Instrueret Dopaminerg Neuron Differentiering fra menneskelige pluripotente stamceller

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, P., Xia, N., Reijo Pera, R. A. Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (91), e51737, doi:10.3791/51737 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Dopaminerg (DA) neuroner kan findes i flere områder af hjernen, herunder midthjernen, hypothalamus, nethinde, og olfaktoriske pærer. A9 DA neuroner i substantia nigra pars compacta (SNpc) kontrol adfærd og bevægelse ved at projicere til striatum i forhjernen og danner det ekstrapyramidale motoriske system. Degeneration af A9 DA neuroner fører til Parkinsons sygdom (PD), som er den anden mest almindelige menneskelige neurodegenerative lidelse og i øjeblikket uhelbredelig. Celleudskiftning terapi er en af de mest lovende strategier for behandling af PD 1, derfor har der været en stor interesse i at udlede A9 DA neuroner fra humane pluripotente stamceller (hPSCs), herunder både humane embryonale stamceller (hESCs) og seneste menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSCs).

Megen forskning har forsøgt at udlede A9 DA neuroner fra hPSCs ved hjælp af forskellige metoder. De tidligste rapporter alle genererede DA neuroner gennem et neuraltroset stamfader fase. Ved samdyrkning med MS5 2 eller PA6 3-5 stromalceller med eller uden ydre vækstfaktorer for 2-4 uger, L. Studer og kolleger og tre andre grupper held induceret hESCs at producere neurale rosetter. De beriges derefter disse rosetter ved mekanisk dissektion eller enzymatisk nedbrydning til yderligere differentiering. I andre rapporter, forskerne genererede neurale rosetter gennem embryoid krop (EB) flydende kultur differentiering 6-9. Senere forskere etableret et monolag differentiering metode 10,11, hvor de belagt hESCs og hiPSCs på ekstra cellulære matrix tilsat forskellige vækstfaktorer i kulturen at inducere differentiering af hPSCs til DA neuroner, som efterligner in vivo embryonale DA neuron udvikling . Selv om alle disse undersøgelser opnåede tyrosinhydroxylase (TH) som udviser celler med nogle karakteristika af DA neuroner, hele differentiering processen er tid og arbejdskraft tidskrævende,generelt ineffektiv, og endnu vigtigere, blev A9 identitet disse neuroner ikke påvist i de fleste undersøgelser, undtagen den ene med LMX1a ektopisk ekspression 12. For nylig blev et nyt gulv plade (FP) -baseret protokol udviklet 13-16, hvor FP forstadier med DA neuron potentiale først blev frembragt ved aktivering af den soniske pindsvin og kanoniske Wnt signalveje i den tidlige fase af differentiering, og derefter disse FP celler blev yderligere specificeret til DA neuroner. Skønt denne protokol er mere effektiv, er der stadig nogle problemer; for eksempel hele differentiering processen tager lang tid (mindst 35 dage), og er feeder celleafhængig 15 eller EB afhængig 16 eller A9 identitet blev ikke påvist 14.

Her er baseret på viden fra in vivo-embryonale DA neuron udvikling og andre forskeres offentliggjorte resultater har vi optimeret dyrkningsbetingelser for EFFicient generation af DA neuroner fra både hESCs og hiPSCs. Vi først genererede FP prækursorceller ved aktivering af den kanoniske Wnt signalering med lille molekyle CHIR99021 og sonisk pindsvin signalering med små molekyler SAG og purmorphamine. Disse FP celler udtrykker FOXA2, LMX1a, CORIN, OTX2 og nestin. Vi derefter specificeret disse FP celler til DA neuroner med vækstfaktorer, herunder BDNF, GDNF etc. De genererede DA neuroner er af A9 celletype, som de er positive for GIRK2 mens negativ for calbindin 17. Denne protokol er feeder celle eller EB selvstændig, yderst effektiv og reproducerbar. Ved hjælp af denne protokol, kan man udlede DA neuroner i mindre end 4 uger fra hESCs eller hiPSCs normale personer for celle transplantation undersøgelse eller fra hiPSCs af PD patienter til in vitro modellering af PD eller afprøve potentielle terapeutiske midler til PD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af Kultur Medier

