최적화 된 합성 표면을 간세포 표현형 사용 안정화

Chemistry

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Summary

이 문서는 장기적 폴리머 코팅 된 표면을 개발에 초점을 맞출 것이다, 줄기 세포의 안정적인 문화는 인간의 간세포를 산출했다.

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Lucendo-Villarin, B., Cameron, K., Szkolnicka, D., Travers, P., Khan, F., Walton, J. G., Iredale, J., Bradley, M., Hay, D. C. Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces. J. Vis. Exp. (91), e51723, doi:10.3791/51723 (2014).

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Abstract

Introduction

생물학적 물질은 널리 능성 줄기 세포의 유지 및 분화에 사용되어왔다. 가능하지만, 이러한 생물학적 기질은 종종 정의되지 않은 구성 요소의 무수가 포함되어 있습니다. 마트 리겔은 줄기 세포 배양 및 분화를위한 일반적으로 사용되는 기판이다. 불행하게도, 그 변수 조성물은 세포 표현형 및 기능에 영향을 미친다. 대안 이상의 정의 된 생물학적 매트릭스들의 다양한 2-7을 사용되었지만, 그들의 동물성 또는 나쁨 확장 그들에게 산업 제조에 부적합한 후보를 만든다. 따라서, 줄기 세포 연구의 주요 목표는 정의 된 구성과 신뢰할 수있는 성능으로 합성 대안의 식별이다.

정의되지 않은 세포 배양 기판의 한계를 극복하기위한 시도에서, 화학, 생물학 학제 간의 협력은 세포 표현형을 지원하는 능력과 합성 물질을 확인했다. 신디etic 기판은, 비용 효율적인 확장 성, 그리고 생체 내 환경을 흉내 낸, 복잡한 3 차원 구조로 제조 될 수있다. 이러한 특성으로 인해, 합성 기판은 널리 다양한 유형의 세포의 분화 8-10을 지원하고 구동하기 위해 사용되어왔다.

고급 및 높은 처리량 분석 대형 도서관에서 합성 물질의 신속한 심사를 촉진하고, 생물 의학 연구 및 개발 11-13에서 다양한 응용 프로그램과의 유연한 특성을 가진 새로운 물질을 전달했다. 높은 처리량, 고분자 마이크로 어레이 검사 기술을 활용, 우리는 빠른 속도로 인간의 줄기 세포 유래 간세포의 유지 보수에 적합한 간단한 폴리 우레탄 (PU134)를 확인했다. 이 중합체는 간세포 분화와 기능 14-16와 관련하여 동물 유래의 기재에 우수한 것으로 밝혀졌다. 우리는 이후 효과를 액세스하는 도포 조건, 지형 및 살균 처리를 최적화 한간세포 기능 및 수명을 안정화 중합체 성능. 이 세포 기반의 모델링 및 재생 의학 응용 프로그램에 대한 간세포 생물학의 기초를 이해 관련하여 중요한 의미를 갖는다.

여기에 설명 된 기술은 합성 중합체의 표면이 세포 표현형을 유지하도록 최적화 될 수있는 방법의 예를 나타낸다. 우리는 효율적인 무 혈청 간세포 분화 프로토콜이 기술의 조합이 체외 모델링 및 재생 의료에 사용하기위한 간세포의 생산 확장을 제공하는 잠재력을 가지고 있다고 믿는다.

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Protocol

PHNGAD (폴리 [1,6-hexanodiol / 네오 펜틸 글리콜 / 디 (에틸렌 글리콜) -alt - 아 디프 산] 디올)의 1 합성

반응식 1

반응식 1 : PHNAGD의 합성 PHNAGD의 합성의 도식 표현.. PHNAGD는 1,6-Hexanodiol의 반응, 디 에틸렌 글리콜, n​​eoppentyl 글리콜 및 아 디프 산을 제조 하였다. PHNAGD, 폴리 [1,6-hexanodiol / 네오 펜틸 글리콜 / 디 (에틸렌 글리콜) -alt - 아 디프 산] 디올.

  1. 잔류 물을 제거하기 위해 진공 오븐에서 48 시간 동안 40 ° C에서 단량체 1,6 - 헥산 디올, 디 (에틸렌 글리콜) 및 네오 펜틸 글리콜로 열처리를 적용. 진공 상태에서 RT까지 차가운 할 수 있습니다.
  2. 딘 - 스탁 장치에 교반 막대가 장착되고 연결의 2 구 둥근 바닥 플라스크에 각각의 단량체 및 아 디프 산 (55 밀리몰)의 22 밀리몰 추가.
  3. 진공 상태에서 전체 어셈블리를 놓고 부드럽게 GLA를 가열플라스크에 화학 물질의 첨가 중에 흡습을 방지하기 위해 6 시간 동안 40 ° C의,시 ssware.
  4. 드롭에 의해 촉매 티타늄 (IV) 부톡 사이드 0.0055 몰을 드롭 주사기를 통해 추가합니다.
  5. 24 시간 동안 N 2 분위기에서 180 ° C에서 반응 혼합물을 교반하고, 딘 - 스타크 트랩에서 잔류 물을 수집한다. 제품이 RT로 냉각시킵니다.

PU134의 2 합성

계획이

반응식 2 : PU134의 합성 PU134가 4,4 메틸렌 비스 (페닐 이소시아네이트) 2.0 당량과 PHNGAD 1.0 당량의 반응에 의해 제조 된 폴리 우레탄 (134)의 합성 도식 표현, 1.0을 첨가 하였다. 1,4 - 부탄디올 사슬 연장 제의 당량.

  1. (4) 2 당량과 폴리올 PHNGAD 1 당량 (Mn이 1,800 ~ DA, 3.2 밀리몰)을 혼합무수 N에서 '4 메틸렌 비스 (페닐 이소시아네이트) (6.4 밀리몰), N 디메틸 포름 아미드 (12 mL)을 첨가 하였다.
  2. N 2 분위기 하에서 70 ° C에서 반응 혼합물을 저어.
  3. , 주사기를 통해 추가 촉매 티타늄 드롭 들러 (IV) 부톡 사이드 (0.8 중량 %).
  4. 1 시간 후, 사슬 연장 1,4 - 부탄디올 (3.2 밀리몰)의 1 당량을 추가한다. 90 ° C의 온도를 높이고 N 2 분위기 하에서 24 시간 동안 교반한다.
  5. 반응에 이어, 침전이 일어날 때까지 반응 용액에 적가 하였다 (도 사용될 수 헥산 또는 물), 디 에틸 에테르를 첨가하여 침전에 의해 폴리 우레탄을 모은다.
  6. 5 분 동안 5,300 XG에 용액을 원심 분리기.
  7. 뜨는을 가만히 따르다 용매가 증발 할 때까지 진공 오븐에서 40 ° C에서 떨어져 건조.
    주 : 위해 반응의 최종 생성물은 분자량 분포에 관한 정확한 파라미터를 갖고 있는지 확인하기 위해, 기능적 GROU중합체 및 융점 및 유리 전이 온도의 PS는 다양한 분석 기술 및 방법은, 겔 투과 크로마토 그래피 또는 피트 르 분광법으로 사용될 수있다.

PU134 솔루션의 3 준비

  1. 유리 병에 PU134의 200 mg의 무게를 측정한다.
  2. 클로로포름, 1 클로로포름과 톨루엔의 조합 : 용매의 수가 2 %의 최종 농도로 희석 한 PU134 비율, 테트라 히드로 푸란과 조합 한 테트라 히드로 푸란과의 dicloromethane : 1 비율.
    참고 : 오른쪽 용매의 선거 사용할 수있는 폴리머에 따라 달라집니다. 다른 용매는 중합체의 용해에 영향을 미칠 수있는 다른 비등점을 갖는다.
  3. 용액을 균질하게하고 침전물이 관찰되지 않을 때까지, 200 MOT / 분의 속도로 진탕을 사용하여 RT에서 20 분 동안 격렬히 흔들어 용액.

