चूहे में मॉडलिंग स्ट्रोक: दूरस्थ मध्य मस्तिष्क धमनी की स्थायी जमावट

* These authors contributed equally
Medicine
 

Summary

मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) के विभिन्न murine मॉडल व्यापक रूप से प्रयोगात्मक मस्तिष्क अनुसंधान में इस्तेमाल किया जाता है. यहाँ, हम मानव इस्कीमिक स्ट्रोक के बहुमत द्वारा लगाए गए नुकसान को इसी आकार के अनुरूप cortical रोधगलन पैदा करता है जो transcranial स्थायी बाहर का MCAO का मॉडल प्रदर्शित करता है.

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Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery. J. Vis. Exp. (89), e51729, doi:10.3791/51729 (2014).

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Abstract

स्ट्रोक मृत्यु का तीसरा सबसे आम कारण है और विकसित देशों में अधिग्रहण वयस्क विकलांगता का एक मुख्य कारण है. केवल बहुत सीमित चिकित्सा संबंधी विकल्पों तीव्र चरण में स्ट्रोक रोगियों के एक छोटे से अनुपात के लिए उपलब्ध हैं. वर्तमान शोध अधिकता उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के लिए खोज कर रहा है और अधिक रोगियों को एक लंबे समय के खिड़की में उपचारात्मक उपायों के लिए पात्र हो सकता है, क्योंकि तेजी से स्ट्रोक के बाद उप तीव्र और जीर्ण अवस्था पर ध्यान दे रहा है. ये देरी तंत्र इस तरह के स्ट्रोक के बाद सूजन, angiogenesis, neuronal plasticity और उत्थान के रूप में महत्वपूर्ण pathophysiological रास्ते में शामिल हैं. इन तंत्र का विश्लेषण करने के लिए और बाद में उपन्यास दवा लक्ष्य का मूल्यांकन करने के लिए, नैदानिक ​​प्रासंगिकता, कम मृत्यु दर और उच्च reproducibility के साथ प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल के बाद की मांग कर रहे हैं. इसके अलावा, चूहों एक केंद्र स्ट्रोक घाव प्रेरित किया जा सकता है, जिसमें और ट्रांसजेनिक मॉडल की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए जो सबसे छोटे स्तनधारी हैंउपलब्ध. इसलिए, हम यहाँ transcranial के माउस मॉडल, lenticulostriatal धमनियों, तथाकथित "जमावट मॉडल" के विद्युतातांचन बाहर के माध्यम से मध्य मस्तिष्क धमनी की स्थायी जमावट का वर्णन. इस मॉडल में जिसके परिणामस्वरूप रोधगलितांश मुख्य रूप से प्रांतस्था में स्थित है; मस्तिष्क के आकार के संबंध में रिश्तेदार रोधगलितांश मात्रा मानव स्ट्रोक के बहुमत से मेल खाती है. इसके अलावा, मॉडल reproducibility और कम मृत्यु दर के उपर्युक्त मानदंडों को पूरा. इस वीडियो में हम "जमावट मॉडल" में स्ट्रोक प्रेरण की शल्य चिकित्सा पद्धतियों का प्रदर्शन और ऊतकीय और कार्यात्मक विश्लेषण उपकरणों की रिपोर्ट.

Introduction

स्ट्रोक मृत्यु का तीसरा सबसे आम कारण है और विकसित देशों 1 में हासिल कर ली वयस्क विकलांगता का एक मुख्य कारण है. के बारे में 15% एक intracerebral नकसीर 2 के कारण होता है, जबकि इस तीव्र स्नायविक रोग के लगभग 80% मस्तिष्क रक्त के प्रवाह की एक बाधा से उत्पन्न मस्तिष्क ischemia के कारण होता है. चल रहे अनुसंधान के बावजूद, ऊतक plasminogen उत्प्रेरक की नसों में प्रशासन अब तक और केवल उपलब्ध स्ट्रोक रोगियों के एक अल्पसंख्यक के कारण 3,4 शुरुआत झटके के बाद 4.5 घंटे से कम अनुमोदित समय खिड़की को इस्कीमिक स्ट्रोक के लिए केवल अनुमोदित औषधीय उपचार है. ठीक से मस्तिष्क, वाहिका संरचना और स्ट्रोक के दौरान प्रणालीगत pathophysiological तंत्र के बीच जटिल संबंधों मॉडल कर सकते हैं जो कोई इन विट्रो मॉडल, वहाँ के रूप में, पशु मॉडल preclinical स्ट्रोक अनुसंधान के लिए आवश्यक हैं.

