크를 사용한다.

3 골드 표준 반복 정렬하고 두 개의 초기 스파이크 모델의 평균화

반복적으로 정렬하고 jsubtomo_iterate_gold.py과 섹션 2에서 생성 된이 초기 모델을 평균.

  1. I. 스테이지는이 단계의 목적을 세분화하는 것이다뷰 벡터의 방향. 입력 파일은 단계 250에서 생성 SEL 파일이다.
    1. (매개 변수가 "8,8,8 --angles") 8도 각도 샘플링을 사용합니다.
    2. (파라미터 "16 --thetaphilimit") 스파이크 뷰 벡터의 방향을 16도 변경이 허용되지만 스파이크 장축 고정 (파라미터 "--alphalimit 0") 주위의 각도를 유지한다.
    3. 작은 병진 이동 (예를 들어, 5 픽셀) 매뉴얼 스파이크 따기 부정확를 설명 할 수 있도록 허용 (매개 변수 "--shiftlimit 5").
    4. 스파이크의 장축 주위에 원통형의 평균에 근사하도록, 높은 평균에 대칭 (예컨대, C100) (파라미터 "--symmetry의 C100")을 적용한다.
      NOTE : 대칭 화는 평균 노이즈를 감소시키기 위해 사용된다.
    5. 누락 된 웨지 (매개 변수 "--m에 대한 주변의 스파이크와 계정을 멀리 마스크 실제 공간 마스크와 단계 2.3 및 2.4에서 생성 된 상호 공간 마스크를 사용하십시오각각 "와"--Mask "를) 부탁드립니다.
    6. 2.6에서 생성 된 두 개의 MAP 파일을 사용하여 ( "도"태그로 표시하고, 파일 이름에 "홀수") (각각 매개 변수 "--Template1"와 "--Template2") 템플릿으로.
    7. 배향 바이어스를 방지하기 위해 50-A 해상도 (파라미터 "--resolution")에 저역 통과 필터를 적용한다.
    8. 정제 ( "이 --bin"매개 변수) 속도를 2의 빈 계수를 적용합니다.
    9. ( "1 --lastiter 5 --firstiter"매개 변수)를 정렬 및 평균의 5 반복을 실행합니다.
  2. 스테이지 II. 이 단계의 목적은 뷰 벡터 주위의 각도를 수정하는 것이다. 입력 파일 단계 3.1.9의 출력 SEL 파일이다.
    1. 단계 3.1.9에서의 마지막 반복에서 발생 된 저역 통과 필터링 된 MAP 파일을 열어 스파이크의 정확한 치수를 측정 bshow에서 (파일명 태그 "_lp"로 표시). 새로운 실제를 생성공간 마스크는 마찬가지로 스파이크를 정의하지만, 막과 이웃 스파이크의 대부분을 제외 2.3를 진행한다.
      참고 : 마스크의 최적의 크기는 크기와 스파이크의 기능에 따라 달라집니다.
    2. 이전 (매개 변수가 "8,8,8 --angles") 8도 각도 샘플링을 사용합니다.
    3. 스파이크보기 벡터 ( "- alphalimit 180"매개 변수) 주변의 각도 180도 변경을 허용하지만, 세타을 유지하고 파이 각도 고정 (매개 변수는 "공을 --thetaphilimit").
    4. 모든 번역 변화하지 않도록 (매개 변수를 "공을 --shiftlimit").
    5. 평균 (매개 변수 "--symmetry을"생략)에있는 모든 대칭을 적용하지 마십시오.
    6. 누락 된 웨지을 설명하기 위해 2.4 단계에서 생성 된 상호 공간 마스크를 사용하십시오.
    7. 대칭이없는 단계 3.1.9의 마지막 반복에서 생성 된 두 개의 MAP 파일을 사용하여 템플릿 (파라미터 R 등 (태그 파일 이름에 "even_nosym"와 "odd_nosym"로 표시)20] - Template1 템플릿 "및"각각 --Template2 ").