  1. Forbered muse embryonale fibroblaster (MEF) medium ved at kombinere følgende: 445 ml DMEM, 50 ml føtalt bovint serum (FBS), og 5 ml 100x penicillin / ampicillin stamopløsning. Hold filtersteriliseres ved 4 ° C i højst 14 dage.
  2. Forbered serumholdigt hPSC dyrkningsmedium ved at kombinere følgende: 385 ml DMEM / F12, 100 ml knockout serum udskiftning (KSR), 5 ml 100x ikke-essentiel aminosyre stamopløsning 5 ml 100x penicillin / ampicillin stamopløsning 5 ml 100x -mercaptoethanol stamopløsning og 10 ng / ml bFGF. Hold filtersteriliseret medium ved 4 ° C i højst 10 dage.
  3. Forbered mTeSR1 serumfrit medium ved at kombinere følgende: 400 ml mTeSR1 basalt medium, 100 ml 5x tillæg, og 5 ml 100x penicillin / ampicillin stamopløsning. Hold ved 4 ° C i højst 10 dage.
  4. Forbered 10x collagenase IV stamopløsning: afvejes 0,5 g collagenase IV magt, ogopløse det med 50 ml DMEM / F12 og Filtersteriliser. Gør alikvoter og oplagre dem ved -20 ° C i flere måneder.
  5. Forbered 0,1% gelatine løsning: afvejes 0,5 g gelatine (fra bovin hud, type B) magt og opløse det med demineraliseret vand. Hold autoklav steriliseret opløsning ved stuetemperatur i flere uger.
  6. Forbered KSR differentiering medium ved at kombinere følgende: 410 ml DMEM, 75 ml KSR 5 ml 100x ikke-essentiel aminosyre stamopløsning 5 ml 100x penicillin / ampicillin stamopløsning, 5 ml 100x mercaptoethanol stamopløsning. Hold filtersteriliseret medium ved 4 ° C i højst 10 dage.
    BEMÆRK: KSR varierer fra parti til parti, som kan påvirke differentiering effektivitet. Det er derfor bedre at teste flere partier af KSR at finde den bedste for differentiering.
  7. Forbered N2 differentiering medium ved at kombinere følgende: 98 ml DMEM, 1 ml 100x N2 supplement og 1 ml 100x penicillin / ampicillin stamopløsning. Hold filtersteriliseret ved 4° C i højst 10 dage.
  8. Forbered B27 differentiering medium ved at kombinere følgende: 480 ml neurobasalt medium, 10 ml 50x B27 supplement, 5 ml 100x Glutamax stamopløsning, og 5 ml 100x penicillin / ampicillin stamopløsning. Hold filtersteriliseret medium ved 4 ° C i højst 10 dage.

2. Kultur hESCs og hiPSCs på MEF fødeceller

H9 hESCs blev opnået fra WiCell Research Institute og hiPSCs blev etableret i Reijo Pera laboratorium gennem retrovirusmedieret transduktion af Yamanaka faktorer OCT3 / 4, Sox2, KLF4, og c-MYC 18.