इसलिए, कई इस्कीमिक स्ट्रोक मॉडल एक vari में विकसित किया गया हैप्रजातियों के ety. सबसे अधिक इस्तेमाल किया स्ट्रोक मॉडलों में से एक एक सीवन फिलामेंट क्षणिक आंतरिक मन्या धमनी में पेश किया और टिप रक्त प्रवाह की एक बंद है, जिसके परिणामस्वरूप मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के मूल occludes तक अग्रेषित किया जाता है, जहां "रेशा मॉडल" है और subcortical और लंबे समय तक रोड़ा के मामले में भी cortical क्षेत्रों 5,6 के बाद मस्तिष्क रोधगलन. इस्कीमिक स्ट्रोक के photothrombotic मॉडल में, विकिरणित cortical पोत के एक प्रकाश रासायनिक रोड़ा छोटे, स्थानीय स्तर पर घिरा घावों 7 में जिसके परिणामस्वरूप एक photosensitizer के इंजेक्शन के बाद हासिल की है. lenticulostriatal धमनियों की एमसीए बाहर की स्थायी रोड़ा धमनी अपने क्षणिक संपीड़न का एक बंधाव से या स्थायी जमावट 8,9 के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. इस मॉडल में एमसीए का रोड़ा lentic को बाहर का है, क्योंकि इस मॉडल में जिसके परिणामस्वरूप रोधगलितांश मुख्य रूप से neocortex 10 को प्रभावित करता हैबेसल ganglia जो आपूर्ति ulostriatal धमनियों,.

मानव स्ट्रोक घावों के बहुमत मध्य मस्तिष्क धमनी के क्षेत्र में स्थित हैं, आम स्ट्रोक के सभी मॉडल एमसीए के occlusions या अपनी शाखाओं में 11 में से एक जैसे लगते हैं. एमसीए मस्तिष्क को रक्त की आपूर्ति प्रदान करता है कि प्रमुख धमनियों में से एक है; यह पार्श्व परिखा साथ आंतरिक मन्या धमनी, मार्गों से उठता है, जहां यह तो बेसल ganglia और ललाट, पार्श्विका और प्राथमिक मोटर और संवेदी प्रांतस्था सहित अस्थायी lobes, के पार्श्व सतहों के लिए शाखाओं और परियोजनाओं. सही और एमसीए छोड़ दिया पूर्वकाल मस्तिष्क धमनियों से जुड़ा है और पीछे विलिस के सर्किल (चित्रा 1) बनाने, पीछे मस्तिष्क धमनियों से कनेक्ट जो धमनियों, संवाद कर रहे हैं.

जैसा कि पहले कारमाइकल एट अल. 11 द्वारा रिपोर्ट, बाहर का मध्य मस्तिष्क एर से मॉडलिंग दौरेचूहों में tery आड़ (MCAO) मॉडल जिससे cortical एमसीए क्षेत्र 11,12 में स्थित हैं जो मानव स्ट्रोक घावों के बहुमत नकल उतार गोलार्द्ध के बारे में 10-15% धरना. 1981 में, Tamura एट अल. चूहों 8 में एक स्थायी, transcranial MCAO जमावट मॉडल का वर्णन किया. हालांकि, Tamura द्वारा वर्णित मॉडल धमनी का अधिक बाहर का विभाजन नाकाम करने के क्रम में एमसीए के एक समीपस्थ रोड़ा शामिल किया गया. इस प्रकार, मूल "Tamura मॉडल" 6 "रेशा मॉडल" से प्राप्त घावों के समान ही नहीं cortical लेकिन यह भी स्ट्रिआटल घावों, लाती है. यहाँ, हम चूहों में transcranial विद्युतातांचन द्वारा स्थायी बाहर का MCAO मॉडल का वर्णन. इसके अतिरिक्त, हम इस मॉडल में स्ट्रोक परिणाम का विश्लेषण करने के लिए संबंधित ऊतकीय और कार्यात्मक तरीकों की रिपोर्ट. सभी तरीकों का विकास और हमारी प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता मानक संचालन प्रक्रिया पर आधारित हैं.

Protocol

आचार बयान

इस वीडियो में रिपोर्ट प्रयोगों प्रायोगिक पशुओं और प्रोटोकॉल के उपयोग के लिए राष्ट्रीय दिशा निर्देशों जर्मन सरकारी समितियों (Regierung वॉन Oberbayern, म्यूनिख, जर्मनी) द्वारा अनुमोदित किया गया के अनुसार आयोजित किया गया. 10 सप्ताह पुराने, पुरुष C57BL/6J चूहों इस अध्ययन में इस्तेमाल कर रहे हैं. जानवरों के एक 12 घंटा प्रकाश अंधेरे चक्र अवधि और स्थानीय सरकारी समिति ने मंजूरी दे दी है. analgesia और बेहोश करने की क्रिया प्रोटोकॉल में वर्णित हैं pelleted भोजन और पानी यथेच्छ के उपयोग के साथ, नियंत्रित तापमान (22 ± 2 डिग्री सेल्सियस) के तहत रखे गए थे लेकिन अलग हो सकता है अन्य प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल से.

