मानव pluripotent स्टेम सेल से डोपामिनर्जिक न्यूरॉन भेदभाव निर्देशित

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Zhang, P., Xia, N., Reijo Pera, R. A. Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (91), e51737, doi:10.3791/51737 (2014).

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Abstract

Introduction

डोपामिनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स मध्यमस्तिष्क, हाइपोथैलेमस, रेटिना, और घ्राण बल्ब सहित कई मस्तिष्क क्षेत्रों में पाया जा सकता है. अग्रमस्तिष्क में स्ट्रिएटम को पेश करने और extrapyramidal मोटर प्रणाली के गठन से द्रव्य नाइग्रा Pars COMPACTA (SNpc) नियंत्रण व्यवहार और आंदोलन में A9 डीए न्यूरॉन्स. A9 डीए न्यूरॉन्स के अध: पतन दूसरा सबसे आम मानव neurodegenerative विकार और वर्तमान में लाइलाज है जो पार्किंसंस रोग (पीडी), की ओर जाता है. सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी पीडी 1 के उपचार के लिए सबसे होनहार रणनीतियों में से एक है, इसलिए, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और दोनों सहित, मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) से ए 9 डीए न्यूरॉन्स पाने में एक महान ब्याज की गई है हाल ही में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs).

अधिक से अधिक शोध विभिन्न तरीकों का उपयोग कर hPSCs से A9 डीए न्यूरॉन्स प्राप्त करने की कोशिश की है. एक तंत्रिका के माध्यम से जल्द से जल्द रिपोर्ट सभी उत्पन्न डीए न्यूरॉन्सथाली पूर्वज मंच. के साथ या 2-4 सप्ताह, एल Studer और सहयोगियों और सफलतापूर्वक तंत्रिका rosettes निर्माण करने के लिए hESCs प्रेरित तीन अन्य समूहों के लिए बाहरी वृद्धि कारकों के बिना MS5 2 या PA6 3-5 stromal कोशिकाओं के साथ सह संवर्धन. वे तो यांत्रिक विच्छेदन या आगे भेदभाव के लिए enzymatic पाचन द्वारा इन rosettes समृद्ध. अन्य रिपोर्ट में शोधकर्ताओं संस्कृति भेदभाव 6-9 चल embryoid शरीर के माध्यम से तंत्रिका rosettes (ईबी) उत्पन्न. बाद में, शोधकर्ताओं, वे अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स पर hESCs और hiPSCs चढ़ाया जहां एक monolayer आधारित भेदभाव विधि 10,11, स्थापना में विवो भ्रूण डीए न्यूरॉन विकास mimics जो डीए न्यूरॉन्स को hPSCs का भेदभाव, प्रेरित करने के लिए संस्कृति में विभिन्न विकास कारकों गयी . इन सभी अध्ययनों डीए न्यूरॉन्स की कुछ विशेषताओं के साथ tyrosine hydroxylase (HI) -expressing कोशिकाओं प्राप्त हालांकि, पूरे भेदभाव प्रक्रिया, समय और श्रम की खपत हैआम तौर पर अक्षम है, और अधिक महत्वपूर्ण बात, इन न्यूरॉन्स की A9 पहचान LMX1a अस्थानिक अभिव्यक्ति 12 के साथ एक को छोड़कर ज्यादातर अध्ययनों में प्रदर्शन नहीं कर रहे थे. हाल ही में, एक नई मंजिल की थाली (एफपी) आधारित प्रोटोकॉल तो डीए न्यूरॉन क्षमता के साथ एफपी व्यापारियों पहली भेदभाव के प्रारंभिक चरण के दौरान ध्वनि हाथी और विहित Wnt संकेत दे रास्ते की सक्रियता से उत्पन्न किया गया जिसमें 13-16, विकसित किया गया था इन एफपी कोशिकाओं आगे डीए न्यूरॉन्स के लिए निर्दिष्ट किया गया. इस प्रोटोकॉल अधिक कुशल है हालांकि, अभी भी कुछ समस्याएं हैं; उदाहरण के लिए, पूरे भेदभाव प्रक्रिया लंबे समय (कम से कम 35 दिन) लेता है और निर्भर फीडर सेल 15 है, या ईबी या A9 पहचान 14 का प्रदर्शन नहीं किया गया था 16 निर्भर है.