    8. 배향 바이어스를 방지하기 위해 첫 번째 반복에서 50-A 해상도 (파라미터 "--resolution")에 저역 통과 필터를 적용한다. 두 개의 독립적 인 평균 사이에 자동으로 골드 표준 푸리에 쉘의 상관 관계 (FSC)에 따라 (매개 변수 "--adaptivefilter을") 이후의 반복에 필터 매개 변수를 조정합니다. 0.143 - 기준 사용 (매개 변수를 "0.143을 --fsccrit"). CTF 보정 단층 촬영에 적용되지 않는 한, 명암 전달 함수 (CTF) (매개 변수 "--minhires")의 첫번째 제로 과거 상세 검색을 허용하지 마십시오.
    9. (예를 들어, 매개 변수 "6 --lastiter 15 --firstiter") 정렬 5-10 반복을 실행하고 평균. 보고 해상도의 변화를 모니터링합니다. 유의 한 변화가 관찰되지 않은 경우, 프로세스는 중지 할 수있다.
  3. examini 의해 구조 대칭성의 정도를 평가스파이크 삼량 체 복합체 인 경우, 키메라. 예에서 (파일명 태그 "_lp"로 표시) 얻어진 저역 통과 필터링 된 MAP 파일 겨, 3 대칭성은 명백 할 것이다.
  4. 단계 III. 이 단계의 목적은 정확한 대칭으로 더 뷰 벡터 주위의 각도를 수정하는 것입니다. 입력 파일 단계 3.2.9의 출력 SEL 파일이다. 매개 변수는 몇 가지 예외를 제외하고 단계 3.2에서와 동일합니다 :
    1. 스파이크 뷰 벡터 주위의 각도에서 적절한 변경을 허용합니다. 예를 들어, 구조가 3 대칭성을 보유하는 경우, (파라미터 "60 --alphalimit") 알파 각도 60 °의 변화를 허용한다.
    2. 평균 (매개 변수 --symmetry의 C3 ")의 정확한 대칭 (예를 들어, C3)을 적용합니다.
    3. 입력 템플릿 파일 (매개 변수 "--Template1"등의 단계 3.2.9 (파일 이름에 "도"태그로 표시하고 "홀수")의 마지막 반복에서 생성 된 두 개의 MAP 파일을 사용하여 --Template2).
    4. (예를 들어, 매개 변수 "16 --lastiter 25 --firstiter") 정렬 5-10 반복을 실행하고 평균. 보고 해상도의 변화를 모니터링합니다. 유의 한 변화가 관찰되지 않은 경우, 프로세스는 중지 할 수있다.
  5. 스테이지 IV. 이 단계의 목적은 정확하게 동시에 세 가지 각도를 수정하는 것이다. 입력 파일 단계 3.4.4의 출력 SEL 파일이다. 매개 변수는 몇 가지 예외를 제외하고 단계 3.4에서와 동일합니다 :
    1. 스파이크보기 벡터 ( "- alphalimit 8"매개 변수) 주변의 각도 8도 변경 허용 및 스파이크 뷰 벡터의 방향으로 8도 변경 (매개 변수는 "8 --thetaphilimit"). 4도 정도의 방향을 수정 (매개 변수 "8,8,8 --iterate 2 --angles").
    2. (매개 변수를 "5 --shiftlimit")의 작은 변화 (예를 들어, 5 픽셀) 이전 정렬 단계에서 부정확성의 원인을 할 수 있습니다.
    3. U단계 3.4.4의 마지막 반복에서 생성 된 두 개의 MAP 파일 ( "도"태그로 표시하고, 파일 이름에 "홀수") 입력 템플릿 파일 (매개 변수 "--Template1"및 --Template2) SE로.
    4. (예를 들어, 매개 변수 "26 --lastiter 35 --firstiter") 정렬 5-10 반복을 실행하고 평균. 보고 해상도의 변화를 모니터링합니다. 유의 한 변화가 관찰되지 않은 경우, 프로세스는 중지 할 수있다.