  1. Mindst én dag før celle passage forberede nogle gelatine plader ved tilsætning af 1 ml 0,1% gelatine til en brønd i 6-brønds plader og inkuberes pladerne ved 37 ° C i mindst 30 minutter.
  2. Efter inkubering aspireres gelatine fra pladerne, og frø bestråling inaktiveret MEF celler på pladerne ved densiteten på 1,6 x 10 5-celler/ Brønd i MEF medium ved anvendelse af et hæmocytometer at tælle cellerne.
    BEMÆRK: Eventuelt forberede MEF foderautomater så tidligt som 3 dage før celle passage.
  3. Passage celler En dag efter plating MEF foderautomater: Aspirer medium fra hPSCs, tilsættes 1 mg / ml collagenase IV til celler ved 1 ml / brønd, og der inkuberes cellerne ved 37 ° C i 1 time.
  4. Under denne inkubation vaskes MEF foderautomater gang med PBS, og derefter tilføje varm (37 ° C) serumholdigt hPSC dyrkningsmedium med 1,5 ml / brønd.
  5. Efter 1 time, tryk dyrkningspladen et par gange, så de fleste af de udifferentierede kolonier vil løsne sig fra pladerne, mens de differentierede kolonier blive siddende. Indsamle forsigtigt de flydende kolonier, og overføre dem til 15 ml rør.
  6. Forsigtigt vask pladen en gang med varmt (37 ° C) DMEM / F12 og overføre DMEM / F12 i den samme 15 ml rør.
  7. Centrifuger rørene ved 179 xg i 3 min.
  8. Aspirer medium fra rørene, og pas på ikke at forstyrre bundfaldet. Tilføj krigm hPSC dyrkningsmedium, pipette cellerne op og ned flere gange for at bryde dem i små klynger og bland dem godt.
  9. Overfør celler på nye MEF foderautomater ved 1: 3-1: 6-forholdet.
  10. Skift mediet hver dag og passage cellerne hver 5-6 dage.

3. Forberedelse af celler til differentiering

  1. Mindst én dag før fremstilling af celler, forberede nogle Matrigel plader (typisk 3 brønde af en 6-brønds plade). Fortyndes Matrigel med kold (4 ° C) DMEM / F12 1:40 og tilsættes 1 ml Matrigel per brønd på 6-brønds plader. Inkubér Matrigel plader ved 4 ° C natten over. BEMÆRK: Man kan forsegle Matrigel plader med Parafilm og oplagre dem ved 4 ° C, så længe som en uge.
  2. Anvend celler (se trin 2) 4 dage efter passage. Fjern alle de differentierede kolonier fra pladerne. Aspirer medium fra dyrkningspladen tilsættes 1 ml Accutase per brønd, og der inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5 min.
  3. Under inkubationen forberede nogle gelAtin plader ved tilsætning af 1 ml gelatine til en brønd i 6-brønds plader. Placer disse plader og Matrigelen plader forberedt dagen før i kuvøse.
  4. Efter 5-min inkubation eller når cellerne er blevet halvflydende, at pipette cellerne op og ned flere gange gøre dem til enkeltceller.
  5. Saml enkelte celler i 15 ml rør og centrifugeres ved 258 xg i 3 min.
  6. Resuspender celler med passende mængde serum indeholdende hPSC dyrkningsmedium og tilføje Thiazovivin til den endelige koncentration på 2 um.
  7. Overfør celler på gelatineovertrukne plader ved forholdet 1: 1, og inkubere cellerne ved 37 ° C i 30 minutter til fjernelse af MEF foderautomater.
  8. Overfør cellerne til et 15 ml konisk rør, tilsættes passende serum indeholdende hPSC medium og tælle cellerne med et hæmocytometer.
  9. Centrifugeres cellerne ved 258 x g i 3 minutter.
  10. Under centrifuge, tilføje Thiazovivin til passende mTeSR1 medium til at gøre en koncentration på 2 um.
  11. Efter centrifuge, enspirate mediet og tilsæt passende mTeSR1 medium med Thiazovivin så der er 1,8 x 10 5 celler / ml medium.
  12. Tag Matrigelen pladerne fra inkubatoren, opsug Matrigel og tilsættes 2 ml af den blandede celler på 1 boringen af ​​de 6-brønds plader.
    BEMÆRK: Celledensiteten bør være 3,6 x 10 4 celler / cm 2 overfladeareal.
  13. Retur pladerne tilbage til inkubatoren, og lade cellerne vedhæfte i 24 timer.
  14. 24 timer efter udpladning af cellerne, aspireres gamle medium og tilsæt 2 ml ny mTeSR1 medium per brønd og lade celler vokser for en anden 24 timer, før du starter differentiering.