इधर, इन विवो भ्रूण डीए न्यूरॉन विकास और अन्य शोधकर्ताओं ने 'प्रकाशित परिणाम से ज्ञान के आधार पर, हम EFF के लिए संस्कृति शर्तों अनुकूलित हैhESCs और hiPSCs दोनों से डीए न्यूरॉन्स की icient पीढ़ी. हम पहले छोटे अणु CHIR99021 और छोटे अणुओं शिथिलता और purmorphamine साथ संकेत ध्वनि हाथी के साथ विहित Wnt संकेतन की सक्रियता से एफपी अग्रदूत साबित कोशिकाओं उत्पन्न. ये एफपी कोशिकाओं FOXA2, LMX1a, CORIN, OTX2 और nestin व्यक्त करते हैं. हम तो आदि BDNF, GDNF, सहित वृद्धि कारकों के साथ महंगाई भत्ते न्यूरॉन्स को इन एफपी कोशिकाओं निर्दिष्ट. वे Calbindin 17 के लिए, जबकि नकारात्मक GIRK2 के लिए सकारात्मक रहे हैं के रूप में उत्पन्न डीए न्यूरॉन्स A9 सेल प्रकार के होते हैं. इस प्रोटोकॉल अत्यधिक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फीडर सेल या ईबी स्वतंत्र है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक, या इन विट्रो पीडी की मॉडलिंग या पीडी के लिए संभावित चिकित्सीय एजेंट के परीक्षण के लिए पीडी रोगियों की hiPSCs से hESCs या सेल प्रत्यारोपण अध्ययन के लिए सामान्य व्यक्तियों की hiPSCs से कम से कम 4 हफ्तों में महंगाई भत्ते न्यूरॉन्स प्राप्त कर सकते हैं.

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Protocol

संस्कृति मीडिया के 1 तैयारी

  1. निम्नलिखित संयोजन से माउस भ्रूण fibroblast (MEF) मध्यम तैयार: 445 मिलीलीटर DMEM, 50 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और 5 मिलीलीटर 100x पेनिसिलिन / एम्पीसिलीन शेयर समाधान. कोई 14 से अधिक दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर निष्फल मध्यम रखें.
  2. तैयार सीरम युक्त निम्नलिखित संयोजन से hPSC संस्कृति मध्यम: 385 मिलीलीटर DMEM / F12, 100 मिलीलीटर पीटा सीरम रिप्लेसमेंट (एस आर), 5 एमएल 100x गैर आवश्यक अमीनो एसिड शेयर समाधान, 5 एमएल 100x पेनिसिलिन / एम्पीसिलीन शेयर समाधान, 5 एमएल 100x शेयर समाधान -mercaptoethanol, और 10 एनजी / एमएल bFGF. कोई 10 से अधिक दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर निष्फल मध्यम रखें.
  3. निम्नलिखित संयोजन से mTeSR1 सीरम मुक्त मध्यम तैयार: 400 मिलीलीटर mTeSR1 बेसल मध्यम, 100 मिलीलीटर 5x पूरक, और 5 मिलीलीटर 100x पेनिसिलिन / एम्पीसिलीन शेयर समाधान. कोई 10 से अधिक दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम रखें.
  4. 10x collagenase चतुर्थ स्टॉक समाधान तैयार: 0.5 ग्राम collagenase चतुर्थ सत्ता से बाहर तौलना, और50 मिलीलीटर DMEM / F12 और बाँझ फ़िल्टर के साथ इसे भंग. Aliquots बनाओ और महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें शेयर.
  5. 0.1% जिलेटिन समाधान तैयार: पावर (गोजातीय त्वचा, ग्रुप बी से) 0.5 ग्राम जिलेटिन बाहर तौलना और विआयनीकृत पानी के साथ इसे भंग. सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर आटोक्लेव निष्फल समाधान रखें.
  6. निम्नलिखित संयोजन से एस आर भेदभाव मध्यम तैयार: 410 मिलीलीटर DMEM, 75 एमएल एस आर, 5 एमएल शेयर समाधान -mercaptoethanol 100x गैर आवश्यक अमीनो एसिड शेयर समाधान, 5 एमएल 100x पेनिसिलिन / एम्पीसिलीन शेयर समाधान, 5 एमएल 100x. कोई 10 से अधिक दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर निष्फल मध्यम रखें.
    नोट: एस आर भेदभाव दक्षता प्रभावित कर सकता है, जो बहुत कुछ करने के लिए बहुत कुछ है, से भिन्न होता है. यह भेदभाव के लिए सबसे अच्छा एक खोजने के लिए एस आर की कई बैचों का परीक्षण करने के लिए इसलिए बेहतर है.
  7. निम्नलिखित संयोजन से एन 2 भेदभाव मध्यम तैयार: 98 मिलीलीटर DMEM, 1 मिलीलीटर 100x एन 2 पूरक और 1 मिलीलीटर 100x पेनिसिलिन / एम्पीसिलीन शेयर समाधान. 4 में फिल्टर निष्फल मध्यम रखेंकोई 10 से अधिक दिनों के लिए सी °.
  8. 10 मिलीलीटर 50x B27 पूरक, 5 एमएल शेयर समाधान Glutamax 100x, और 5 मिलीलीटर 100x पेनिसिलिन / एम्पीसिलीन शेयर समाधान, 480 मिलीलीटर Neurobasal मध्यम निम्न संयोजन से B27 भेदभाव मध्यम तैयार करें. कोई 10 से अधिक दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर निष्फल मध्यम रखें.