템플릿 매칭에 대한 바이러스 표면에 씨앗의 4 세대 및 정렬

  1. 템플릿 매칭에 대한 비리 표면에 균일하게있는 씨앗을 생성하고 jviews.py을 실행하여 종자에 대한 초기보기 벡터를 지정합니다. 입력 파일로 1.2.2 과정에서 생성 된 STAR 파일을 사용합니다. 스파이크의 예상 수보다 약 1.5 배 더 많은 씨앗을 생성합니다.
    참고 :이보기 벡터는 각각의 종자에 가장 가까운 스파이크의 방향을 근사.
    1. 대략 구형 비리 (매개 변수 "라는 말이다")에 고르게 분포 씨앗을 생성하려면, ( "--radius"매개 변수) 각도 분리 씨의 (예를 들어, 20도) (매개 변수를 반경을주고 "20 --angle" )와 중앙이 비리의 좌표입니다. 예를, 비리가 250 × 250 × 250 픽셀 크기의 상자에 단계 1.2) 후 (중심되는 경우, 중앙은 좌표) "125125125 --origin"125,125,125 픽셀 (옵션입니다 .
    2. 사상 입자에 고르게 분포 씨앗을 생성하려면 "--Filament"매개 변수를 사용하여 반경 및 나선형 대칭 매개 변수 (상승 트위스트)를 모두 지정합니다.
      주 : 나선형 대칭 매개 변수는 균일하게 분포 된 씨앗 위치를 정의하는 편리한 방법으로 여기에 사용되며 그들은 필라멘트에 스파이크의 실제 순서를 반영 할 필요가 없습니다.
  2. explaine 같은 바이러스의 표면이 독립적 평균 생성섹션 2에서 D.
    1. jsubtomo_evenodd.py 단계 4.1에서 생성 STAR 파일을 사용하여 "1"및 "2"세트에 속하는 비리 정의 SEL 파일을 생성한다.
      주 : 데이터 세트의 독립 그룹으로 비리의 이전 할당을 보장하기 위해 "1"과 "2"는 동일하게 유지한다.
  3. 씨앗의 위치를​​ 수정.
    1. 특별히 명시되지 않는 한 3.1 단계에있는 지시 사항을 따르십시오. 입력 파일과 같은 단계 4.2.1에서 생성 된 SEL 파일을 사용하십시오.
    2. 씨앗은 막 (매개 변수 "--zshiftlimit")에 정상을 따라 만 이동하도록 허용합니다. 비리가 이상적인 구면 기하학에서 얼마나 벗어나 있는지에 따라 이동의 허용 금액을 조정 (예를 들어, 매개 변수는 "25 --zshiftlimit).
    3. 4.2 단계에서 생성 된 두 개의 MAP 파일을 사용 --Tem "입력 템플릿 파일 (매개 변수로 ("도 "태그와 파일 이름에"홀수 "로 표시)plate1 "및 --Template2).
    4. (예를 들어, 매개 변수 "--suffix _seeds") 원래의 입력 STAR 파일을 덮어 쓰지 않도록하기 위해 고유 접미사를 사용합니다.
    5. 계산 ( "4 --bin"파라미터) 및 저역 통과 필터를 빠르게하기 (4)의 비닝을 사용하여 (예를 들어, 파라미터 "--resolution 50").
  4. (매개 변수 "--cmm")를 jviews.py 사용하여 세련된 씨 STAR 파일의 키메라 마커 파일 (CMM)을 생성합니다. . 키메라의 CMM 파일 (및 관련 비리 MAP 파일)을 열어 씨앗을 검토하여 정제 된 씨앗 바이러스 막에 대하여 올바르게 정렬되어 있는지 확인합니다.
    참고 : 다른 색 마커의 별도의 세트를 (매개 변수 "--color")를 차별화하는 데 사용할 수있다. 대안 적으로 정제 된 마커는 그들의 교차 상관 계수 (즉, 파라미터 "--fomcolor 0.1,0.3 ')에 기초하여 착색 할 수있다.

5 골드 스탠드ARD 반복 정렬 및 스파이크 구조의 평균화

자동으로 세련된 씨의 주위에 지역 템플릿 매칭을 사용하여 비리 서브 볼륨의 모든 스파이크를 찾아 맞추고있는 스파이크를 평균. 초기 템플릿으로 직접 고른 스파이크의 부분 집합에서 발생하는 평균을 사용합니다.