Celledifferentiering

  1. Start differentiering 48 timer efter udpladning af cellerne på Matrigel plader.
  2. Aspirer dyrkningsmedium fra pladen, vaskes cellerne en gang med PBS, og der tilsættes 2 ml af følgende differentiering medium per brønd: KSR differentiering medium suppleret med 10 pM SB431542 og 100 nm LDN-193189. Markér denne dag som D0 differentiering.
  3. Skift medium hver dag fra D0 til D20.
    BEMÆRK: Man kan fremstille mediet til brug ikke mere end 2 dage ad gangen.
  4. Brug følgende medium for D1 og D2: KSR differentiering medium suppleret med 10 pM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine og 50 ng / ml FGF8b.
  5. Brug følgende medium til D3 og D4: KSR differentiering medium suppleret med 10 pM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b og 3 uM CHIR99021.
  6. Brug følgende medium for D5 og D6: 75% KSR differentiering medium plus 25% N2 differentiering medium suppleret med 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 um purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b og 3pM CHIR99021.
  7. Brug følgende medium for D7 og D8: 50% KSR differentiering medium plus 50% N2 differentiering medium suppleret med 100 nM LDN-193189 og 3pM CHIR99021.
  8. Brug følgende medium for D9 og D10: 25% KSR differentiering medium plus 75% N2 differentiering medium suppleret med 100 nM LDN-193189 og 3pM CHIR99021.
  9. Brug følgende medium til D11 og D12: B27 differentiering medium suppleret med 3 uM CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM ascorbinsyre og 0,1 mM cAMP.
  10. Brug følgende medium til resten af ​​differentiering: B27 differentiering medium suppleret med 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM ascorbinsyre og 0,1 mM cAMP.
  11. På omkring D16 differentiering, forberede nogle poly-L-ornithin / Laminin / Fibronectin plader. Fortynd poly-L-ornithin stamopløsning med kold (4 ° C) PBS til 15 ug / ml, tilsættes 1 ml 1 brønd i 6-brønds plader og inkuberes pladerne ved 37 ° C natten over.
  12. Aspirer poly-L-ornithin opløsning vaskes pladerne tre gange med sterilt vand og derefter lufttørre pladerne.
  13. Laminin lager sol fortyndesution med kold (4 ° C) PBS til 1 ug / ml, tilsættes 1 ml til en brønd i 6-brønds plader og inkuberes pladerne ved 37 ° C natten over.
  14. Aspirer laminin opløsning vaskes pladerne tre gange med sterilt vand og derefter lufttørre pladerne.
  15. Fibronectin stamopløsning med kold (4 ° C) PBS til 2 ug / ml fortyndes, tilsættes 1 ml til 1 brønd i 6-brønds plader og inkuberes pladerne ved 37 ° C natten over.
  16. Seal plader med Parafilm og placere dem ved 4 ° C i op til to uger.
  17. Efter 20 dages differentiering replate cellerne til poly-L-ornithin / laminin / Fibronectin plader. Aspirer differentiering medium tilsættes 1 ml varm (37 ° C) Accutase 1 brønd i 6-brønds plader og inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5 min.
  18. Under inkubationen placere poly-L-ornithin / laminin / Fibronectin pladerne i inkubatoren.
  19. Efter 5-min inkubation eller når cellerne er blevet halvflydende, pipettér forsigtigt cellerne op og ned flere gange tilgøre dem til enkeltceller.
  20. Saml de enkelte celler i 15 ml koniske rør, og tilsæt den passende mængde neurobasalt medie til celletælling, som vil variere afhængigt af ekspansion (efter 11 dages differentiering kan celler udvide 15-20 gange). Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer.
  21. Centrifugeres cellerne ved 258 x g i 3 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender celler med B27 differentiering medium, således at cellekoncentrationen er 1 x 10 6 celler / ml medium.
  22. Aspirer fibronektin fra pladerne vaskes to gange med PBS, og der tilsættes 2 ml celler til 1 brønd i 6-brønds plader.
    BEMÆRK: Celletætheden for genudpladning bør være 2 x 10 5 celler / cm2 overfladeareal.
  23. Skift medium 24 timer senere for at fjerne eventuelle ubundne døde celler.
  24. Skift medium hver anden dag, indtil den ønskede tid point for et givet eksperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En oversigt over differentiering protokol er vist i figur 1. Effektiviteten af differentiering protokol præsenteres her afhængig status startende celler. Derfor er det vigtigt at sørge for, at første fjerner alle de differentierede kolonier før dissociering hPSCs i enkelte celler til differentiering, og det andet et udtømmer de fleste, hvis ikke alle, de MEF fødeceller ved at inkubere celler på gelatine-overtrukne plader i 30 minutter, og for det tredje en pladerne hPSC enkeltceller på passende tæthed på Matrigel plade. Som illustreret i figur 2, genudpladet hPSC enkelte celler vil ekspandere som klynger i løbet af 48 timer før differentiering og danner omkring 70% konfluens i plader. Så efter differentiering, disse celler nå fuld sammenløb i så kort som 3-4 dage, og starter fra omkring D16-D17, disse sammenflydende celler begynder at lave nogle rum i pladerne, og nogle axoner / neuritter kunne alleredeobserveres i disse rum og under de cellelag. Efter at være blevet genudplades på D20, de differentierede celler vedhæftet og voksede som små klumper. Så i løbet af de næste 5 dage, meget mere intensive og morfologisk intakte axoner / neuritter komme ud fra klumper, og axoner / neuritter fra forskellige klumper danne nogle forbindelser. Under langtidsbehandling kultur, neuroner i en klump generere flere udvidelser, få mere moden og har flere forbindelser til neuroner i nabolandene klumper.