MEF फीडर कोशिकाओं पर hESCs और hiPSCs के 2 संस्कृति

H9 hESCs WiCell अनुसंधान संस्थान से प्राप्त किया गया और hiPSCs Yamanaka की रेट्रोवायरस की मध्यस्थता पारगमन के माध्यम से Reijo पेरा प्रयोगशाला में स्थापित किए गए थे कारकों OCT3 / 4, SOX2, KLF4, और C-MYC 18.

  1. कम से कम एक दिन सेल पारित होने से पहले, 6 अच्छी तरह प्लेटों के 1 अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर 0.1% जिलेटिन जोड़कर कुछ जिलेटिन प्लेटें तैयार है, और कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं.
  2. ऊष्मायन, प्लेटों से महाप्राण जिलेटिन, और बीज के बाद विकिरण 1.6 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर प्लेटों पर MEF कोशिकाओं निष्क्रिय/ अच्छी तरह MEF मध्यम में कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक hemocytometer का उपयोग.
    नोट: वैकल्पिक रूप में जल्दी के रूप में 3 दिनों सेल पारित होने से पहले MEF भक्षण तैयार करते हैं.
  3. पारित होने कोशिकाओं MEF भक्षण चढ़ाना के बाद एक दिन: hPSCs से महाप्राण मध्यम, अच्छी तरह से / 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को 1 मिलीग्राम / एमएल collagenase चतुर्थ जोड़ने, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं.
  4. इस ऊष्मायन के दौरान, पीबीएस के साथ एक बार MEF भक्षण धोने, और फिर अच्छी तरह से 1.5 मिलीग्राम / पर गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) सीरम युक्त hPSC संस्कृति के माध्यम जोड़ें.
  5. Undifferentiated कालोनियों की सबसे प्लेटों से अलग होगा कि इतना विभेदित कालोनियों संलग्न रहते हैं, जबकि 1 घंटा बाद, संस्कृति की थाली में दो बार नल. ध्यान से चल कालोनियों जमा है, और 15 मिलीलीटर ट्यूब में उन्हें स्थानांतरण.
  6. धीरे गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) DMEM / F12 के साथ एक बार थाली धोने और वही 15 मिलीलीटर ट्यूब में DMEM / F12 हस्तांतरण.
  7. 3 मिनट के लिए 179 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र.
  8. गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा ट्यूबों, से महाप्राण मध्यम. युद्ध जोड़ेंएम hPSC संस्कृति मध्यम, छोटे समूहों में उन्हें तोड़ने के लिए और उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ऊपर और कई बार नीचे कोशिकाओं विंदुक.
  9. 1 में नई MEF भक्षण पर कोशिकाओं स्थानांतरण: 3-1: 6 अनुपात.
  10. हर 5-6 दिनों के लिए हर दिन और बीतने कोशिकाओं मध्यम बदलें.

भेदभाव के लिए कोशिकाओं की 3 तैयारी

  1. कोशिकाओं की तैयारी से पहले कम से कम एक दिन में, कुछ Matrigel प्लेट (6 अच्छी तरह से थाली की आम तौर पर 3 कुओं) तैयार करते हैं. 01:40 पर ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) DMEM / F12 के साथ Matrigel पतला और 6 अच्छी तरह प्लेटों के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर Matrigel जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर Matrigel प्लेटें सेते हैं. ध्यान दें: एक Parafilm के साथ Matrigel प्लेटें सील और के रूप में लंबे समय से एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उनके शेयर कर सकते हैं.
  2. 4 दिन बीतने के बाद कोशिकाओं (चरण 2 देखें) का प्रयोग करें. प्लेटों से सभी विभेदित कालोनियों निकालें. संस्कृति की थाली से महाप्राण मध्यम, 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर Accutase प्रति जोड़ने, और सेते हैं.
  3. ऊष्मायन के दौरान, कुछ जेल तैयार6 अच्छी तरह प्लेटों के 1 मिलीलीटर जिलेटिन 1 के लिए अच्छी तरह से जोड़कर प्लेटों atin. इन प्लेटों और इनक्यूबेटर में एक दिन पहले तैयार Matrigel प्लेटें रखें.
  4. कोशिकाओं बन गए हैं जब अर्द्ध चल 5 मिनट ऊष्मायन के बाद या, पिपेट कोशिकाओं ऊपर और नीचे कई बार एकल कक्षों में उन्हें बनाने के लिए.
  5. 3 मिनट के लिए 258 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं, और अपकेंद्रित्र लीजिए.
  6. Resuspend hPSC संस्कृति के माध्यम युक्त सीरम की उचित राशि के साथ कोशिकाओं, और 2 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता Thiazovivin जोड़ें.
  7. 1 में जिलेटिन में लिपटे प्लेटों पर स्थानांतरण कोशिकाओं: 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 के अनुपात, और सेते कोशिकाओं MEF भक्षण को दूर करने के लिए.
  8. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण, hPSC मध्यम युक्त उपयुक्त सीरम जोड़ने के लिए और एक hemocytometer साथ कोशिकाओं गिनती.
  9. 3 मिनट के लिए 258 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  10. अपकेंद्रित्र के दौरान 2 माइक्रोन की एकाग्रता बनाने के लिए mTeSR1 मध्यम उपयुक्त Thiazovivin जोड़ें.
  11. अपकेंद्रित्र, एक के बादमध्यम spirate और / एमएल मध्यम 1.8 x 10 5 कोशिकाओं है कि वहाँ तो Thiazovivin साथ उचित mTeSR1 मध्यम जोड़ें.
  12. इनक्यूबेटर से Matrigel प्लेटें निकाल लें Matrigel aspirate और 6 अच्छी तरह प्लेटों के 1 अच्छी तरह पर मिश्रित कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
    नोट: सेल घनत्व 3.6 x 10 4 कोशिकाओं / सतह क्षेत्र के 2 सेमी होना चाहिए.
  13. वापस इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें, और कोशिकाओं 24 घंटा के लिए देते हैं.
  14. 24 घंटा कोशिकाओं चढ़ाना के बाद, पुराने मध्यम aspirate और अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर नई mTeSR1 मध्यम जोड़ने और भेदभाव शुरू करने से पहले कोशिकाओं एक और 24 घंटे के लिए बढ़ता है.

सेल भेदभाव

  1. Matrigel प्लेटों पर कोशिकाओं replating बाद भेदभाव 48 घंटा प्रारंभ करें.
  2. थाली से महाप्राण संस्कृति मध्यम, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें और अच्छी तरह से प्रति निम्नलिखित भेदभाव मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ने: 10 माइक्रोन SB431542 और 100 एनएम LDN-193 के साथ पूरक एस आर भेदभाव मध्यम189 मार्क भेदभाव के D0 के रूप में इस दिन.
  3. D20 को D0 से हर दिन मध्यम बदलें.
    ध्यान दें: एक एक समय में 2 दिन से अधिक नहीं इस्तेमाल के लिए मध्यम तैयार कर सकते हैं.
  4. 10 माइक्रोन SB431542, 100 एनएम LDN-193189, 0.25 माइक्रोन शिथिलता, 2 माइक्रोन purmorphamine, और 50 एनजी / एमएल FGF8b साथ पूरक एस आर भेदभाव मध्यम: डी 1 और डी 2 के लिए निम्न मध्यम का प्रयोग करें.
  5. 10 माइक्रोन SB431542, 100 एनएम LDN-193189, 0.25 माइक्रोन शिथिलता, 2 माइक्रोन purmorphamine, 50 एनजी / एमएल FGF8b, और 3 माइक्रोन CHIR99021 साथ पूरक एस आर भेदभाव मध्यम: डी 3 और D4 के लिए निम्न मध्यम का प्रयोग करें.
  6. 100 एनएम LDN-193189, 0.25 माइक्रोन शिथिलता, 2 माइक्रोन purmorphamine, 50 एनजी / एमएल FGF8b, और 3 माइक्रोन CHIR99021 के साथ पूरक 75% एस आर भेदभाव मध्यम प्लस 25% एन 2 भेदभाव मध्यम: D5 और डी 6 के लिए निम्न मध्यम का प्रयोग करें.
  7. 100 एनएम LDN-193189 और 3 माइक्रोन CHIR99021 के साथ पूरक 50% एस आर भेदभाव मध्यम प्लस 50% एन 2 भेदभाव मध्यम: D7 और D8 के लिए निम्न मध्यम का प्रयोग करें.
  8. 100 एनएम LDN-193189 और 3 माइक्रोन CHIR99021 के साथ पूरक 25% एस आर भेदभाव मध्यम प्लस 75% एन 2 भेदभाव मध्यम निम्न D9 के लिए मध्यम और D10 उपयोग करें.
  9. 3 माइक्रोन CHIR99021, 10 एनजी / एमएल BDNF, 10 एनजी / एमएल GDNF, 1 एनजी / एमएल TGF3, 0.2 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड और 0.1 मिमी शिविर के साथ पूरक B27 भेदभाव मध्यम: D11 और D12 के लिए निम्न मध्यम का प्रयोग करें.
  10. 10 एनजी / एमएल BDNF, 10 एनजी / एमएल GDNF, 1 एनजी / एमएल TGF3, 0.2 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड और 0.1 मिमी शिविर के साथ पूरक B27 भेदभाव मध्यम: भेदभाव के आराम के लिए निम्न मध्यम का प्रयोग करें.
  11. भेदभाव के बारे में D16, कुछ पाली एल ओर्निथिन / laminin / fibronectin प्लेटें तैयार करते हैं. पाली एल ओर्निथिन ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ शेयर समाधान 15 माइक्रोग्राम / एमएल पीबीएस, रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें 6 अच्छी तरह प्लेटों के 1 अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ने, और सेते पतला.
  12. , पाली एल ओर्निथिन समाधान Aspirate प्लेटें बाँझ पानी के साथ 3 बार धोने और फिर हवा प्लेटें सूखी.
  13. Laminin स्टॉक प पतला1 ग्राम / मिलीलीटर ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ ution, 6 अच्छी तरह प्लेटों में से एक अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ने, और 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात प्लेटें सेते हैं.
  14. , Laminin समाधान Aspirate प्लेटें बाँझ पानी के साथ 3 बार धोने और फिर हवा प्लेटें सूखी.
  15. , 2 ग्राम / मिलीलीटर ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ फ़ाइब्रोनेक्टिन शेयर समाधान पतला 6 अच्छी तरह प्लेटों के 1 अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ने, और 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात प्लेटें सेते हैं.
  16. Parafilm के साथ सील प्लेटें और जब तक दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें जगह है.
  17. भेदभाव के 20 दिनों के बाद, पाली एल ओर्निथिन / laminin / fibronectin प्लेटों के लिए कोशिकाओं replate. महाप्राण भेदभाव मध्यम, 6 अच्छी तरह प्लेटों के 1 अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) Accutase जोड़ने, और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं.
  18. ऊष्मायन के दौरान, इनक्यूबेटर में पाली एल ओर्निथिन / laminin / fibronectin प्लेटें प्लेस.
  19. 5 मिनट ऊष्मायन के बाद या कोशिकाओं बन गए हैं जब ऊपर और नीचे, कई बार धीरे पिपेट कोशिकाओं अर्द्ध चलएकल कक्षों में उन्हें बनाते हैं.
  20. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एकल कक्षों लीजिए, और विस्तार के आधार पर अलग अलग होंगे, जो सेल गिनती के लिए Neurobasal माध्यम की उचित मात्रा में जोड़ने के लिए, (भेदभाव के 11 दिनों के बाद, कोशिकाओं 15-20 गुना बड़ा कर सकते हैं). एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
  21. 3 मिनट के लिए 258 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. B27 भेदभाव मध्यम के साथ सतह पर तैरनेवाला Aspirate, और resuspend कोशिकाओं सेल एकाग्रता / एमएल मध्यम 1 x 10 6 कोशिकाओं है कि इतनी.
  22. प्लेटों से महाप्राण फ़ाइब्रोनेक्टिन, पीबीएस के साथ दो बार धोने, और 6 अच्छी तरह प्लेटों के 1 अच्छी तरह से करने के लिए 2 मिलीलीटर कोशिकाओं को जोड़ने.
    नोट: replating के लिए सेल घनत्व 2 x 10 5 कोशिकाओं / सतह क्षेत्र के 2 सेमी होना चाहिए.
  23. किसी भी स्वाधीन मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए 24 घंटे बाद मध्यम बदलें.
  24. किसी दिए गए प्रयोग के लिए वांछित समय अंक तक हर दूसरे दिन मध्यम बदलें.