  1. 프로그램 jsubtomo_iterate_gold.py을 사용하여 모든 스파이크를 평균하는 씨앗 주변 지역의 템플릿 매칭을 수행합니다. 달리 명시되지 않는 단계 3.5의 지침을 따르십시오.
    1. 입력 파일은 단계 4.3에서 생성 된 정제 된 종자 SEL 파일이다.
    2. 뷰 벡터 각도 충분히 큰 제한을 사용합니다. 씨앗마다 20도 (단계 4.1)를 생성 된 경우, 예를 들면,이 값의 절반보다 약간 큰 각도 (매개 변수 "12 --thetaphilimit")를 사용합니다. 스파이크 뷰 벡터 주위의 각도에서 적절한 변경을 허용합니다.
    3. (파라미터 씨앗 멤브레인의 평면에서 이동하도록 허용"--xyshiftlimit"). 씨에 씨 거리가 25 픽셀 인 경우 예를 들면,예를 들어,이 중 절반 (보다 약간 변화, 매개 변수를 사용하여 "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
      NOTE : 단계 3.5에서 생성 된 MAP 파일 씨보다 비리 중심으로부터 서로 다른 거리에 집중되는 경우 추가의 병진 이동이 요구 될 수있다.
    4. 단계 3.5에서 생성 된 두 개의 MAP 파일을 사용하여 ( "도"태그로 표시하고, 파일 이름에 "홀수") 입력 템플릿 파일 (매개 변수 "--Template1"및 --Template2) 등.
    5. 단계 3.5 (파라미터 --resolution)에서 생성 된 MAP 파일의 현재 해상도를 사용한다.
    6. ( "1 --lastiter 10 --firstiter"예를 들어, 매개 변수) 템플릿 매칭, 정렬 및 평균 5-10 반복을 실행합니다. 보고 해상도의 변화를 모니터링합니다. 유의 한 변화가 관찰되지 않은 경우, 프로세스는 중지 할 수있다.
    7. 각 반복 후, 중복 안타를 제외합니다. 스파이크의 폭이 30 픽셀 인 경우 예를 들면, 다른 히트에 (매개 변수 "--mindist 30")보다 가까운 30 픽셀이 안타를 제외합니다.
    8. 공동 효율이 낮은 상호 상관 관계 안타를 제외합니다. 예를 들어, 각 비리 (매개 변수 "--topp 75")에 대한 최선의 75 % 스파이크를 포함한다.
      참고 : 낮은 상호 상관 공동 효율적으로 조회수가 거짓 양성 안타를 나타낼 가능성이있다.

결과의 시각화 (6)

  1. 시각화를위한 키메라의 스파이크의 세련된 구조를 열고 원자 구조의 피팅.
    1. 입력 파일과 같은 단계 5.1.6에서 최종 반복에서 만든 (태그 "LP"로 표시) 로우 패스 필터링 MAP 파일을 사용하십시오.
    2. 도구 "지도에 맞게"키메라 피팅 기반 상호 상관에 대한 단계 5.1.6에 표시된 해상도를 사용합니다.
  2. virio의 복합 모델을 작성N jsubtomo_create_model.py 사용.
    1. 에 입력 MAP 파일로 단계 5.1.6에서 최종 반복에서 생성 (태그 "LP"로 표시된) 저역 통과 필터링 된 MAP 파일을 사용 (파라미터 "--template").
    2. 입력 STAR 파일과 단계 5.1.6에서 최종 반복에서 생성 된 STAR 파일을 사용하십시오.
    3. 복합 모델 (매개 변수 "--mask")로 밀도를 중복을 고려하여 단계 3.2.1에서 생성 된 마스크 파일을 사용하십시오.
    4. 동일한 크기의 합성 모델 (파라미터 "--size")를 생성하는 비리 MAP 파일의 크기를 나타낸다.
  3. 키메라의 시각화를위한 복합 모델을 엽니 다.

Representative Results

우리는 24를 설정 이전에 게시 된 데이터를 사용하여 Bunyamwera 바이러스 (Orthobunyavirus, Bunyaviridae)의 엔벨로프 당 단백질 복합체에 대한 위에서 설명한 서브 단층 평균 워크 플로우의 응용 프로그램을 보여줍니다. 데이터 수집 및 정제 파라미터는 표 1에 나열되어 있습니다. 대표하는 하나의 단층는 그림 2와 같다.