Efter 11 dages differentiering kunne hPSCs effektivt omdannes til FP prækursorer, og som vist i figur 3, er næsten alle celler udtrykker FP forløber cellemarkører nestin og FOXA2, og over 90% af cellerne udtrykker yderligere tre markører CORIN, OTX2 og LMX1a. Så efter flere dages differentiering, er FP præcursorceller specificeret til DA neuroner, som de udtrykker TUJ1 og TH (figur 4A). Disse DA neuroner er af A9 identitet som de Express GIRK2 mens er negative for calbindin (figur 4B). Immunofarvning forsøg viser også, at der ikke er nogen GFAP + astrocytter og meget få GABAerge neuroner (figur 4C), hvilket indikerer, at den differentiering udelukkende er angivet mod DA neuron afstamning.

Figur 1
Figur 1. Oversigt over differentiering protokol, med vækstfaktorer / små molekyler og kultur medium, der anvendes for hver dag. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Morfologiskal skifter under differentiering. H9 hESCs udpladedes som enkelte celler i den relevante celle tæthed som beskrevet, og 48 timer efter, at disse celler nå op på omkring 70% konfluens i pladen som kolonier (D0). I de første få dage af differentiering, cellerne ekspandere hurtigt og nåede over 90% sammenflydning efter 24 timer af differentiering (D1), og derefter bliver sammenflydning efter 48 mere HR (D3). Men de fleste af disse celler stadig udviser typiske embryonale morfologi med høj kerne til cytoplasma forholdet (D3). Som differentiering går, celler udvide mere og gradvist miste hESC morfologi. Ved udgangen af D11 af differentiering, der er mere end ét cellelag i mange dele af pladen, som det fremgår af mørkere farve af celler i nogle områder end de andre (D11). Startende fra omkring D17 til D20, døde nogle celler, der forlader nogle mellemrum i pladen, og nogle neuron fremskrivninger allerede kunne observeres i disse rum ennd undertiden under cellelag (D20). Efter celle -genudpladning i slutningen af ​​D20 at gøre flere rum for celler til at vokse og differentiering, celler aggregerer som små klynger, en masse flere axoner / neuritter frem fra disse klynger, og axoner / neuritter fra forskellige klynger danner nogle forbindelser i så kort som 4-5 dage (D25). Scale bar, 200 pm.