1. सामग्री की तैयारी और उपकरण

  1. गर्म आपरेशन क्षेत्र को बनाए रखने और संज्ञाहरण के दौरान माउस शरीर का तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) बनाए रखने के लिए गर्मी कंबल कनेक्ट करें.
  2. तैयार करें autoclaved कैंची, संदंश और सूती वस्त्रों, dexpanthenol नेत्र मरहम और सिवनी सामग्री. हाइड्रेटेड आपरेशन क्षेत्र बनाए रखने के लिए (सुई) के बिना नमकीन घोल के साथ एक सिरिंज तैयार करें. संज्ञाहरण गैस (70% एन 2 ओ + 30% ओ 2 + isoflurane) तैयार करें.
  3. Intraperitoneally दर्दनाशक दवाओं इंजेक्षन: Metamizol 200 मिलीग्राम / किग्रा, Carprofen 4 मिलीग्राम / किग्रा और Buprenorphin 0.1 मिलीग्राम / किग्रा.
  4. शरीर का सहज आंदोलन जब तक यह anesthetize के लिए 4% की isoflurane प्रवाह की दर के साथ प्रेरण कक्ष में माउस रखें और दृढ़रोम बंद हो जाता है.
  5. संज्ञाहरण नकाब में अपनी नाक के साथ पार्श्व स्थिति में माउस स्थानांतरण और कम तो लगभग एक मिनट के लिए 4% पर isoflurane एकाग्रता बनाए रखने और इसे approx.1.5% पर उचित संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए.
  6. दोनों आंखों पर dexpanthenol नेत्र मरहम लागू करें.

2. दूरस्थ MCAO मॉडल

  1. शल्य साइट usin की aseptical तैयारी के बाद छोटे आपरेशन कैंची का उपयोग कान और आंख के बीच एक 1 सेमी त्वचा चीराजी त्वचा कीटाणुनाशक.
  2. त्वचा को अलग और अस्थायी पेशी स्थानीय बनाना.
  3. उच्च आवृत्ति जनरेटर में जमावट समारोह, द्विध्रुवी मोड का चयन करें, 12 डब्ल्यू चयन और केबल के साथ विद्युतातांचन संदंश कनेक्ट.
  4. खारा की एक बूंद जोड़ें और पूरी तरह से मांसपेशी को हटाने के बिना एक मांसपेशी फ्लैप बनाने, जिससे अपने शिखर और पृष्ठीय भाग में खोपड़ी से अस्थायी पेशी से अलग करने के संदंश का उपयोग करें.
  5. लौकिक क्षेत्र के व्याख्यान चबूतरे वाला भाग में, रेट्रो कक्षीय साइनस (2A चित्रा) के लिए पृष्ठीय, पारदर्शी खोपड़ी नीचे एमसीए पहचानें. एमसीए विभाजन (कारण एक संरचनात्मक सामान्य बदलाव करने के लिए) दिखाई नहीं देता है, तो सबसे व्याख्यान चबूतरे वाला पोत की पहचान.
  6. यह एक पतली और पारदर्शी बनावट (चित्रा 2 बी) है जब तक सही एमसीए शाखा ऊपर ड्रिल के साथ हड्डी बाहर खोपड़ी और पतली पर कुछ खारा जोड़ें.
  7. ध्यान एक बहुत पतली संदंश के साथ धमनी के ऊपर हड्डी वापस ले लें.
  8. द्विध्रुवी मोड का चयन करें मैंएन 7 डब्ल्यू जमना पर उच्च आवृत्ति जनरेटर विद्युतातांचन साथ धमनी समीपस्थ और विभाजन (चित्रा -2) को बाहर का संदंश. विभाजन की वजह से एक संरचनात्मक संस्करण के लिए दृश्यमान नहीं है, लगभग दो स्थलों पर सही ढंग से पहचान एमसीए शाखा (ऊपर देखें) जमना. 1mm दूरी. यह ऊपर से दोनों पक्षों पर संदंश के साथ सावधानी से धमनी छू, जमावट के लिए संदंश के साथ धमनी काबू करने के लिए आवश्यक नहीं है पर्याप्त है और कम यांत्रिक क्षति लाती है.
  9. 30 मिनट रुको और धीरे वजह से सहज recanalization के लिए किसी भी रक्त के प्रवाह के लिए जाँच करने के लिए एक पा संदंश के साथ धमनी स्पर्श. Recanalization के मामले में एक बार विद्युतातांचन दोहराएँ.
  10. गड़गड़ाहट छेद को कवर, अपनी स्थिति को अस्थायी मांसपेशी स्थानांतरित करना.
  11. घाव सिवनी और संज्ञाहरण से उबरने और पिंजरे को वापस करने के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर एक नर्सिंग बॉक्स में जानवरों की जगह. सामान्य तौर पर यह anesth से उबरने के लिए पशु के लिए 5-10 मिनट लगते हैंesia.
  12. पांचवें पश्चात दिन तक दैनिक फिर 24 घंटे के बाद पश्चात analgesia (आईपी) इंजेक्षन और: Carprofen 4 मिलीग्राम / किग्रा.