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Representative Results

भेदभाव प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है. यहाँ प्रस्तुत भेदभाव प्रोटोकॉल की दक्षता शुरू करने की कोशिकाओं की स्थिति पर निर्भर करता है. इसलिए, यह पहले एक भेदभाव के लिए एकल कक्षों में hPSCs अलग कर पहले सभी विभेदित कालोनियों को हटा, और दूसरा, एक नहीं, अगर सब MEF फीडर कोशिकाओं जिलेटिन में लिपटे प्लेटों पर कोशिकाओं incubating द्वारा, सबसे depletes, सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है 30 मिनट, और तीसरे के लिए, Matrigel थाली पर उचित घनत्व में एक प्लेटों hPSC एकल कक्षों. चित्रा 2 में सचित्र के रूप में, hPSC एकल कक्षों प्लेटों में लगभग 70% संगम के गठन, भेदभाव से पहले 48 घंटे के दौरान समूहों के रूप में विस्तार होगा replated. फिर भेदभाव के बाद, इन कोशिकाओं के रूप में कम 3-4 दिनों में पूरा संगम तक पहुँचने, और D16-D17 के आसपास से शुरू, इन मिला हुआ कोशिकाओं प्लेटों में कुछ रिक्त स्थान बनाने के लिए शुरू, और कुछ axons / neurites पहले ही कर सकताइन स्थानों में और सेल परतों के नीचे मनाया जा. D20 पर replated जाने के बाद, विभेदित कोशिकाओं संलग्न और के रूप में छोटे गुच्छों बढ़ी. फिर अगले 5 दिनों के दौरान, और अधिक गहन और आकृति विज्ञान बरकरार axons / neurites गुच्छों से बाहर आ गए, और axons / अलग गुच्छों से neurites कुछ कनेक्शन के रूप में. लंबे समय तक संस्कृति के दौरान, एक पेड़ों का झुरमुट में न्यूरॉन्स, अधिक एक्सटेंशन उत्पन्न अधिक परिपक्व हो और पड़ोसी clumps में न्यूरॉन्स के साथ अधिक कनेक्शन है.

भेदभाव के 11 दिनों के बाद, hPSCs कुशलता एफपी व्यापारियों के लिए परिवर्तित किया जा सकता है, और चित्रा 3 में सचित्र के रूप में, लगभग सभी कोशिकाओं एफपी अग्रदूत सेल मार्कर nestin और FOXA2 व्यक्त, और कोशिकाओं के 90% से अधिक और तीन मार्करों CORIN, OTX2 व्यक्त , और LMX1a. वे TUJ1 और वें (चित्रा -4 ए) व्यक्त तब के रूप में भेदभाव का अधिक दिनों के बाद, एफपी अग्रदूत साबित कोशिकाओं डीए न्यूरॉन्स के लिए निर्दिष्ट कर रहे हैं. वे एक्सप्रेशंस के रूप में इन डीए न्यूरॉन्स A9 पहचान के हैंएस GIRK2 जबकि Calbindin (4B चित्रा) के लिए नकारात्मक हैं. Immunostaining प्रयोगों भी भेदभाव विशेष रूप से डीए न्यूरॉन वंश की ओर निर्दिष्ट किया जाता है यह दर्शाता है कि कोई GFAP + astrocytes और बहुत कुछ GABAergic न्यूरॉन्स (चित्रा 4C), वहाँ रहे हैं कि दिखा.

चित्रा 1
चित्रा वृद्धि कारकों / छोटे अणुओं और प्रत्येक दिन के लिए इस्तेमाल किया संस्कृति के माध्यम से भेदभाव प्रोटोकॉल का 1 अवलोकन,. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2 शब्द के भागोंअल बताए अनुसार H9 hESCs उचित सेल घनत्व में एकल कक्षों के रूप में चढ़ाया गया. भेदभाव के दौरान बदलता है, और उसके बाद 48 घंटा, इन कोशिकाओं कालोनियों (D0) के रूप में की थाली में लगभग 70% संगम तक पहुँचने. भेदभाव के पहले कुछ दिनों के दौरान, कोशिकाओं भेदभाव के 24 घंटा (डी 1) के बाद 90% से अधिक संगम तक पहुँचने, तेजी से विस्तार, और फिर 48 अधिक घंटा (डी 3) के बाद संगम हो गया है. हालांकि, इन कोशिकाओं के अधिकांश अभी भी कोशिका द्रव्य अनुपात (डी 3) के लिए उच्च नाभिक के साथ ठेठ hESC आकारिकी दिखा रहे हैं. भेदभाव पर चला जाता है, कोशिकाओं को और अधिक विस्तार और धीरे धीरे hESC आकारिकी खो देते हैं. अन्य (D11) की तुलना में कुछ क्षेत्रों में कोशिकाओं के काले रंग से सबूत के रूप में भेदभाव का D11 के अंत में, थाली के कई हिस्सों में एक से अधिक सेल परतों, वहाँ रहे हैं. D20 को D17 बारे से शुरू, कुछ कोशिकाओं थाली में कुछ रिक्त स्थान छोड़ने की मृत्यु हो गई, और कुछ न्यूरॉन अनुमानों पहले से ही इन स्थानों में देखा जा सकता है एकND कभी कभी सेल परत (D20) के तहत. विकसित करने के लिए कोशिकाओं और भेदभाव के लिए अधिक स्थान बनाने के लिए D20 के अंत में सेल replating के बाद, कोशिकाओं के रूप में छोटे समूहों कुल, एक बहुत अधिक axons / neurites इन समूहों से उभरने, और axons / विभिन्न समूहों से neurites के रूप में संक्षेप में कुछ कनेक्शन फार्म 4-5 दिनों (D25). स्केल बार, 200 माइक्रोन.

चित्रा 3
भेदभाव. H9 hESCs के प्रारंभिक चरण में एफपी मार्करों के लिए चित्रा 3 Immunostaining यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग 11 दिनों के लिए भेदभाव कर रहे थे. कोशिकाओं तो ट्राइटन X-100 के साथ permeabilized 4% paraformaldehyde, गधा सीरम के साथ अवरुद्ध और फिर एफपी अग्रदूत सेल मार्कर के लिए दाग के साथ तय किया गया. यहाँ दिखाया गया है, लगभग सभी कोशिकाओं FOXA2 और nestin व्यक्त, और कोशिकाओं के 90% से अधिक LMX1a, CORIN व्यक्त, औरOTX2, एफपी कोशिकाओं को hESCs से एक बहुत ही उच्च क्षमता रूपांतरण का संकेत है. स्केल बार, 200 माइक्रोन.

चित्रा 4
भेदभाव की देर चरणों में डीए न्यूरॉन मार्कर के लिए चित्रा 4 Immunostaining. (ए) H9 hESCs 25 दिनों के लिए भेदभाव, और कोशिकाओं अखिल न्यूरॉन मार्कर TUJ1 और आमतौर पर इस्तेमाल किया डीए न्यूरॉन मार्कर वीं के लिए immunostaining के अधीन थे. वें सकारात्मक कोशिकाओं की तुलना में अधिक TUJ1 सकारात्मक कोशिकाओं रहे हैं, हालांकि, यहां दिखाया गया है, सभी वें व्यक्त कोशिकाओं TUJ1 व्यक्त कोशिकाओं में छाछ, और वें व्यक्त कोशिकाओं सभी कोशिकाओं के कम से कम आधे का प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी). H9 hESCs आगे कोशिकाओं immunostaining के अधीन थे तो एक और 25 दिन (पूरी तरह से 50 दिन) और के लिए भेदभाव किया गया. परिणाम वें व्यक्त कोशिकाओं वीं की संख्या ज्यादा है कि वहाँ से पता चलाएक कि D25 पर. उनमें से ज्यादातर Calbindin के लिए नकारात्मक हैं, जबकि लगभग इन सभी वें व्यक्त कोशिकाओं का भी पीडी में खो जाता है कि सेल प्रकार है जो उत्पन्न डीए न्यूरॉन्स की A9 उप प्रकार पहचान, यह दर्शाता है, GIRK2 व्यक्त करते हैं. भेदभाव का D25 पर कोशिकाओं के लिए immunostaining (सी) वहाँ GFAP व्यक्त कोई कोशिकाओं रहे हैं, और बहुत कुछ कोशिकाओं गाबा व्यक्त की गई. स्केल बार, 200 माइक्रोन.

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Discussion

(HESCs और hiPSCs दोनों को मिलाकर) मानव pluripotent स्टेम सेल, सबसे उत्पन्न करने के लिए इन विट्रो में भेदभाव किया जा सकता है नहीं तो सब, पिछले अध्ययनों 19 में प्रदर्शन किया गया है जो महंगाई भत्ते न्यूरॉन्स सहित हमारे शरीर की कोशिका प्रकार. इधर, अन्य प्रयोगशालाओं 14,15 से भ्रूण डोपामिनर्जिक न्यूरॉन विकास 20 से ज्ञान और प्रकाशित प्रोटोकॉल पर आधारित है, हम hESCs और hiPSCs से डीए न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए संस्कृति शर्तों अनुकूलित. इस प्रोटोकॉल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, कुशल है और हम सफलतापूर्वक एच 1 और H9 hESC लाइनों के लिए और पीडी रोगियों और अप्रभावित नियंत्रण दोनों से hiPSC लाइनों के लिए यहाँ वर्णित इस प्रोटोकॉल लागू किया है.

हमारे प्रोटोकॉल में, उच्च भेदभाव दक्षता प्राप्त करने के लिए तीन प्रमुख कदम हैं: सबसे पहले, कोशिकाओं से पहले निर्देशित भेदभाव में कोई भेदभाव hPSC कालोनियों होना चाहिए. सभी तीन रोगाणु परतों के रूप में सहज भेदभाव अक्सर घंटे में देखा जाता हैपीएससी संस्कृति, यह एकल कक्षों में इन hPSCs अलग कर पहले इन विभेदित कालोनियों को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है. पिछली रिपोर्टों से पता चला है के रूप में दूसरा, MEF भक्षण, अलग hPSCs से समाप्त किया जाना चाहिए कि MEF कोशिकाओं आत्म नवीकरण को बढ़ावा देने और भेदभाव 21 को बाधित कर सकते हैं कि गुप्त कारकों. इस प्रयोजन के लिए, 30 मिनट के लिए जिलेटिन में लिपटे प्लेटों पर hPSC और MEF सेल मिश्रण incubating लगभग सभी MEF कोशिकाओं को हटाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. तीसरा, एकल hPSCs भेदभाव के लिए उपयुक्त सेल घनत्व पर चढ़ाया जाना चाहिए. पर कोशिकाओं हालांकि, कम से कम 7 दिन के रूप में संक्षेप में थाली के केंद्र में सेना की टुकड़ी और कोशिकाओं की मौत में परिणाम होगा सेल घनत्व को कम करते हुए सेल घनत्व, भेदभाव के आसपास D11 पर सबसे कोशिकाओं की मौत के लिए नेतृत्व करेंगे बढ़ाने से धार में अच्छी तरह से अलग होगा (नहीं दिखाया डेटा). एक इन सभी तीन मापदंड के अनुसार है, यह कुशलतापूर्वक हमारे stepwise प्रोटोकॉल के साथ hPSCs से डीए न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए आसान है.