매개 변수 (단위)
데이터 수집
전압 (kV의) 300
보정 배율 (X) 111000
픽셀 크기 (A) 5.4
예상 용량 (전자 - / 2) 100
언더 포커스 (μM) 4.0-4.5
제 CTF 제로 (A) 26-30
틸트 범위 (°) -60-60
틸트 샘플링 (°) 3
데이터 및 개선
단층 촬영 11
비리 29
비리 당 씨앗 (106)
씨앗의 총 수 3074
스파이크 검출 1346
중복을 제거한 후 스파이크 1401
교차 상관 관계를 기반으로 선택 후 스파이크 1022
스파이크는 최종 평균에 포함 1022
대칭 C3
각도 샘플링 (°) 8
해상도정제에 사용되는 범위 (A) 42-334
최종 해상도 추정 (A) (B) 35

표 1 : Bunyamwera 데이터 수집 및 정제 통계.
CTF, 콘트라스트 전달 함수.
B 0.143의 임계 값이 독립적으로 정제 된 구조물 사이 푸리에 쉘 상관을 사용하여 계산.

그림이
그림 2 :. Bunyamwera 비리의 단층 촬영을 통해 조각 각 비리의 주변에서 분명 여러 스파이크 측면보기는 화살촉으로 표시됩니다. 단층 촬영 (60)에 로우 패스 필터링하고 있습니다. 스케일 바 100 nm의.

첫째, 우리는 205 수동 고른 스파이크를 사용 초기 모델 (정제 (그림 3B)를 적용하지 않고 분명했다 및 개선의 다음 라운드 (그림 3C)에 부과되었다. 비리 온의 표면 상에 자동적으로 모든 스파이크를 검출하기 위해, 우리는 43 내지 20도 (도 4A)의 간격의 반경마다 비리 대 106 씨앗 생성 반복적 막 (도 4b)에 대하여 자신의 위치를 정제.

그림 3
그림 3 : 초기 템플릿 구조의 제련. (A) 원통형 스파이크의 수동으로 정의 위치에서 건설 (C100) 템플릿을 평균. (B) '평균 밀도를 정제의 5 라운드 후 모든 대칭없이 (C1) 3 배에 표시에게 스파이크를 부과대칭 기능을 제공합니다. 모델의 해상도는 48 Å이다. 스파이크 (C) 평균이 3 배 대칭 정제의 5 라운드 이후 41 Å에서 해결되었습니다.

그림 4
그림 4 :.. 씨의 제련 AB) (전 씨의 집합)과 후 (B) 정제는 그림 2에서 한 비리 밀도 (B)의 씨앗을 나타내왔다 색으로 각각의 크로스를 기반으로 상관 계수 (파란색, 낮은 상관 관계, 빨강, 높은 상관 관계).

(중복을 제거한 후 상위 75 %; ~ 1000 스파이크) 최상의 스파이크 당 단백질 상호 관련 패치는 최종 평균을 계산하는 데 사용 하였다. 평균은 35 Å 해상도 (그림 5)로 확인되었다. 이 글은, 중간에 삼량 스파이크 구조를 밝혀여섯 이웃 스파이크에서 약간의 기여뿐만 아니라. 알려진 위치에 구조를 배치하여 계산 된 비리의 복합 모델은 비리 표면 (그림 6A)에 스파이크의 위치를 한 것으로 밝혀졌습니다. 때때로, 스파이크의 로컬 주문 패치 (그림 6B) 분명했다.

그림 5
그림 5 : 템플릿 매칭 후 당 단백질 스파이크 층의 패치의 정제 구조. (AB) '도'와 '홀수', 데이터의 두 부분에서 재구성 된 두 개의 맵이 표시됩니다. 이지도는 접근 방식의 validness을 확인, 유사의 놀라운 수준을 보여줍니다. 이지도는 서로 완전히 독립적으로 재구성 된대로 스파이크 긴 축을 중심으로 방향이 다르다. 이지도의 (C) 평균에 표시됩니다35 Å의 최종 해상도.

그림 6
그림 6 : Bunyamwera 비리에 스파이크를 배치. (A) 비리의 복합 모델입니다. 보기 벡터 (스틱) 스파이크의 방향을 나타냅니다. 색상은 각각의 스파이크와 템플릿 구조 (파란색, 낮은 상관 관계, 빨강, 높은 상관 관계) 사이의 상호 상관을 나타냅니다. 스파이크의 정렬 된 패치의 (B) 근접.

Discussion

비리 막에 바이러스 성 스파이크 당 단백질 구조의 기술은 바이러스 복제를 이해하고 치료 및 감염을 예방하는 치료제의 개발에 필수적이다. 단일 입자의 평균 결합 전자 현미경 크라이 스파이크 당 단백질을 포함 엔벨로프 바이러스 입자의 구조를 해결하기 위해 대부분의 이용 방법으로서 떠오르고있다. 그러나,이 방법은 대칭 바이러스를 icosahedrally로 제한됩니다. 여기 Jsubtomo에서 전자 크라이 단층 촬영 subtomogram 평균의 응용 프로그램을 통해, 우리는 다형성에 다른 현재의 구조 생물학 방법 의무가없는 바이러스 당 단백질 스파이크를 포위 결정하기위한 일반적인 프로토콜을 설명했다. 우리의 대표적인 결과이 방법의 해상도가 도메인 아키텍처, 올리고머, 그대로 비리에 당 단백질 스파이크의 고차 조직에 대한 통찰력을 공개하기에 충분 함을 입증.

jove_content ">이 프로토콜 내에서 가장 중요한 단계는이 단계의 또 다른.을 성공적으로 실행하는 당 단백질 스파이크 있도록 충분히 큰 너무 밀접하게 서로에 대해 포장하지 않은 것으로 가정 한 통계적으로 독립적이 신뢰할 수있는 초기 모델을 건설하고 개별 스파이크 수 시인 수동 단층 촬영 고른, 2 개의 독립적 인 모델은 평균화 될.이 가능하지 않은 경우, 프로토콜이 변경이 시도 될 수있다. 첫째, 두 개의 독립적 인 랜덤 모델은 먼저 subtomograms 두 임의의 서브 세트를 정의에 의해 구성 될 수있다 이러한 서브 세트 (30) 내에 subtomograms 평균. 둘째, 절연 스파이크의 구조를 X-선 결정학에 의해, 예를 들면, 다른 방법에 의해 도출 된 경우, 이는 초기 모델로서 사용될 수있다. 그러나, 치료가 저 -주의해야 정제의 다음 라운드에서 것이 모델의 결과로서, 저해상도 컷오프 (50-70 A)을 이용하여이 모델에 필터를 통과만이 해상도를 넘어 통계적으로 독립. 이주의해야 할 점으로 인해 이전의 접근 방식을 권장합니다.

이 프로토콜에서 얻을 수있는 해상도는 네 가지 주요 요인에 따라 달라집니다 내가. 데이터 수집 전략 및 입력 데이터의 품질, II. subtomograms 수, III. 배향 subtomograms의 정확성, 및 IV. 구조의 이질성. 제 1 및 제 2 한계가 크게 높은 신호대 직접 전자 CTF 결합 검출기 단층 수정 및 자동 데이터 수집을 사용함으로써 극복 될 수 있지만, 얼라인먼트 정밀도를 더욱 관심 자체의 구조의 크기 및 형상에 의해 영향을 받는다. 눈에 띄는 특징을 결여 작은 스파이크에이 프로토콜을 적용하면, 배향의 정확도 때문에 해상도를 개선하기 위해 31 스파이크의 Fab 단편에 결합하는 것이 유리할 수있다. 마지막으로, 구조는 평균화 할 경우 전시 배좌 여러 서브 단층AM 분류 방법은 별도로 상이한 입체 형태를 평균화하기 위하여 사용될 수있다. 이를 위해 Jsubtomo 강력한 subtomogram 분류 구를 제공하고, 디나모 패키지에 통합하고있다.

상기 프로토콜은 절연 바이러스 당 단백질의 X-선 결정학에 상보. 결정 구조는 비리 막에 대하여 당 단백질의 정확한 배향을 얻기 위해 서브 - 단층 평균에 장착 할 수있다. 이 방법의 적용은 의심 할 여지없이 싸여 바이러스 구조와 pathobiology에 대해 설명해 주실 것입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Jsubtomo (ver 1.3.1) University of Oxford n/a www.opic.ac.uk/jsubtomo
Bsoft (ver 1.8.7) NIAMS, NIH n/a bsoft.ws
UCSF Chimera UCSF n/a www.cgl.ucsf.edu/chimera

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References

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