Figur 3
Figur 3. Immunfarvning FP markører på et tidligt stadium af differentiering. H9 hESCs blev differentieret i 11 dage ved hjælp af protokollen beskrevet her. Cellerne blev derefter fikseret med 4% paraformaldehyd, permeabiliseret med Triton X-100, blokeret med æsel serum og derefter farvet for FP forløber cellemarkører. Som vist her, næsten alle celler udtrykker FOXA2 og nestin, og over 90% af cellerne udtrykker LMX1a, CORIN, ogOTX2, hvilket indikerer en meget høj effektivitet konvertering fra hESCs til FP-celler. Scale bar, 200 pm.

Figur 4
Figur 4. Immunfarvning til OB neuron markører ved sene stadier af differentiering. (A) H9 hESCs blev differentieret i 25 dage, og cellerne var underlagt immunfarvning for den pan-neuron markør TUJ1 og almindeligt anvendte DA neuron markør TH. Som vist her, selv om der er mere TUJ1 positive celler end TH-positive celler, alle TH-udtrykkende celler rest i TUJ1-udtrykkende celler og TH-udtrykkende celler udgør mindst halvdelen af ​​alle celler. (B). H9 hESCs blev yderligere differentieret for yderligere 25 dage (i alt 50 dage) og derefter celler blev underkastet immunfarvning. Resultaterne viste, at der er højere procentdel af TH-udtrykkende celler then, at d25. Næsten alle disse TH-udtrykkende celler udtrykker også GIRK2 mens de fleste af dem er negative for calbindin angivelse A9 subtype identiteten af ​​de genererede DA neuroner, som er den celletype, der er tabt i PD. (C) Immunfarvning for celler på D25 differentiering viste, at der ikke er nogen celler, der udtrykker GFAP, og meget få celler udtrykker GABA. Scale bar, 200 pm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Humant pluripotente stamceller (herunder både hESCs og hiPSCs) kan differentieres in vitro til at generere de fleste, hvis ikke alle, celletyper i vores krop, herunder DA neuroner, der har været påvist i tidligere undersøgelser 19. Her er baseret på viden fra embryonale dopaminerge neuron udvikling 20 og offentliggjorte protokoller fra andre laboratorier 14,15, vi optimeret dyrkningsbetingelser til generering af DA neuroner fra hESCs og hiPSCs. Denne protokol er effektiv, reproducerbar og vi har med succes anvendt denne protokol beskrevet her til H1 og H9 hESC linjer og de hiPSC linjer fra både PD patienter og upåvirkede kontroller.

I vores protokol, der er tre vigtige skridt til at opnå den høje differentiering effektivitet: For det første bør der ikke være differentierede hPSC kolonier i celler, før rettet differentiering. Som spontan differentiering for alle tre kimlag ses ofte i hPSC kultur, er det vigtigt at fjerne disse differentierede kolonier før dissociere disse hPSCs i enkeltceller. For det andet bør MEF foderautomater være udtømt fra dissocierede hPSCs, som tidligere rapporter har vist, at MEF celler kan hemmelige faktorer, som fremmer selv-fornyelse og hæmmer differentiering 21. Til dette formål bør inkubere hPSC og MEF celleblandinger på gelatineovertrukne plader til 30 minutter være nok til at fjerne næsten alle de MEF celler. For det tredje skal de enkelte hPSCs udplades på passende celledensitet til differentiering. Forøgelse celledensiteten vil føre til døden af ​​de fleste celler på omkring D11 differentiering, samtidig sænke celledensiteten vil resultere i frigørelsen og død af celler i midten af ​​pladen i så kort som mindre end 7 dage, selv om celler på kant vil differentiere godt (data ikke vist). Hvis man overholder alle disse tre kriterier, er det let at effektivt at opnå DA neuroner fra hPSCs med vores trinvis protokol.