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मुख्य रूप से कुछ संशोधनों के साथ एल Studer और उनके सहयोगियों ने 14 से पिछले एक रिपोर्ट पर आधारित है. कोशिकाओं के बारे में केवल 70% संगम तक पहुँचने जब कोशिकाओं पूरा संगम (एकल कक्ष चढ़ाना के बाद संस्कृति के 3 या अधिक दिनों) तक पहुँचने जब अपनी रिपोर्ट में, भेदभाव शुरू किया गया था, जबकि पहले, यहाँ भेदभाव, एकल कोशिका चढ़ाना के बाद 48 घंटे में शुरू किया गया था. सुबह 20 भेदभाव प्रक्रिया के दौरान गंभीर कोशिका मृत्यु की ओर जाता है जब तक हमारे अनुभव में, एक सेल बीतने के बिना मिला हुआ कोशिकाओं से भेदभाव शुरू. दूसरा, हम शिथिलता, एचएच मार्ग 22 के लिए एक chlorobenzothiophene युक्त छोटे अणु एगोनिस्ट के साथ अपने अध्ययन में महंगा श प्रोटीन की जगह. इसलिए, पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के साथ तुलना में, यहाँ वर्णित यह एक फीडर सेल और तंत्रिका थाली स्वतंत्र, और मुख्य रूप से एफपी विनिर्देश के लिए छोटे अणुओं पर आधारित है; यह इस प्रकार कम खर्चीला है और कम समय और श्रम लेने वाली है. बेशक, लीइस प्रोटोकॉल के mitation भेदभाव के पहले दिन के लिए एस आर का इस्तेमाल होता है. एस आर भेदभाव दक्षता को प्रभावित कर सकता है, जो बहुत कुछ करने के लिए बहुत से भिन्न होता है. इसलिए, एक भेदभाव के 11 दिनों के बाद एफपी व्यापारियों उत्प्रेरण में सबसे अच्छा काम करता है कि एक पाने के लिए एस आर के विभिन्न बैचों का परीक्षण करना चाहिए.

संक्षेप में, यहाँ descried भेदभाव प्रोटोकॉल की सुविधा चाहिए: hESCs या पीडी के लिए सेल प्रतिस्थापन उपचार के लिए सामान्य व्यक्तियों की hiPSCs से डीए न्यूरॉन्स की (1) पीढ़ी; (2) इन विट्रो मॉडलिंग और पीडी के लिए संभावित चिकित्सीय दवाओं के परीक्षण के लिए पीडी रोगी IPSCs से डीए न्यूरॉन्स की पीढ़ी; (3) जीन का अध्ययन / मानव डीए न्यूरॉन विकास के विनियमन के रास्ते संकेतन.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 10569-010
FBS Life Technologies 26140
penicillin/ampicillin Life Technologies 15140-122
DMEM/F12 Life Technologies 10565-018
KSR Life Technologies 10828-028
Non-essential amino acid Life Technologies 11140-050
b-mercaptoethanol Millipore ES-007-E
bFGF R&D Systems 233-FB-025
mTesR1 STEMCELL Technologies 5850
Collagenase IV Life Technologies 17104-019
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
N2 supplement Life Technologies 17502-048
B27 supplement Life Technologies 17504-044
Neurobasal Life Technologies 21103-049
Glutamax Life Technologies 35050-061
PBS Life Technologies 10010-023
Growth factor reduced matrigel BD Biosciences 354230
Accutase MP Biomedicals 1000449
Thiazovivin Santa Cruz Biotechnology sc-361380
SB431542 Tocris Bioscience 1614
LDN-193189 Stemgent 04-0074
SAG EMD Millipore 566660-1MG
Purmorphamine Santa Cruz Biotechnology sc-202785
FGF8b R&D Systems 423-F8-025
CHIR99021 Cellagen Technology C2447-2s
BDNF R&D Systems 248-BD-025
GDNF R&D Systems 212-GD-010
TGF-beta3 R&D Systems 243-B3-002
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4034
cAMP Sigma-Aldrich D0627
Mouse anti human NESTIN antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23927 1/1,000 dilution
Rabbit anti human OTX2 antibody Millipore AB9566 1/2,000 dilutiion
Goat anti human FOXA2 antibody R&D Systems AF2400 1/200 dilution
rabbit anti human LMX1a antibody Millipore AB10533 1/1,000 dilution
Rabbit anti human TH antibody Pel Freez P40101 1/500 dilution
Chicken anti human TH antibody Millipore AB9702 1/500 dilution
Mouse anti human TUJ1 antibody Covance MMS-435P 1/,2000 dilution
Rabbit anti human GIRK2 antibody Abcam ab30738 1/300 dilution
Rabbit anti human Calbindin antibody Abcam ab25085 1/400 dilution
Centrifuge Eppendorf 5804

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References

  1. Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
  4. Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
  5. Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
  6. Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  7. Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
  8. Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
  9. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
  10. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
  11. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
  12. Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
  13. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
  14. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  15. Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
  16. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
  17. Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
  18. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  19. Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
  20. Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
  21. Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
  22. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).

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