PU134 유리 슬라이드의 4 코팅

  1. 알자 배치스핀 코터에 ND 15mm이 커버 슬립.
  2. 피펫을 사용하여 각 PU134 용액 50 μl를 적용합니다. 비율에 비례하는 양 표면을 유지해야 커버 슬립 크기에 따라 PU134 용액의 양을 조정한다.
  3. 23의 X g에서 7 초 동안 각 coverslip에 스핀.
  4. 멸균하기 전에 최소 24 시간 동안 실온에서 공기 건조 커버 슬립.

커버 슬립의 5 조사

  1. 12 분 동안 실험실 조사 장치를 사용하여 회색의 열 용량을 적용하여 중합체 코팅 된 커버 슬립을 감마 - 조사한다.
  2. 16 분 각 팀의 30 W, UV 전구를 사용하여 폴리머 코팅 된 커버 슬립을 조사 자외선.
  3. 슬라이드 크기에 따라 적합한 조직 배양 접시에 고분자 코팅 된 커버 슬립을 놓습니다.

6 주사 전자 현미경

  1. 압력이 5 × 10-1 밀리바의 분위기에서 200 초간 스퍼터링에 의해 금 코트 폴리머 커버 슬립.
  2. microg 캡처이차 전자 촬상 모드에서의 20 kV의 가속 전압에서 주 사형 전자 현미경을 사용하여 코팅 된 커버 슬립의 중합체 raphs.

7 원자 힘 현미경 관찰

  1. 중합체 표면의 20 × 20 ​​μm 인 영역을 스캔.
  2. 1.32 Hz에서에서 1.60 Hz로 스캔 속도를 설정합니다.
  3. 스캔 한 지역에서 512 X 512 픽셀의 해상도를 설정합니다.
  4. 루트 평균 화상 데이터 플레인에서 찍은 높이 편차의 평균을 이용하여 코팅의 제곱 (RMS 또는 자승)를 계산 의미로 표현 :

    여기서 닫아 현재 Z 값이며, N은 주어진 지역 내 점의 수이다.
  5. 이용한 화상의 7.5 편차를 계산하거나, 표면 평균 거칠기 (라)

    어디 Z (X)는 t을 설명하는 기능입니다그 높이 (Z) 및 평가 길이 "L"을 통해 샘플의 위치 (X)의 관점에서 분석 프로파일 표면. RA가 중심면에 대하여 표면의 평균 값을 나타낸다.

8 세포 배양 및 분화

  1. 농경 건초 및 17에 기재된 바와 같이 인간 배아 줄기 세포주 (hESC의) H9 차별화.
  2. 해리 시약을 이용하여 세포를 분리하고 (18,19)에 대해 설명 Szkolnicka으로 무 혈청 배지의 존재하에 분화 과정의 일 9시 PU134 코팅 슬라이드 위에 그들을 replate.
    주 : 효소 적 세포 해리의 사용은 물리적 셀 박리하는 것이 바람직하다.

9 사이토 크롬 P450 기능 분석

  1. 제조업체의 지침에 따라 CYP3A 활동을 측정한다.
  2. 세포없이 hESC의 파생 일 13 일 19에서 간세포, 미디어를 품어 - 음성 대조군으로, 적절한 SUBSTR로37 ° C에서 5 시간 동안 먹었다.
  3. , 셀 및 미디어에서 상층 액을 수집 제조업체의 지침에 따라 분석을 수행한다.
  4. 표면적 (cm 2) ~ CYP 활성 및 정규화의 상대적인 수준을 측정한다.

(10) 면역 염색

  1. 워시 hESC의 1 분 동안 PBS로 간세포를 유도, 두 번 반복합니다.
  2. 10 분 동안 -20 ° C에 차가운 얼음 백퍼센트 세포를 해결하기 위해 메탄올, 장소를 추가합니다.
  3. 5 분 동안 PBS로 세포를 씻으 두 번 반복합니다.
  4. PBS / T (0.1 % 트윈) RT에서 1 시간 / 10 % BSA와 함께 세포를 배양한다.
  5. PBST 솔루션을 기음과 PBS / T (0.1 % 트윈) / 1 % BSA에 희석 적절한 일차 항체를 추가, 부드러운 교반 O / N로 4 ° C에서 배양한다.
  6. 5 분 동안 PBS / T (0.1 % 트윈) / 1 % BSA와 세포를 세척하고 세 번 반복합니다.
  7. , PBS / T (0.1 % 트윈) / 1 % BSA에 적합한 항체를 희석하여 세포에 추가하고 교반과 함께 1 시간 동안 RT에서 어두운 곳에서 배양.
  8. 5 분 동안 PBS로 세포를 세척하고 세 번 반복합니다.
  9. 각 웰에 기포의 수를 줄이기 위해 부드럽게 커버 슬립을 추가 (1000 DAPI 일을 포함) MOWIOL 488를 추가합니다. 스토어는 어둠 속에서 4 ° C에서 세포를 고정. 적절한 필터 및 형광 램프 현미경을 사용하여 염색 관찰한다. 최적화 된 일차 및 이차 항체는 표 1에 나열되어 있습니다.

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Representative Results

고분자 용매 중합체 코팅 표면의 지형에 영향

폴리 우레탄 (134)은 단독으로 또는 톨루엔 또는 테트라 하이드로 퓨란 또는 디클로로 메탄과 유리 슬라이드가 다양한 제형으로 스핀 코팅과 조합하여, 클로로포름에 용해시켰다. 주사 전자 현미경 (SEM) 및 원자력 현미경 (AFM)을 (도 1) 중합체 코팅의 물리적 성질을 특성화하기 위해 사용되었다. 톨루엔, 클로로포름을 사용하여 얻은 코팅은 PU134 침전 (그림 1A)와 고르지 코팅을 보여 균일하지 않았다. 대조적으로, 테트라 히드로 푸란은 훨씬 균일 한 표면 (도 1a)의 스핀 코팅을 허용 적합한 용매이었다. 표면 토포 그래피는 제곱 (RMS)와 평균 거칠기 지수 (Ra)를 의미하는 루트를 이용하여 AFM으로 측정되었다. PU134는 테트라 히드로 푸란에 용해 토륨 비교 조도의 40 % 감소를 나타냈다전자 기타 용매 (그림 1B와 1C). 이러한 데이터는 용매로서 테트라 히드로 푸란 사용 생물학적 응용을위한 PU134의보다 균일 한 코팅을 제공한다는 것을 보여준다.

폴리머 지형 간세포 기능에 상당한 영향을 미친다

hESC의 효율적 성인 간 17-20 검색된 여러 기능을 나타내는, 시험관 내에서 간장 내배엽으로 분화 될 수있다. 간 내배엽 분화 유도하고, 일에서 9 hepatoblast 같은 세포 아세포 19 (1.2 ± 99 %), α-페토 프로테인 (0.6 ± 99 %), 그리고 간 핵 인자 4α (97 % ±을 발현하는 세포의 대부분으로, 명백했다 2.6); 알부민의 낮은 수준 (1.7 ± 20 %) (그림 2). 이 시점에서 세포를 발현 및 다른 중합체 코팅 된 표면 상에 도말 TrypLE하여 분리 하였다. 대사 기능의 척도로서, 시토크롬 P450의 F기름 부음은 사일에게 포스트 replating을 평가 하였다. 우리는 테트라 하이드로 퓨란 / PU134 표면 코팅 (그림 3)에 도말 세포의 신진 대사 활동에 2 배 증가를 관찰했다. 이전 21 접근으로이 결과는 hESC의 유래 간세포의 신진 대사 활동이 PU134의보다 균일 한 코팅으로 개선되고 있음을 입증,이 일치한다.

중합체의 생체 활성 특성에 표면 살균 영향

PU134 성능에 대한 살균 효과도 조사 하였다. 중합체 코팅 된 유리 슬라이드가 UV 또는 감마선 조사에 노출시켰다. PU134 코팅 유리 슬라이드의 위상차 촬상 더 심한 차이 UV 또는 감마선 (도 4A)를 배치하지 보였다. 이러한 관찰은 상기 SEM 분석 (도 4b)에 의해 확인되었다. PU134의 생물학적 성능 포스트 replating 십일에 hESC의 유래 간세포를 사용하여 조사 하였다. hESC의 유래γ-방사 PU134 코팅 유리 슬라이드에 도말 된 간세포는 UV-조사 PU134 코팅 된 유리 슬라이드 (도 4C) 상에 도말 된 세포 CYP3A 활성이 3 배 증가를 표시. 이러한 관찰은 감마 방사선 조사는 우리의 목적을위한 최적의 살균 기술이라고 설명했다.

그림 1
도 폴리 우레탄 코팅 된 표면 (134)의 1 최적화. (A) 유리 슬라이드는 다른 용매에 용해 PU134의 2 % 용액으로 코팅 하였다. 다른 코팅 된 유리 슬라이드의 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지는 테트라 히드로 푸란을 용매 (흑백 화살표)의 톨루엔, 클로로포름 또는 이들의 혼합물과 비교하여 사용 된 경우 균일 한 코팅면의 존재 및 중합체의 부재 석출물 보여준다. 이미지는 x1664 배율에서 찍은 바 아칸소 확장했다 이미지 아래에 표시 전자. (BC)의 원자 힘 현미경 (AFM)는 선택된 용매에 PU134 코팅 표면의 거칠기를 분석하는데 사용 하였다. 에 비해 거칠기 파라미터 RMS (루트 평균 제곱) (B)와 상이한 PU134 코팅 표면 라스 (평균 거칠기) (C)의 분석은 용매로서 테트라 히드로 푸란을 사용하여 얻은 코팅은 매끄러운 표면을 가지고 있음을 보여 조건의 나머지 (N = 7). 평균 ± SD, p <0.05 *, p <0.01은 **로 표시하며, p <0.001 테트라 히드로 가용화 PU134 코팅 슬라이드 비교 학생 t-테스트에 의해 측정 된, *** 나타낸다 나타낸 바와 같이 데이터가 표시된다. 오차 막대가 1 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

AYS "> 그림이
hESC의 파생 hepatoblasts의 그림 2 특성화. 간 마커 hESC의에서 AFP, CK19, HNF4α 및 알부민 (H9)의 면역 세포 화학 나타내는 표현은 간 내배엽 산출했다. 음의 컨트롤은 해당 면역 글로불린 G (IgG의) 대표 이미지가 표시됩니다 수행 하였다. 양성 세포 및 표준 편차의 비율은 볼 당 최소한 300 세포를 포함하는 뷰 중 적어도 다섯 랜덤 필드로부터 추정 하였다. 이미지는 20 배 배율로 촬영 하였다. 막대가 1 표준 편차를 나타내는 평균 ± 표준 편차 오류로 데이터가 표시됩니다. HNF4α, 간세포 핵 인자 4α; AFP, α-페토 프로테인; ALB, 알부민; CK19는 아세포 (19)는 IgG의 염소, 면역 글로불린 G 항 염소, IgG의 마우스, 면역 글로불린 G 항 - 마우스는. 여기를 클릭하세요 더 큰 versi를 볼 수 있습니다이 그림의에.

그림 3
그림 hESC의 유래 간세포의 기능에 PU134 코팅 표면의 지형의 3 기능 의미. 다른 용매에 용해 PU134로 코팅 된 유리 슬라이드에 96 시간 동안 유지 hESC의 유래 간세포에있는 시토크롬 P450 3A 활동의 측정. 테트라 히드로 푸란으로 용해 PU134 코팅 된 유리 슬라이드 상에 유지 세포 시토크롬 활성의 향상 (N = 6). 평균 ± SD, p <0.05로 표시되는 바와 같이 데이터가 표시되어 *, p <0.01 **로 표시하며, p <0.001로 코팅 된 슬라이드 유지 hESC의 유래 간세포에 비해 학생 t-테스트에 의해 측정 된, *** 나타낸다 PU134는 테트라 하이드로 퓨란에 용해. 오차 막대는 1 표준 편차를 나타냅니다.


도 4 표면 코팅의 살균을 최적화하는 방법. 위상차 이미지 (A) 또는 SEM 이미지 (B)는 γ-방사선 또는 자외선 (UV) 처리와 PU134 코팅 표면에는 육안 차이 보여. 위상차 이미지 1,664X의 배율 40 배 배율 SEM 이미지에서 촬영되었다. PU134 코팅 유리 슬라이드로 10 일간 유지 hESC의 유래 간세포의 사이토 크롬 P450 3A의 활동 (C) 분석. UV에 도말 세포와 비교하여 γ-방사 PU134 코팅 된 유리 슬라이드에 도말 세포에서 사이토 크롬 P450 3A의 활성의 증가는 PU134 코팅 된 유리 슬라이드를 조사. 활성의 단위는 ML -1 cm -2 배양 표면의 상대 광 단위 (RLU)로 표현된다 (N = 3). 데이터는 평균 ± 표준 편차, P <0.001로 표현 전*** γ-방사선에 의해 멸균 PU134 코팅 된 유리 커버 슬립에 유지 hESC의 유래 간세포에 비해 학생들의 t-테스트로 측정 표시 s의. 오차 막대가 1 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

차 항체
항원 유형 회사 희석
HNF4α 토끼 폴리 클로 날 산타 크루즈 1/100
알부민 마우스 단일 클론 시그마 1/500
AFP 마우스 단일 클론 ABCAM 1/500
아세포 19 마우스 단일 클론 다코 50분의 1
IgG의 마우스 단일 클론 다코 1/500
차 항체
안티 - 토끼 568 알렉사 밀가루 염소 인비 트 로젠 1/400
안티 - 마우스 488 알렉사 밀가루 토끼 인비 트 로젠 1/500

본 연구에서 사용 된 최적의 일차 및 이차 항체의 농도를 표 1 목록. HNF4α, 간세포 핵 인자 4α; AFP, α-페토 프로테인; 의 IgG, 면역 글로불린 G.

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Discussion

줄기 세포로부터 간세포를 생성하는 데 사용되는 현재의 방법의 대부분은 동물 유래의 미정 행렬에 의존한다. 이러한 기판은 어플리케이션에 상당한 장벽을 나타내는 세포의 기능과 안정성에 영향을 미치는, 비싸고 매우 가변적 일 수있다. 따라서, 우리는 줄기 세포 유래 간세포의 문화를 지원하는 합성 물질에 대한 화면을 수행 하였다. 우리가 식별 한 견고한 간세포 분화 방식과 조합 PHNGAD, MDI 및 증량제, 그 중합에 의해 형성된 단순 우레탄 (PU134)는, 간세포 표현형을 안정화 및 마트 리겔 (15)와 비교했을 때 세포의 기능을 향상시킨다.

같은 비트로 넥틴 (22), 라미닌 (521) 23 또는 매트 리겔 등 일반적으로 배양에 사용되는 생물학적 매트릭스를, 기존의 분화 줄기 세포의 처리, 단기간의 유지 보수를 위해 효과적이다. 대조적으로, PU134 코팅 표면 hepatocy위한 우수한 기질을 제공테 문화. 또한, 표면 지형과 고분자 살균의 최적화는 전지 성능, 신뢰할 수있는 성능과 규모에서 인간의 간 모델을 제공하는 핵심 요소의 추가 개선을 주도했다.

사슬 연장 제 및 페닐 이소시아네이트의 특성상 프로세스의 중요한 단계 중 하나를 나타내고; 제거 또는 크게 고분자 표면을 손상 성분 중 어느 것이 대체 따라서 셀룰러 접속 및 줄기 세포 유래 간세포의 기능적 활성 등. 중합체 조성물은 충격이 간세포 기능에 관여하는 주요 세포 외 기질 단백질을 흡수하는 중합체의 용량이 탄성 습윤성 24와 같은 물리적 매개 변수에 영향을 미친다. 또한, 촉매의 변동은, 반응 시간 및 온도는 중합체의 분자량 분포에 영향을 미친다.

용매의 선택은 고분자 재를 가용화최적화 된 폴리머 코팅 된 표면의 취득의 또 다른 중요한 점을 제시한다. 우리는 용매의 성질은 셀 25-31의 함수에 직접 영향을 갖는 코팅 표면의 지형에 영향을 미치는 것을 발견했다. 또한, 회전 시간 및 속도의이 균일하고 균질 한 코팅을 얻는 데 중요하다. 세포의 활성을 사용 멸균 처리에 의해 영향을받을 수 있으므로 고려하여 수행하는 또 다른 단계는, 중합체 코팅 된 표면에 도포 멸균 절차이다. 이것은 다른 멸균 방법 32-34에 중합체의 구조 내에서 감광 영역 (들)의 존재에 기인 할 수있다.

현재 만능 줄기 세포 기반 세포 모델은 표현형 및 기능적 한계를 가지고있다. 우리는 표면 코팅이 최적화 된 중합체가 생물학적 SUBST의 사용과 관련된 몇 가지 한계를 우회 분야에서 진보를 나타낸다고 믿는다환율. 또한, 3D 내의 중합체의 사용 가능성은 더욱 셀 충실도를 향상시킬 수있다, 관심 조직에서 발견되는 다양한 세포 종류의 부착을 지원하는 행렬.

결론적으로, 합성 재료의 사용은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 소마의 전달에서 점점 중요 해지고있다. 우리는 강력 최적화 된 표면 및 코팅 과정을 개발하고 안정적​​으로 셀 기반의 모델링 및 재생 의학을위한 중요한 의미와 기능 인간의 간세포를 제공했다.

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Disclosures

DCH는 CSO, FibromEd 제품 유한 회사의 이사, 설립자 FibromEd 제품 유한 회사 MB와 JPI의 주주 아르 설립자 주주입니다

Acknowledgments

DCH, MB와 FK는 기금에 EPSRC 사후에 의해 지원되었다. BL-V와 DS는 각 MRC의 박사 studentships에 의해 지원되었다. KC는 영국 재생 의학 플랫폼에서 자금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker Edmun Bühler KS-15
Irradiator CIS Biointernational IBL 637 
Spin coater Specialty Coating System P-6708
Scanning Electron Microscope  Philips XL30CPSEM
Atomic Force Microscope DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4 Promega V8902
UV bulb ESCO
NanoScope analysis software VEECO version 1.20
Fluorescence microscope Olympus TH45200 Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates Corning, UK  3527
glass slides Scientific Laboratory Supplies MIC3308
Diethylene glycol Sigma–Aldrich 93171
1,6-hexanediol Sigma–Aldrich 240117
Neopentyl glycol Sigma–Aldrich 408255
Adipic acid Sigma–Aldrich 9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide Sigma–Aldrich 227056
Diethyl ether Sigma–Aldrich 676845
titanium (IV) butoxide  Sigma–Aldrich 244112
1,4-butanediol  Sigma–Aldrich 493732
Vacuum oven Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) Sigma–Aldrich 101688
Tetrahydrofurane Sigma–Aldrich 401757
Sputter coater Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) Gibco 10010031 Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20    Scientific Laboratory Supplies Ltd EC607 
Methanol   Scientific Laboratory Supplies Ltd CHE5010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, UK A7906
MOWIOL 488 DAPI Calbiochem 475904 Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit Promega V8902
Hepatozyme Gibco 17705021
TryLE express Life Technologies 12604013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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