3. शाम ऑपरेशन

उजागर धमनी coagulating नहीं के लिए छोड़कर - खोपड़ी और अपने को हटाने के पतले - सहित ऊपर वर्णित आपरेशन को हूबहू सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन.

4. सिलेंडर टेस्ट 13

  1. एक पारदर्शी ऐक्रेलिक ग्लास सिलेंडर में पशु प्लेस (व्यास: 8 सेमी, ऊँचाई: 25 सेमी) के 5 मिनट के लिए दो दर्पण और वीडियो टेप के सामने. एक इष्टतम वीडियो (चित्रा 3) प्राप्त करने के लिए दो दर्पण के सामने और सिलेंडर में केंद्रीय कैमरे को समायोजित.
  2. स्वतंत्र forelimb उपयोग के मूल्यांकन के लिए, पूर्ण पीछे दौरान एक forelimb के साथ सिलेंडर दीवार के स्कोर (1) संपर्क और पूर्ण रियर के बाद फर्श पर केवल एक forelimb साथ (2) लैंडिंग. धीमी गति या फ्रेम दर fr का उपयोग कर एक forelimb के लिए कम से कम 20 संपर्कों गणनावीडियो लैन क्लाइंट के एएमई समारोह (वीएलसी) फ्रीवेयर सॉफ्टवेयर ( http://www.videolan.org/vlc ).
  3. सर्जरी से पहले आधारभूत विश्लेषण के लिए: परीक्षणों के बीच एक 1 घंटे तोड़ने के साथ, माउस प्रति दो बार परीक्षण प्रदर्शन करते हैं. Forelimb उपयोग बाईं तरफा / सही, स्वतंत्र forelimb उपयोग के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है.
  4. एमसीए जमावट के बाद: उपरोक्त संकेत के रूप में परीक्षणों के बीच एक 1 घंटे तोड़ने के साथ, माउस प्रति दो बार फिर से परीक्षण करते हैं.

5. छिड़काव

  1. (Ketamine और xylazine क्रमशः 120/16 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन, द्वारा जैसे,) जानवरों बेहोश करना.
  2. एक लापरवाह स्थिति में पशु फिक्स और एक औसत कटौती के साथ उदर गुहा खुला. Rips और उरोस्थि निकालें. सही आलिंद में एक छोटा सा चीरा बनाओ. बाएं वेंट्रिकल में एक छिड़काव प्रवेशनी डालें और धीरे धीरे खारा की 20 मिलीलीटर के साथ छिड़कना.
  3. , पशु सिर काटना calvaria खोलने और धीरे खोपड़ी के आधार से मस्तिष्क अलग.

6. रोधगलितांश Volumetry

  1. Cryosectioning: स्लाइड पर 20 माइक्रोन मोटी वर्गों को एक cryostat पर क्रमानुसार हर 400 माइक्रोन दिमाग कट और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड की दुकान
  2. Cresyl बैंगनी (सीवी) धुंधला:
    1. धुंधला समाधान तैयार: 500 मिलीलीटर एच 2 ओ में सीवी एसीटेट के 0.5 ग्राम मिक्स क्रिस्टल भंग कर रहे हैं जब तक (60 डिग्री सेल्सियस) हलचल और गर्मी. समाधान ठंडा करते हैं और एक अंधेरे बोतल में स्टोर. हर उपयोग करने से पहले 60 डिग्री सेल्सियस और फिल्टर करने के लिए गर्म कर लें.
    2. 30 मिनट के लिए आरटी पर स्लाइड्स सूखी. फिर 1 मिनट के लिए 50% इथेनॉल में बाद में 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में फिर 15 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में उन्हें जगह और.
    3. आसुत जल ताज़ा और 1 मिनट के लिए उन्हें जगह, 2 मिनट के लिए आसुत जल में स्लाइड रखें. बाद में (60 डिग्री सेल्सियस) एफ धुंधला समाधान में स्लाइड्स जगहया 10 मिनट और 1 मिनट के लिए आसुत जल में दो बार उन्हें धोने.
    4. 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में स्लाइड रखें. तो 100% इथेनॉल ताज़ा और 2 मिनट के लिए उन्हें जगह, 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में उन्हें जगह है. बाद में बढ़ते मध्यम के साथ स्लाइड को कवर किया.
    5. विश्लेषण:
      स्लाइड स्कैन और शोफ के लिए सही करने के लिए Swanson विधि 14 से अप्रत्यक्ष रोधगलितांश मात्रा का विश्लेषण:
      (इस्कीमिक क्षेत्र) = (contralateral पक्ष की प्रांतस्था क्षेत्र) - (ipsilateral पक्ष की गैर इस्कीमिक प्रांतस्था क्षेत्र) (चित्रा -4 ए).

Representative Results

कारण कम संज्ञाहरण समय और मध्यम मस्तिष्क क्षति के लिए लगभग 10 मिनट उनके पिंजरों को हस्तांतरण के बाद सभी जानवरों स्वतंत्र रूप से पिंजरे में चलती है और littermates के साथ बातचीत के दौरान, जाग रहे थे. MCAO सर्जरी के दौरान मृत्यु दर मुख्य रूप से आकस्मिक subarachnoid नकसीर या गलत संज्ञाहरण का एक परिणाम के रूप में, कम से कम 5% थी. स्ट्रोक प्रेरण के बाद 7 दिन के अवलोकन के समय के दौरान मृत्यु दर जानवरों की लगभग 1-2% में केवल बहुत कम ही होता है. इस रिपोर्ट के लिए 10 पशुओं का संचालन श्रृंखला में पशुओं के सभी उनमें से कोई भी कारण अपवर्जन मानदंड को बाहर रखा जा सकता था, संचालन और 7 दिन की अवधि के अवलोकन से बच गया.

एमसीए जमावट के बाद व्यवहार घाटे सिलेंडर परीक्षण 13 विश्लेषण forepaw उपयोग विषमता द्वारा मूल्यांकन किया गया. इस परीक्षण में, स्वतंत्र छोड़ दिया और सही forepaw उपयोग के अनुपात स्ट्रोक प्रेरण के बाद संकेत समय बिंदुओं पर मापा और 24 प्राप्त आधारभूत मूल्यों की तुलना में हैMCAO (3B चित्रा) से पहले घंटे. जानवरों सिलेंडर परीक्षण 24 घंटे में संयुक्त दीवार अन्वेषण के लिए अंग उपयोग विषमता में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रस्तुत (1.72 ± 0.326, पी <0.05) और 3 दिन (1.36 ± 0.17, पी <0.05) MCAO के बाद. अनुपात 1 सप्ताह अवलोकन समय के दौरान सुधार हुआ है, मोटर विषमता 7 दिनों MCAO के बाद अभी भी महत्वपूर्ण था (1.35 ± 0.29, पी <0.05) आधारभूत मूल्यों की तुलना में.

हम cresyl बैंगनी 7 दिनों स्ट्रोक प्रेरण (चित्रा 4 बी) के बाद धारावाहिक राज्याभिषेक मस्तिष्क वर्गों दाग का उपयोग रोधगलितांश volumetry प्रदर्शन किया. मीन रोधगलितांश मात्रा जिससे एक मस्तिष्क गोलार्द्ध (चित्रा 4C) का 12% का प्रतिनिधित्व 15.4 मिमी 3 था. इस स्ट्रोक मॉडल की परिवर्तनशीलता लगभग 10% की एक मानक विचलन के साथ असाधारण कम है. घाव क्षेत्र subcortical संरचनाओं का केवल मामूली स्नेह के साथ somatosensory और मोटर प्रांतस्था शामिल हैं. इसके अलावा, रोधगलितांश का स्थानीयकरणयोजनाबद्ध वितरण आरेख (चित्रा 4D) के रूप में दिखाया क्षेत्र केवल न्यूनतम परिवर्तनशीलता के साथ अत्यधिक उम्मीद के मुताबिक है.

चित्रा 1
चित्रा 1. विलिस के चक्र के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. विलिस की धमनी सर्किल आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए) से जो शाखा है, साथ ही द्वारा मध्य मस्तिष्क धमनियों (एमसीए) और पूर्वकाल मस्तिष्क धमनियों (एसीए) के द्वारा बनाई है मस्तिष्क धमनियों (पीसीए) और धमनियों से संवाद स्थापित करने के पीछे (PComA) पीछे. एमसीए सेरेब्रल कॉर्टेक्स के लिए जहां यह शाखाओं पार्श्व परिखा में चलाता है. मोटर प्रांतस्था और somatosensory प्रांतस्था के भाग के बड़े हिस्से की आपूर्ति प्रमुख एमसीए शाखा स्थायी रूप से प्रदर्शन किया मॉडल (ACOMA = पूर्वकाल संवाद स्थापित धमनी द्वारा occluded है, बीए = आधारी धमनी; suca सुपीरियर अनुमस्तिष्क =LAR धमनी).

चित्रा 2
चित्रा 2. अस्थायी मांसपेशी और एमसीए रोड़ा के योजनाबद्ध दृश्य को हटाने के बाद Transcranial देखें. (ए) अस्थायी मांसपेशी को हटाने के बाद cortical धमनियों (8-12 सप्ताह पुराने चूहों में) आंशिक रूप से पारदर्शी माउस खोपड़ी के माध्यम से देखा जा सकता है. प्रमुख एमसीए शाखा अस्थायी देखने के व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा है और साथ ही दुम भाग में एमसीए और पीसीए से शाखाओं में आगे cortical धमनियों में पहचाना जा सकता है. एक विभाजन के साथ अपने प्रमुख विभिन्नता में प्रमुख एमसीए शाखा पर (बी) योजनाबद्ध देखें पार्श्व अस्थायी प्रांतस्था पर एक गड़गड़ाहट छेद ड्रिलिंग और खोपड़ी को हटाने के बाद. (सी) काले वर्गों विभाजन के प्रॉक्सिमल और बाहर पक्षों में एमसीए जमावट साइटों का प्रतिनिधित्व करते हैं.


व्यवहार घाटे का आंकड़ा 3. विश्लेषण. (ए) सिलेंडर परीक्षण सेट अप: माउस एक ऊर्ध्वाधर सिलेंडर में रखा गया है और दर्पण एक वीडियो कैमरा का उपयोग आंदोलनों के सभी रजिस्टर करने के क्रम में पीछे रखा जाता है (बी) Forelimb उपयोग विषमता सिलेंडर परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था.. स्वतंत्र forelimb उपयोग की सही / वाम अनुपात MCAO से पहले और स्ट्रोक प्रेरण के बाद संकेत समय बिंदुओं पर 24 घंटा गणना की गई. = 10 एन, * पी <संकेत समय बिंदु और आधारभूत (नियंत्रण) मूल्य के बीच 0.05.

चित्रा 4
चित्रा 4. बाहर का MCAO बाद रोधगलितांश विश्लेषण और रोधगलितांश परिणाम बड़ा. एक cresyl बैंगनी दाग राज्याभिषेक ब्रा की (ए) प्रतिनिधि छवि7 दिनों MCAO के बाद खंड में. पीली लाइन contralateral (दाएं) प्रांतस्था के चयन को सूचित किया जाता है और लाल रेखा ipsilateral मस्तिष्क की गैर infarcted (दाग) प्रांतस्था का चयन होता है. बाएँ गोलार्द्ध में पीला क्षेत्र infarcted ऊतक क्षेत्र दर्शाया गया है. (बी) रोधगलितांश मात्रा 10 दिमाग का विश्लेषण (हर एक व्यक्ति के मस्तिष्क का प्रतिनिधित्व डॉट) 24 घंटा, 3 दिन और बाहर का एमसीए जमावट के बाद 7 दिन. क्षैतिज लाल लाइन. मतलब, त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का संकेत का प्रतिनिधित्व करता है (सी) प्रतिनिधि cresyl बैंगनी हर 400 मीटर पर 7 दिनों एमसीए जमावट के बाद दाग राज्याभिषेक मस्तिष्क वर्गों. (डी) 7 दिनों MCAO बाद infarcted मस्तिष्क के ऊतकों के योजनाबद्ध वितरण. प्रत्येक स्लाइड पर्वबिन्दु के संबंध में दिए गए खंड (.:; ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस की अनुमति से Liesz एक एट अल, ब्रेन, 2011 से संशोधित छवि से) पर रोधगलितांश वितरण की संचित जानकारी (संकेत के रूप में कोडित रंग) को दर्शाया गया है. <एक href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

तथाकथित "जमावट मॉडल" - वर्तमान प्रोटोकॉल transcranial विद्युतातांचन से बाहर का, स्थायी MCAO की प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल का वर्णन करता है. यह मॉडल इस बीच प्रयोगात्मक स्ट्रोक अनुसंधान 12 में सबसे अक्सर इस्तेमाल पशु मॉडलों में से एक बन गया है. अन्य फोकल मस्तिष्क ischemia के मॉडल की तुलना में, इस वीडियो में प्रस्तुत के रूप में जमावट मॉडल एक प्रशिक्षित वैज्ञानिक ने प्रदर्शन किया, जब लगभग 10 मिनट की एक बहुत ही कम संचालन समय का लाभ दिया है. इसलिए, संक्षिप्त संज्ञाहरण बार neuroprotection और स्ट्रोक परिणाम पर anesthetics के प्रभाव 15 अच्छी तरह से जाना जाता है क्योंकि एक प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल की एक अनुकूल सुविधा है जो इस मॉडल में प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, पहले से कारमाइकल एट अल. 11 द्वारा वर्णित के रूप में, हम बाहर का स्थायी एमसीए जमावट के बाद परिणामस्वरूप रोधगलितांश मात्रा और स्थानीयकरण मानव के बहुमत में इस्कीमिक मस्तिष्क घावों से मेल खाती है कि पुष्टिमस्तिष्क के आकार के अनुपात में स्ट्रोक. मानव स्ट्रोक पिछले जनसंख्या अध्ययन और नैदानिक ​​इमेजिंग परीक्षणों 16-18 पर आधारित, गोलार्द्ध के लगभग 5-15% के घावों के साथ आकार में मुख्य रूप से छोटा है, कम से कम 10% में होते हैं जो दबाने मस्तिष्क edema के साथ व्यापक स्ट्रोक घावों के विपरीत नैदानिक ​​19 स्ट्रोक. इस प्रकार, प्रस्तुत मॉडल के आधार पर हासिल गोलार्द्ध के लगभग 12% की एमसीए क्षेत्र में स्ट्रोक घावों एक translationally प्रासंगिक स्ट्रोक मात्रा के रूप में माना जा सकता है. हालांकि, यह अलग माउस उपभेदों या इस्तेमाल संज्ञाहरण प्रोटोकॉल जिसके परिणामस्वरूप घाव मात्रा 20 प्रभावित हो सकता है कि ध्यान में रखा जाना है.

इस मॉडल में स्ट्रोक प्रेरण के बाद प्रेक्षण अवधि के दौरान मृत्यु दर लगभग अनुपस्थित है. अपवर्जन मानदंड के पहुंचने की वजह से कम से कम 5% की समग्र मृत्यु क्योंकि anesthesiological जटिलताओं या बलिदान के ऑपरेशन के दौरान होने वाली मौतों का मुख्य रूप से शामिल है. कम वी वारंट के क्रम मेंआपरेशन के दौरान 1) किसी भी subarachnoid नकसीर: इस मॉडल और अपनी उत्कृष्ट reproducibility के ariability, हम निम्नलिखित अपवर्जन मानदंड सुझाव है. 2) आपरेशन समय अब ​​15 मिनट से. केवल क्षणिक MCAO साथ विद्युतातांचन के लिए दो प्रयासों के बाद एमसीए के 3) recanalization. इसके अलावा, पशुओं के दर्द, बेचैनी या बीमारी व्यवहार के लिए नियंत्रित करने के लिए MCAO (बुनियादी शारीरिक व्यवहार, फर उपस्थिति और शरीर के वजन) के बाद दैनिक जांच की जानी चाहिए.

कई उपायों लेजर धब्बा माप, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, व्यवहार परीक्षण या ऊतकीय विश्लेषण जैसे स्ट्रोक परिणाम के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में हम व्यवहार विश्लेषण और रोधगलितांश मात्रा विश्लेषण के लिए अनुकरणीय तरीकों प्रदान करते हैं. फोकल मस्तिष्क ischemia के बाद व्यवहार के विश्लेषण के लिए कई परीक्षण विकसित किया है और प्रयोगात्मक स्ट्रोक अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया है. पहले इस स्ट्रोक मॉडल 21,22 हम में हमारे समूह द्वारा इस्तेमाल ज्ञानेन्द्रिय में शिथिलता के लिए उपयुक्त परीक्षणrotarod परीक्षण 23 पुनः, चिप्पी परीक्षण 24, कॉर्नर परीक्षण 25 और इस वीडियो में प्रदर्शन किया है, जो सिलेंडर परीक्षण 13,. सिलेंडर परीक्षण लगातार बाहर का स्थायी MCAO के बाद तीव्र चरण में मोटर विषमता को दर्शाया गया है और भी लगातार मोटर समारोह का हासिल पता लगाता है.

स्पष्ट लाभ के बावजूद, इस स्ट्रोक मॉडल की कुछ सीमाएं ध्यान में रखा जाना है. सबसे पहले, खोपड़ी के एक उक्त बरमे व्दारा छेदने का कार्य शल्य घाव, अस्थायी मांसपेशियों या मस्तिष्क के ही जीवाणु संक्रमण खुद के द्वारा पता लगाया गया कभी नहीं किया है, हालांकि इस तरह, मस्तिष्क की पेरी परिचालन संक्रमण के लिए एक संभावित पहुंच उत्पादन, धमनी जमना के क्रम में की जरूरत है या इस मॉडल का उपयोग कर दूसरों के द्वारा प्रलेखित. इसके अलावा, तैयारी और जमावट के दौरान प्रांतस्था को यांत्रिक क्षति अपवर्जित नहीं किया जा सकता लेकिन सावधान ड्रिलिंग और हटाने खोपड़ी की, शल्य साइट का लगातार नम और कम से कम पूर्वोत्तर द्वारा सीमित किया जा सकता है cessary विद्युतातांचन (अपवर्जन मानदंड देखें). चित्रा 2 में दर्शाया के रूप में एमसीए का कोर्स C57BL 6 / चूहों के बहुमत में पाया जाता है, हम मॉडल परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए पोत कोर्स की सामान्य किस्मों में आगे बढ़ने के लिए प्रोटोकॉल में वर्णन. इसके अलावा, हम कई के उपयोग का सुझाव (विभाजन के मामले में 3, एमसीए के विभाजन के बिना 2) रोड़ा साइटों हमारे अनुभव में इस मॉडल की परिवर्तनशीलता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है जो एमसीए, का आंशिक recanalization के जोखिम को कम करने के लिए.

व्यवहार परीक्षण के संदर्भ में, केवल मामूली व्यवहार घाटे उपर्युक्त व्यवहार परीक्षण में पाया जा सकता है और कार्यात्मक उत्थान झटके के बाद पहले सप्ताह के भीतर देखा जा सकता है. इस प्रकार, उच्च संवेदनशीलता और कुशल तक पहुँचने परीक्षण 27 जैसे गुणात्मक परीक्षण मानकों के साथ और अधिक उन्नत परीक्षण प्रणाली इस मॉडल में लंबी अवधि के कार्यात्मक परिणाम पता लगाने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है.

ontent "> अंत में, कारण की वजह से सहज थक्का सेल या चिकित्सा के लिए 28 स्ट्रोक रोगियों का एक बड़ा प्रतिशत में मनाया एक सुविधा है जो कोई reperfusion प्राप्त किया जा सकता एमसीए, की स्थायी जमावट के लिए. हालांकि, एक पहले से वर्णित thromboembolic स्ट्रोक मॉडल 26 प्रदान करता है cortical मस्तिष्क ischemia के reperfusion के साथ एक मानार्थ स्ट्रोक मॉडल के लिए विकल्प. साथ में ले ली, उच्च reproducibility, के कारण कम से कम मृत्यु दर और मानव स्ट्रोक के संबंध में तुलनीय रिश्तेदार रोधगलितांश मात्रा और स्थानीयकरण के लिए संभव लंबी अवधि के अवलोकन "जमावट मॉडल" भेद बुनियादी और translational स्ट्रोक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान मॉडल के रूप में.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धा हितों की है.

Acknowledgments

इस काम में जर्मन रिसर्च फाउंडेशन "सिस्टम तंत्रिका विज्ञान के लिए म्यूनिख क्लस्टर (तालमेल)" की उत्कृष्टता क्लस्टर से और अल करने के लिए डेमलर बेंज फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera Canon Eos 500D Canon Optics: 18-55 mm; 30 fps; 640 x 480 video function
Mirror Kristallform 2677089 30 x 30 cm 
Transparent acrylic glass cylinder H&S Kunststofftechnik Diameter: 8 cm,  height: 25 cm
Heating blanket FHC DC Temperature Controller
Fine Scissors FST 15000-00
Mayo Scissors FST 1410-15
Forceps FST 11616-15
Cottons NOBA Verbondmitel Danz 974116
Saline solution Braun 131321
Bepanthen pommade Bayer
Isoflurane Abbot B506
Anesthesia system for isoflurane Drager
Stereomikroskop  Zeiss Stemi DV4
Electrosurgical device ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgiegerät
Drill Proxxon D-34343
Ketamine Inresa Arzneimittel GmbH
Xylacine Albrecht
5ml Syringe  Braun
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 Apotheke Innestadt Uni Munchen P32799
Isopentane Fluka 59070
Cryostat Thermo Scientific CryoStarNX70
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Cresyl violet Sigma Life Science C5042-10G
Acetic acid Sigma Life Science 695092
Ethanol 70% CLN Chemikalien Laborbedorf 521005
Ethanol 96% CLN Chemikalien Laborbedorf 522078
Ethanol 99% CLN Chemikalien Laborbedorf ETO-5000-99-1
Roti-Histokit mounting medium Roth 6638.1
C57Bl/6J mice Charles River 000664

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References

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