Protokollen præsenteres her er hovedsagelig baseret på en tidligere rapport af L. Studer og kolleger 14 med nogle ændringer. Først blev differentieringen her startede 48 timer efter en enkelt celleudpladning når cellerne når kun omkring 70% konfluens, mens i deres rapport blev differentiering startet, når cellerne når fuld konfluens (3 eller flere dages dyrkning efter en enkelt celle plating). Det er vores erfaring, begyndende differentiering fra sammenflydende celler uden en celle passage indtil dag 20 fører til svær celledød under differentiering processen. For det andet, vi udskifter dyre SHH protein i deres studie med SAG, en chlorobenzothiophene-holdige lille molekyle agonist til HH vej 22. Derfor sammenlignet med tidligere offentliggjorte protokoller, denne ene er beskrevet her er feeder celle og neurale roset uafhængig, og hovedsageligt baseret på små molekyler til FP specifikation; det er derfor billigere og mindre tids- og arbejdskrævende. Selvfølgelig limitation af denne protokol er brugen af ​​KSR i de første dage af differentiering. KSR varierer fra parti til parti, som kan påvirke differentiering effektivitet. Derfor bør man afprøve forskellige batches af KSR at få en, der virker bedst i at inducere FP forstadier efter 11 dages differentiering.

Sammenfattende bør differentieringen protokol descried her lette: (1) tilblivelsen af ​​DA neuroner fra hESCs eller hiPSCs normale personer for celleerstatningsterapi til PD; (2) generering af DA neuroner fra PD patient iPSCs til in vitro-modellering og afprøvning af potentielle terapeutiske lægemidler til PD; (3) undersøgelse af generne / signalveje regulerer humant DA neuron udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 10569-010
FBS Life Technologies 26140
penicillin/ampicillin Life Technologies 15140-122
DMEM/F12 Life Technologies 10565-018
KSR Life Technologies 10828-028
Non-essential amino acid Life Technologies 11140-050
b-mercaptoethanol Millipore ES-007-E
bFGF R&D Systems 233-FB-025
mTesR1 STEMCELL Technologies 5850
Collagenase IV Life Technologies 17104-019
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
N2 supplement Life Technologies 17502-048
B27 supplement Life Technologies 17504-044
Neurobasal Life Technologies 21103-049
Glutamax Life Technologies 35050-061
PBS Life Technologies 10010-023
Growth factor reduced matrigel BD Biosciences 354230
Accutase MP Biomedicals 1000449
Thiazovivin Santa Cruz Biotechnology sc-361380
SB431542 Tocris Bioscience 1614
LDN-193189 Stemgent 04-0074
SAG EMD Millipore 566660-1MG
Purmorphamine Santa Cruz Biotechnology sc-202785
FGF8b R&D Systems 423-F8-025
CHIR99021 Cellagen Technology C2447-2s
BDNF R&D Systems 248-BD-025
GDNF R&D Systems 212-GD-010
TGF-beta3 R&D Systems 243-B3-002
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4034
cAMP Sigma-Aldrich D0627
Mouse anti human NESTIN antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23927 1/1,000 dilution
Rabbit anti human OTX2 antibody Millipore AB9566 1/2,000 dilutiion
Goat anti human FOXA2 antibody R&D Systems AF2400 1/200 dilution
rabbit anti human LMX1a antibody Millipore AB10533 1/1,000 dilution
Rabbit anti human TH antibody Pel Freez P40101 1/500 dilution
Chicken anti human TH antibody Millipore AB9702 1/500 dilution
Mouse anti human TUJ1 antibody Covance MMS-435P 1/,2000 dilution
Rabbit anti human GIRK2 antibody Abcam ab30738 1/300 dilution
Rabbit anti human Calbindin antibody Abcam ab25085 1/400 dilution
Centrifuge Eppendorf 5804

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
  4. Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
  5. Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
  6. Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  7. Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
  8. Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
  9. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
  10. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
  11. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
  12. Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
  13. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
  14. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  15. Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
  16. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
  17. Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
  18. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  19. Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
  20. Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
  21. Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
  22. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics