Stabiliserande Hepatocellulär Fenotyp Använda Optimerade Syntetiska Ytor

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denna artikel kommer att fokusera på att utveckla polymerbelagda ytor för långsiktig, stabil kultur av stamceller härstammar humana hepatocyter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucendo-Villarin, B., Cameron, K., Szkolnicka, D., Travers, P., Khan, F., Walton, J. G., Iredale, J., Bradley, M., Hay, D. C. Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces. J. Vis. Exp. (91), e51723, doi:10.3791/51723 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Biologiska material har använts i stor utsträckning i underhållet och differentiering av pluripotenta stamceller 1. Samtidigt som dessa biologiska substrat ofta innehåller en myriad av odefinierade komponenter. Matrigel är ett vanligt använt substrat för stamcellkultur och differentiering. Tyvärr påverkar dess varierande sammansättning cellfunktion och fenotyp. Även om en rad olika alternativ, mer definierade biologiska matriser använts 2-7, deras animaliskt ursprung eller dålig skalbarhet gör dem olämpliga kandidater för industriell tillverkning. Därför identifiering av syntetiska alternativ, med definierad sammansättning och tillförlitlig prestanda, är viktiga mål i stamcellsforskningen.

I ett försök att övervinna begränsningarna i odefinierade cellodling, har tvärvetenskapliga samarbeten mellan kemi och biologi identifierade syntetiska material med förmåga att stödja cellfenotyp. SynthEtic substrat är skalbar, kostnadseffektiv, och kan tillverkas i komplexa 3D-strukturer, imitera in vivo miljön. På grund av dessa egenskaper syntetiska substrat har ofta används för att stödja och driva differentiering av många celltyper 8-10.

Avancerade och hög genomströmning analyser har möjliggjort en snabb screening av syntetiska material, från stora bibliotek, och levereras nya material med flexibla fastigheter med breda tillämpningar inom biomedicinsk forskning och utveckling 11-13. Använda hög genomströmning, polymermikro array screening-teknik, vi snabbt identifierat en enkel polyuretan (PU134), lämplig för underhåll av mänskliga stamcells härledda hepatocyter. Denna polymer befanns vara överlägsna djur härledda substrat med avseende på hepatocyte differentiering och funktion 14-16. Vi har därefter optimerat beläggningsförhållanden, topografi och steriliseringsprocess för att få tillgång effekterpå polymer prestanda stabilisera hepatocyte funktion och livslängd. Detta har stor betydelse när det gäller att förstå grunderna i hepatocyte biologi för cellbaserad modellering och regenerativ medicin applikationer.

Den teknik som beskrivs här representerar ett exempel på hur ytan av en syntetisk polymer kan optimeras för att bevara cellfenotyp. Vi tror att kombinationen av denna teknik med en effektiv serumfritt hepatocyte differentiering protokollet har potential att ge en skalbar produktion av leverceller som används vid in vitro-modellering och regenerativ medicin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntes av PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / neopentylglykol / di (etylenglykol) -alt-adipinsyra] diol)

Schema 1

Schema 1: Syntes av PHNAGD Schematisk representation av syntesen av PHNAGD.. PHNAGD framställdes genom reaktion av 1,6-Hexanodiol, dietylenglykol, neoppentyl glykol och adipinsyra. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentylglykol / di (etylenglykol) -alt-adipinsyra] diol.

  1. Applicera värmebehandling till monomererna 1,6-hexandiol, di (etylenglykol) och neopentylglykol vid 40 ° C under 48 h i en vakuumugn för att avlägsna eventuellt kvarvarande vatten. Tillåt att kyla ned till RT under vakuum.
  2. Lägg 22 mmol av varje monomer och adipinsyra (55 mmol) till en två-halsad rundbottnad kolv utrustad med en omrörd bar och ansluten till en Dean-Stark-apparat.
  3. Placera hela församlingen under vakuum och försiktigt värma glassware vid 40 ° C under 6 h, i syfte att undvika fuktabsorption under tillsatsen av kemikalien in i kolven.
  4. Lägg via spruta, droppe för droppe, 0,0055 mol av katalysatorn titan (IV) butoxid.
  5. Rör om reaktionsblandningen vid 180 ° C, under en N2-atmosfär under 24 h och samla återstående vatten i Dean-Stark-fälla. Låt produkten svalna till rumstemperatur.

2. Syntes av PU134

Schema 2

Schema 2: Syntes av PU134 Schematisk representation av syntesen av polyuretan 134. PU134 framställdes genom reaktion av 1,0 ekv av en PHNGAD med 2,0 ekv av en 4,4 '-metylenbis (fenylisocyanat), följt av tillsats av 1,0. ekv av en 1,4-butandiol kedjeförlängare.

  1. Blanda en ekvivalent av polyol PHNGAD (Mn ~ 1800 Da, 3,2 mmol) med två ekvivalenter av 4'4-metylenbis (fenylisocyanat) (6,4 mmol) i vattenfri N, N-dimetylformamid (12 ml).
  2. Rör om reaktionsblandningen vid 70 ° C, under en N2-atmosfär.
  3. Lägg via spruta, droppe för droppe katalysator titan (IV) butoxid (0,8% vikt).
  4. Efter 1 h, tillsätt en ekvivalent av kedjeförlängaren 1,4-butandiol (3,2 mmol). Ökning av temperaturen vid 90 ° C och rör om under 24 h under en N2-atmosfär.
  5. Efter reaktionen uppsamlades den polyuretan genom utfällning genom tillsats av dietyleter (hexan eller vatten skulle också kunna användas) droppvis till reaktionslösningen tills utfällning sker.
  6. Centrifugera lösningen vid 5300 xg under 5 min.
  7. Dekantera supernatanten och torka vid 40 ° C i en vakuumugn, tills lösningsmedlet avdunstar.
    Notera: För att säkerställa att den slutliga produkten av reaktionen har de korrekta parametrarna avseende på molekylviktsfördelningen, det funktionella groups av polymeren och smälttemperaturerna och glasövergångs kan olika analytiska tekniker och metoder som kan användas, såsom gelkromatografi eller fitr spektroskopi.

3 Beredning av PU134 Solutions

  1. Väg upp 200 mg av PU134 i en glasflaska.
  2. Späd PU134 till en slutlig koncentration av 2% i ett antal lösningsmedel: kloroform, en blandning av kloroform och toluen i förhållandet 1: 1, tetrahydrofuran och kombinationen av tetrahydrofuran och diklormetan i 1: 1-förhållande.
    Obs: Val av rätt lösningsmedel varierar beroende på polymeren att använda. Olika lösningsmedel besitter olika kokpunkter som kan påverka solubilisering av polymeren.
  3. Skaka lösningen kraftigt under 20 min vid RT med användning av en skakanordning vid en hastighet av 200 MOT / min, tills lösningen blir homogen och ingen fällning observeras.

4 Beläggning av glasskivor med PU134

  1. Placera en round 15 mm 2 täckglas på spinnbeläggare.
  2. Applicera 50 | il av PU134 lösning till varje med användning av en pipett. Justera volymen för PU134 lösningen i enlighet därmed för önskad täckstorleken hålla volymen till ytan förhållandet proportionellt.
  3. Snurra varje täckglas för 7 sek vid 23 x g.
  4. Lufttorka täckglas vid rumstemperatur under minst 24 timmar före sterilisering.

5. Bestrålning av Cover

  1. Gamma-bestråla polymerbelagda täckglas genom att anbringa en dos på 10 Grays användning av en laboratorie irradiator för 12 min.
  2. UV bestråla polymerbelagda täckglas med hjälp av en 30 W, UV-lampa för 16 min på varje sida.
  3. Placera den polymerbelagda täckglas i ett lämpligt vävnadsodlingsplatta enligt sliden storlek.

6. Svepelektronmikroskopi

  1. Guld coat polymertäck genom sputtering efter 200 sekunder i en atmosfär av 5 x 10 -1 millibar tryck.
  2. Fånga micrographs av polymerbelagda täckglas med hjälp av ett svepelektronmikroskop med en accelererande spänning på 20 kV i sekundärelektronbildläge.

7. atomkraftsmikroskopi Observationer

  1. Scanna en yta på 20 x 20 | im av polymerytan.
  2. Sätt upp en avsökningshastighet från 1,32 Hz till 1,60 Hz.
  3. Inrätta en upplösning på 512 x 512 pixlar i skannade området.
  4. Beräkna effektivvärde (RMS eller Rq) i beläggningen genom att använda genomsnittet av höjdavvikelser som tas från den genomsnittliga bilddataplan, uttryckt som:

    Där Zi är det aktuella Z-värdet, och N är antalet punkter inom visst område.
  5. 7.5 Beräkna avvikelsen eller menar ytjämnhet (Ra) för bilden med,

    Där Z (x) är den funktion som beskriver tHan ytan profil analyseras i termer av höjd (Z) och position (x) av provet under utvärderingslängden "L". Ra representerar medelvärdet av ytan i förhållande till mittplanet.

8 Cell Culture och differentiering

  1. Kultur och differentiera mänskliga embryonala stamcellslinje (hESC) H9 som beskrivs i Hay 17.
  2. Drag av celler med användning av en dissociation reagens och förnyad utbredning dem på PU134 belagda objektglas på dag 9 av differentieringsprocessen, i närvaro av ett serumfritt medium som beskriva i Szkolnicka 18,19.
    Obs: Användningen av en enzymatisk cell dissociation är att föredra till fysisk cell lossnar.

9. Cytokrom P450 funktionell analys

  1. Mät CYP3A-aktivitet enligt tillverkarens anvisningar.
  2. Inkubera hESC härledda hepatocyter vid dag 13 eller dag 19, och media utan celler - som en negativ kontroll, med lämplig substråt för 5 timmar vid 37 ° C.
  3. Samla supernatanter från celler och media, utföra analysen enligt tillverkarens anvisningar.
  4. Mäta nivån av CYP-aktivitet och normaliserade i förhållande till den yta (cm 2).

10. Immunofärgning

  1. Tvätta hESC härledda hepatocyter med PBS, under 1 min, upprepa två gånger.
  2. Lägg iskall 100% metanol för att fixa celler, plats i -20 ° C i 10 min.
  3. Tvätta cellerna med PBS under 5 min och upprepa två gånger.
  4. Inkubera cellerna med PBS / T (0,1% tween) / 10% BSA under 1 h vid RT.
  5. Aspirera PBST-lösning och tillsätt en lämplig primär antikropp utspädd i PBS / T (0,1% tween) / 1% BSA, inkubera vid 4 ° C med försiktig omrörning O / N.
  6. Tvätta cellerna med PBS / T (0,1% tween) / 1% BSA under 5 min och upprepa tre gånger.
  7. Späd den lämpliga antikroppen i PBS / T (0,1% tween) / 1% BSA, lägga till cellerna och inkubera i mörker vid RT i 1 h med försiktig omrörning.
  8. Tvätta cellerna med PBS under 5 min och upprepa tre gånger.
  9. Lägg MOWIOL 488 (innehållande DAPI 1: 1,000) till varje brunn, lägg på ett täckglas försiktigt för att minska antalet luftbubblor. Store fasta celler vid 4 ° C i mörker. Beakta färgning med hjälp av ett mikroskop med lämpligt filter och lysrör. De optimerade primära och sekundära antikroppar är listade i tabell 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Polymer lösningsmedel påverkar topografin av polymeren belagd yta

Polyuretan 134 löstes i kloroform, antingen ensamt eller i kombination med toluen eller tetrahydrofuran eller diklormetan och glas spinn beläggs med olika formuleringar. Svepelektronmikroskopi (SEM) och atomkraftsmikroskopi (AFM) användes för att karakterisera de fysikaliska egenskaperna hos polymerbeläggningarna (figur 1). Beläggningen erhålles med användning av toluen eller kloroform var inte homogen, vilket visar en ojämn beläggning med PU134 utfällning (Figur 1A). Däremot tetrahydrofiiran var ett lämpligt lösningsmedel låta spinnbeläggning av en mycket mer enhetlig yta (Figur 1A). Ytans topografi mättes med AFM hjälp av effektivvärde (RMS) och genomsnittlig råhet (Ra). PU134 löst tetrahydrofiiran uppvisade en minskning 40% av ojämnheter i jämförelse till the andra lösningsmedel (Figur 1B och 1C). Dessa data visar att användningen av tetrahydrofuran som lösningsmedel ger en mer likformig beläggning av PU134 för biologisk tillämpning.

Polymer topografi har en betydande inverkan på hepatocyte funktion

hESC kan effektivt differentieras till lever endoderm in vitro, uppvisar många av de funktioner som finns i den vuxna levern 17-20. Lever endoderm differentiering inducerades och vid dag 9 hepatoblast liknande celler var uppenbar, med majoriteten av celler som uttrycker cytokeratin 19 (99% ± 1,2), α-fetoprotein (99% ± 0,6) och hepatisk nukleär faktor 4α (97% ± 2,6); och låga nivåer av albumin (20% ± 1,7) (Figur 2). Vid denna punkt cellerna lossnar med hjälp TrypLE uttrycka och replated på de olika polymerbelagda ytor. Som ett mått på metabolisk funktion, cytokrom P450 fsmörjelse bedömdes 4 dagar efter omstryka. Vi observerade en 2-faldig ökning av metabolisk aktivitet i celler replated på tetrahydrofiiran / PU134 belagda ytor (Figur 3). Dessa resultat visar att hESC härledda hepatocyt metabolisk aktivitet har förbättrats och en mer likformig beläggning av PU134, är detta förenligt med tidigare metoder 21.

Ytsterilisering påverkan på de bioaktiva egenskaperna hos polymeren

Effekten av sterilisering på PU134 prestanda undersöktes också. Polymerbelagda glasskivor exponerades för UV-eller gammastrålning. Faskontrast avbildning av PU134 belagda glasskivor uppvisade inga grova skillnader posta UV eller gammastrålning (Figur 4A). Dessa observationer bekräftas ytterligare av SEM-analys (Figur 4B). Den biologiska prestanda PU134 undersöktes med hjälp av stamceller från mänskliga embryon härledda hepatocyter på 10 dagar efter omstryka. hESC härleddahepatocyter återutströks på γ-strålad PU134 belagda objektglas visade en 3-faldig ökning av CYP3A-aktivitet över cellerna återutströks på UV-strålnings PU134 belagda objektglas (Figur 4C). Dessa observationer visade att gamma-bestrålning var den optimala steriliseringsteknik för våra ändamål.

Figur 1
Figur 1 Optimering av polyuretan 134 belagda ytan. (A) glasskivor överdrogs med en 2% lösning av PU134 löses i olika lösningsmedel. Svepelektronmikroskopi (SEM) bilder av de olika belagda objektglas visar närvaron av ett homogent belagda ytan och frånvaro av polymeren utfälles när tetrahydrofuran användes jämfört med toluen, kloroform eller blandningar av lösningsmedlen (svarta och vita pilar). Bilderna togs vid x1664 förstoring och skalor barer ar e nedan bilderna. (BC) atomkraftsmikroskopi (AFM) användes för att analysera den råhet PU134 belagda ytor på utvalda lösningsmedel. Analys av skrovlighet Parametrar RMS (root mean square) (B) och RA (medelvärdet strävhet) (C) av de olika PU134 belagda ytor visar att beläggningen erhålles genom användning av tetrahydrofuran som lösningsmedel hade den slätaste ytan i jämförelse med den resten av villkoren (n = 7). Data uttrycks som medelvärde ± SD, p <0,05 betecknas *, p <0,01 betecknas **, och p <0,001 betecknas ***, mätt genom studenter t-test i jämförelse med diabilder belagda med PU134 löses i tetrahydrofuran. Felstaplar representerar en standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ays "> Figur 2
Figur 2 Beskrivning av de hESC härledda hepatoblaster. Immuncytokemi visar uttryck av levermarkörer AFP, CK19, HNF4α och albumin i hESC (H9) härstammar lever endoderm. Negativa kontroller utfördes med motsvarande immunglobulin G (IgG) och representativa bilder visas. Andelen positiva celler och standardavvikelse beräknades från minst fem slump synfält som innehåller minst 300 celler per view. Bilderna togs vid 20X förstoring. Data uttrycks som medelvärde ± SD Felstaplar representerar en standardavvikelse. HNF4α, Hepatocyte nukleär faktor 4α; AFP, α-fetoprotein; ALB, albumin; CK19, Cytokeratin 19 IgG get, immunglobulin G anti-get, IgG mus, immunglobulin G anti-mus. Klicka här för att se en större vepå denna figur.

Figur 3
Figur 3. Funktionella konsekvenser av topografi PU134 belagda ytan på funktionen av stamceller från mänskliga embryon härledda leverceller. Mätning av cytokrom P450 3A aktivitet på hESC-derived hepatocyter bibehållas under 96 h på objektglas belagda med PU134 löst i olika lösningsmedel. En förbättring av i cytokrom aktivitet på celler som upprätthålls på PU134 belagda glasskivor löses med tetrahydrofuran (n = 6). Data uttrycks som medelvärde ± SD, p <0,05 betecknas *, p <0,01 betecknas **, och p <0,001 betecknas ***, mätt genom studenter t-test i jämförelse med hESC härledda hepatocyter hållna på objektglas belagda med PU134 solubiliseras på tetrahydrofuran. Felstaplar representerar en standardavvikelse.


Figur 4 Optimering av sterilisering av de belagda ytorna. Bilder faskontrast (A) eller SEM-bilder (B) visar inga stora skillnader i PU134 belagda ytan mellan γ-strålning eller UV-strålning (UV) behandlingar. Fas kontrastbilder togs vid 40X förstoring och SEM-bilder på 1,664X förstoring. (C) Analys av cytokrom P450 3A aktivitet på hESC härledda hepatocyter hållas i 10 dagar på PU134 belagda glasskivor. En ökning av cytokrom P450 3A-aktivitet i celler ströks åter ut på γ-strålad PU134 belagda objektglas vid jämförelse med celler ströks åter ut på UV-strålnings PU134 belagda objektglas. Aktivitet uttrycks som relativa ljusenheter (RLU) ml -1 cm -2 kulturytan (n = 3). Data uttrycks som medelvärde ± SD, p <0,001 is betecknas *** mäts av studenter t-test i jämförelse med hESC härledda hepatocyter som upprätthålls på PU134 belagda täckglas steriliserade av γ-strålning. Felstaplar representerar en standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Primära antikroppar
Antigen Typ Företag Utspädning
HNF4α Kanin polyklonala Santa Cruz 1/100
Albumin Mus-monoklonal Sigma 1/500
AFP Mus-monoklonal Abcam 1/500
Cytokeratin 19 Mus-monoklonal Dako 1/50
IgG Mus-monoklonal Dako 1/500
Sekundära antikroppar
Anti-kanin 568 Alexa Mjöl Goat Invitrogen 1/400
Anti-mus 488 Alexa Mjöl Kanin Invitrogen 1/500

Tabell 1 Förteckning över optimerade primära och sekundära antikroppar och koncentrationer som användes i denna studie. HNF4α, Hepatocyte nukleär faktor 4α; AFP, α-fetoprotein; IgG, Immunoglobulin G.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Många av de nuvarande metoder som används för att generera leverceller från stamceller beroende av odefinierade matriser av animaliskt ursprung. Dessa substrat kan vara kostsamt och mycket varierande, vilket påverkar cellernas funktion och stabilitet, vilket innebär ett betydande hinder för ansökan. Därför genomförde vi en skärm för syntetiska material som stöder kulturen i stamcells härledda hepatocyter. Vi har identifierat, en enkel polyuretan (PU134), som bildas genom att polymerisera PHNGAD, MDI och ett utdrygningsmedel, som i kombination med en robust hepatocyte differentiering tillvägagångssätt stabiliserar hepatocyte fenotyp och förbättrar cellfunktion vid jämförelse med matrigel 15.

Hantering av befintliga biologiska matriser, som vanligen används i odling och differentierande stamceller såsom vitronektin 22, laminin 521 23 eller matrigel, är effektivt för korttids underhåll. Däremot PU134 belagda ytor tillhandahåller en överlägsen substrat för hepatocyte kultur. Dessutom har optimering av ytans topografi och polymer sterilisering ledde till ytterligare förbättringar av cellprestanda, en viktig faktor för att leverera humana lever modeller på skalan med pålitlig prestanda.

Arten av kedjeförlängaren och fenylisocyanat representerar en av de kritiska stegen i processen; som eliminering eller utbyte av någon komponent skulle avsevärt försämra polymerytan och därmed den cellulära fastsättning och funktionella aktiviteten av stamcells härledda hepatocyter. Sammansättningen av polymeren påverkar fysikaliska parametrar såsom elasticitet och vätbarhet 24, som har effekter kapaciteten hos polymeren att absorbera viktiga extracellulära matrisproteiner som är involverade i hepatocyt-funktion. Dessutom variationer i katalysatorn, reaktionstiden och temperaturen påverkar molekylviktsfördelningen för polymeren.

Valet av lösningsmedel för att solubilisera polymeren representerar en annan viktig punkt i att erhålla en optimerad polymerbelagd yta. Vi har observerat att den typ av lösningsmedlet påverkar topografi belagda ytan, som har direkta konsekvenser i funktionen hos cellerna 25-31. Dessutom spinn tid och hastighet är också avgörande för att erhålla denna enhetliga och homogen beläggning. Ett annat steg för att ta i beaktande är steriliseringsproceduren anbringas på den polymerbelagda ytan, såsom aktiviteten hos cellerna kan påverkas av den steriliseringsbehandling användas. Detta kan bero på förekomst av känsligt område (n) inom strukturen av polymeren till olika steriliseringsförfaranden 32-34.

Aktuella pluripotenta stamceller baserade cellmodeller har fenotypiska och funktionella begränsningar. Vi tror att denna optimerade polymerbelagda ytan utgör ett framsteg på området, att kringgå vissa av de begränsningar som är förknippade med användningen av biologiska substpriser. Dessutom, möjligheten att använda polymeren inom 3D-matriser för att stödja fästandet av olika cellulära typer har hittats i vävnaden av intresse, kan ytterligare förbättra cell trohet.

Sammanfattningsvis är användningen av syntetiska material blir allt viktigare i leveransen av mänskliga soma från pluripotenta stamceller. Vi har utvecklat en optimerad yta och beläggningsförfarande som är robust och pålitligt levererar funktionella humana hepatocyter med betydande konsekvenser för cellbaserad modellering och regenerativ medicin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DCH är CSO, direktör, grundare och delägare i FibromEd Products Ltd MB och JPI är grundare aktieägare i FibromEd Products Ltd

Acknowledgments

DCH, MB och FK främjades av ett EPSRC Följ på fonden. BL-V och DS var och stöds av MRC doktorandtjänster. KC stöddes genom finansiering från Storbritannien regenerativ medicin Platform.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker Edmun Bühler KS-15
Irradiator CIS Biointernational IBL 637 
Spin coater Specialty Coating System P-6708
Scanning Electron Microscope  Philips XL30CPSEM
Atomic Force Microscope DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4 Promega V8902
UV bulb ESCO
NanoScope analysis software VEECO version 1.20
Fluorescence microscope Olympus TH45200 Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates Corning, UK  3527
glass slides Scientific Laboratory Supplies MIC3308
Diethylene glycol Sigma–Aldrich 93171
1,6-hexanediol Sigma–Aldrich 240117
Neopentyl glycol Sigma–Aldrich 408255
Adipic acid Sigma–Aldrich 9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide Sigma–Aldrich 227056
Diethyl ether Sigma–Aldrich 676845
titanium (IV) butoxide  Sigma–Aldrich 244112
1,4-butanediol  Sigma–Aldrich 493732
Vacuum oven Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) Sigma–Aldrich 101688
Tetrahydrofurane Sigma–Aldrich 401757
Sputter coater Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) Gibco 10010031 Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20    Scientific Laboratory Supplies Ltd EC607 
Methanol   Scientific Laboratory Supplies Ltd CHE5010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, UK A7906
MOWIOL 488 DAPI Calbiochem 475904 Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit Promega V8902
Hepatozyme Gibco 17705021
TryLE express Life Technologies 12604013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125, (15), 3630-3635 (2012).
  2. Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30, (27), 4695-4699 (2009).
  3. Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11, (11), 2936-2943 (2010).
  4. Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26, (31), 6194-6207 (2005).
  5. Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102, (1), 13-22 (2005).
  6. Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26, (19), 4171-4179 (2005).
  7. Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50, (7), 645-652 (2006).
  8. Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101, (1), 13-22 (2013).
  9. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3, (3), 034112 (2008).
  10. Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32, (12), 3220-3232 (2011).
  11. Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30, (6), 1045-1055 (2009).
  12. Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31, (8), 2216-2228 (2010).
  13. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4, (1335), (2013).
  14. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2, (7), 505-509 (2013).
  15. Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6, (2), 92-102 (2011).
  16. Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1, (1), 50-53 (2012).
  17. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (34), 12301-12306 (2008).
  18. Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
  19. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3, (2), 141-148 (2014).
  20. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  21. Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33, (1-2), 15-30 (1998).
  22. Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26, (9), 2257-2265 (2008).
  23. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, (3195), (2014).
  24. Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25, (1), 336-370 (2003).
  25. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13, (8), 1879-1891 (2007).
  26. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, (10), 1881-1892 (2003).
  27. Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231, (1), 28-37 (2008).
  28. Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5, (4), 273-280 (2006).
  29. Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28, (1), 1806-1819 (2007).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  31. Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19, (19), 2775-2779 (2007).
  32. Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23, (3), 305-311 (2013).
  33. Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169, (2), 177-185 (2005).
  34. Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77, (1), 103-109 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics