المحفظة المصلي من
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne

Published 9/25/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection
 

Summary

اختبار تراص اللاتكس هو طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة للالتصنيف المصلي العقدية الرئوية، وكما تم تطبيقها على نطاق واسع في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي. تصف هذه المخطوطة إنتاج في المنزل من الكواشف تراص اللاتكس، وإجراءات مراقبة الجودة وتطبيق هذه التقنية لالمصلي المكورات الرئوية.

Cite this Article

Copy Citation

Porter, B. D., Ortika, B. D., Satzke, C. Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination. J. Vis. Exp. (91), e51747, doi:10.3791/51747 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

العقدية الرئوية (المكورة الرئوية) هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في الأطفال دون سن الخامسة من العمر، وخاصة في البيئات الفقيرة بالموارد 1،2 في جميع أنحاء العالم. يتراوح مرض الالتهاب الرئوي من العدوى المحلية إلى الظروف التي تهدد الحياة مثل الالتهاب الرئوي والإنتان والتهاب السحايا 1،2.

أكثر من 90 من الأنماط المصلية المكورات الرئوية تم تحديدها على أساس الاختلافات في السكاريد المحفظة الخاصة 3. اللقاحات الحالية تستهدف السكاريد المحفظة وتوفر الحماية من الأنماط المصلية الرئيسية المسببة للأمراض الغازية 4. التصنيف المصلي المكورات الرئوية المعزولة المهم لتقييم تأثير التطعيم على النقل والمرض وكذلك توفير المعلومات الوبائية أوسع نطاقا 5،6. الطريقة الحالية "المعيار الذهبي" لالمصلي المكورات الرئوية هو اختبار الانتباج، لكنها تستغرق وقتا طويلا ويتطلب بعض المهارة لperfoRM 7. تراص اللاتكس هو طريقة المصلي بديل أوصت بها منظمة الصحة العالمية 7. تراص اللاتكس هو سريعة وبسيطة لأداء، ويعمل في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم 8-11. الأهم من ذلك، وقد أظهرت تراص اللاتكس دقة مماثلة لاختبار الانتباج للالمصلي المكورات الرئوية 10،12-14. عموما، هذه الطريقة مثالية للبيئات الفقيرة الموارد وكذلك مختبرات إنتاجية عالية.

يتم إنشاء الكواشف تراص اللاتكس ('الكواشف اللاتكس') من المرفق من أجسام مضادة لجزيئات اللاتكس 15. في رد فعل إيجابي، هذه الجزيئات المسمى التصقت في وجود مستضد معين. تتوفر لمجموعة محدودة من الأنماط المصلية الكواشف اللاتكس التجارية. ويمكن أيضا الكواشف اللاتكس تكون مستعدة في المنزل باستخدام أمصال مضادة متاح تجاريا 10. خليط من أمصال مضادة ('حمامات') وكذلك أمصال مضادة محددة لق المكورات الرئويةerogroups (على سبيل المثال، مجموعة 19)، الأنماط المصلية الفردية (مثل المصلي 5)، وإلى مستضدات محددة ("العوامل"، على سبيل المثال، عامل 19C الاعتراف المصلي 19A) متوفرة 16 لمزيد من تحديد الأنماط المصلية ضمن مجموعات.

توضح هذه المخطوطة الخطوات الرئيسية في إنتاج الكواشف اللاتكس باستخدام التعلق السلبي للأمصال مضادة متاح تجاريا لجزيئات اللاتكس. ووصف مراقبة الجودة (QC) جوانب هذه الطريقة، ويتم تضمين بروتوكول لاستخدام الكواشف اللاتكس لالمصلي المكورات الرئوية.

Protocol

1. إعداد في المنزل الكواشف مطاط

  1. إعداد الجلايسين مخزنة المالحة (GBS)
    1. إضافة 1.5 غرام الجلايسين، 11.7 جم كلوريد الصوديوم و 100 مل من الماء المقطر إلى كوب 200 مل دورق.
    2. مزيج بحل باستخدام محرك مغناطيسي.
    3. نقل الخليط إلى 500 مل اسطوانة قياس وإضافة الماء المقطر لجعل ما مجموعه 200 مل.
    4. نقل الحل إلى الدورق 200 مل، والتحقق من الرقم الهيدروجيني وضبط إلى 8.2 مع هيدروكسيد الصوديوم M 5. ملاحظة: هيدروكسيد الصوديوم هو تآكل، ارتداء معدات الوقاية الشخصية.
    5. فلتر تعقيم الحل باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر وعدة 60 مل المحاقن في زجاجة 250 مل preautoclaved المسمار المغطاة.
    6. تخزين في RT.
  2. إعداد GBS مع 0.2٪ ألبومين المصل البقري
    1. إضافة 0.2 غرام من ألبومين المصل البقري (BSA) مسحوق و 100 مل من GBS إلى كوب 200 مل كوب وخلط بحل باستخدام محرك مغناطيسي.
    2. فلترتعقيم الحل من خلال 0.22 ميكرومتر مرشحات باستخدام عدة 60 مل مل المحاقن إلى preautoclaved المسمار زجاجة توج 250.
    3. تخزينها في 4 درجة مئوية.
  3. إعداد اللاتكس كاشف
    1. تسمية 2 مل جولة القاع microfuge أنبوب.
      ملاحظة: جولة وتستخدم أنابيب أسفل لتقليل ترسيب الجسيمات التي قد تؤثر على مرفق الأجسام المضادة.
    2. باستخدام ماصة P1000 مع نصائح عقيمة إضافة 975 ميكرولتر من GBS في microfuge أنبوب، ثم إضافة 25 ميكرولتر من مصل المكورات الرئوية المناسب للكاشف يجري إعداد اللاتكس (أي تجمع أو جماعة أو نوع أو عامل). عكس خمس مرات لخلط.
    3. تمييع جزيئات البوليستيرين اللاتكس 01:10 بإضافة 120 ميكرولتر من جزيئات اللاتكس إلى 1،080 ميكرولتر من المياه المالحة الفسيولوجية العقيمة.
      ملاحظة: هذا يمكن أن يتم في حجم أكبر، ولكن ينبغي بذل العذبة في كل مرة يتم إنتاج الكواشف اللاتكس.
    4. إضافة 1،000 ميكرولتر من تعليق 01:10 اللاتكس (المعد في الخطوة 1.3.3) إلى 1،000 ميكرولتر مصل 01:40 تعليق (المعد في الخطوة 1.3.2). عكس خمس مرات لخلط.
    5. احتضان عند 37 درجة مئوية على عجلة دوارة ببطء (على سبيل المثال، 4 دورة في الدقيقة لعجلة من 38.5 سم القطر) لمدة 2 ساعة.
    6. الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 1،100 ز س. تجاهل طاف و resuspend بلطف بيليه في 2 مل من محلول ملحي معقم.
    7. الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 1،100 ز س. تجاهل طاف وإضافة 1 مل من GBS و resuspend بلطف بيليه.
    8. ماصة تعليق اللاتكس إلى المسمى 5 مل المسمار توج الأنبوب. إضافة 1 مل أخرى من GBS.
    9. إضافة 2 مل من GBS تحتوي على 0.2٪ BSA (ث / ت) (8.2 درجة الحموضة) (المعد في الخطوة 1.2). إضافة 40 ميكرولتر من 10٪ (ث / ت) حل أزيد الصوديوم كمادة حافظة.
      ملاحظة: أزيد الصوديوم خطرة في حالة استنشاقه، وهو مهيج الجلد والعين. فمن المستحسن لشراء استعداد حل 10٪ بدلا من شكل مسحوق، وهذا يقلل من مخاطر التعرض للاستنشاق. معدات الحماية الشخصية (بما في ذلك القفازات ووينبغي ارتداء نظارات واقية د البداية) عند التعامل مع هذا كاشف. الرجوع إلى ورقة بيانات السلامة المادية للحصول على التفاصيل.
    10. الكواشف متجر اللاتكس في 4 درجات مئوية.
  4. إعداد سيطرة سلبية لاتكس كاشف
    1. تسمية 2 مل جولة القاع microfuge أنبوب.
      ملاحظة: جولة وتستخدم أنابيب أسفل لتقليل ترسيب الجسيمات التي قد تؤثر على مرفق الأجسام المضادة.
    2. باستخدام ماصة P1000 مع نصائح عقيمة إضافة 975 ميكرولتر من GBS في microfuge أنبوب، ثم إضافة 25 ميكرولتر مصل الأرنب العادي. عكس خمس مرات لخلط.
    3. والمضي قدما في خطوات 1.3.3 إلى 1.3.10 فوق

2. مراقبة الجودة (QC) من مطاط الكواشف

  1. جلب اللاتكس كاشف لRT. فورا قبل الاستخدام، مزيج بلطف كاشف اللاتكس بواسطة قلب الأنبوب عدة مرات.
  2. تحقق كاشف للتراص ذاتي من قبل pipetting 15 ميكرولتر على شريحة المجهر والزجاج، وتابع كما في الخطوات 4.7 و 4.8 أدناه. يجب أن يكون هناك وgglutination من جزيئات اللاتكس. يجب أن تظهر كاشف بيضاء وناعمة.
  3. اختبار كاشف ضد فريق من مرور منخفض عزلات المكورات الرئوية. استخدام الثقافات نمت حديثا أعد كما في الخطوة 3. لوحة من العزلات ينبغي أن تشمل العزلات من 'الهدف' النمط المصلي (النمط المصلي محدد للكاشف يجري اختبارها) والأنماط المصلية "غير المستهدفة" (العزلات من الأنماط المصلية الأخرى التي لا ينبغي عبور عادة تتفاعل مع كاشف). تشمل عزلة واحدة على الأقل من كل المستهدفة وغير المستهدفة المصلي لكل كاشف اللاتكس تمر QC. إذا كان هناك هدف أو المصلي غير المستهدفة، اختبار واحد فقط اثنين من عزلات مختلفة من النمط المصلي معين.
    ملاحظة: يجب أن تتضمن لوحة اختبار عدة عزلات من كل المصلي، بعضها شائع في مرض الغازية و / أو مجموعات نوع الثقافة. فمن الأفضل أن تشمل يعزل بعض النقل، كما أنها غالبا ما تكون أكثر تطلبا للالمصلي (لا تظهر البيانات)، وبالتالي زيادة اختبار قدرة سو الكواشف وضمان الكواشف قادرة على الأرجح من التصنيف المصلي سواء الغازية والنقل يعزل.
  4. المضي قدما في اختبار الكواشف اللاتكس مع الهدف والمكورات الرئوية غير المستهدفة يعزل حسب الطريقة الموضحة في الخطوات 3 و 4 أدناه.
  5. الكواشف لمراقبة الجودة في وقت الإنتاج ومن ثم على الأقل سنويا بعد ذلك.
    ملاحظة: إذا لم كاشف تمر QC، لا بد من التخلص منها دفعة وإعداد الجديدة مصنوعة. في حال عدم تكرار QC نوصي أن تنتج الكواشف باستخدام الطرق البديلة وصفها في Ortika وآخرون 2013 و8 في المناقشة أدناه.

3. التحضير للثقافات الرئوية للالمصلي

  1. باستخدام حلقة عقيمة اختيار مستعمرة واحدة من المكورات الرئوية عزل وهذا متتالية من الصعود إلى أجار الدم اانتقائي الصلبة بحيث يغطي اللقاح الأولي حوالي ثلث سطح اللوحة. خط للمستعمرات واحدة.
    ملاحظة: لوحات أعدت من الحصان مزال الفبرين أو الأغنام الدم هي مناسبة؛ ولكن لوحات الدم أعدت مع دم الإنسان أو دم الحيوان سيتراتية ليست كذلك.
  2. احتضان لوحة O / N عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2.
  3. مراقبة النمو على لوحة للنقاء وتقييم أن هناك نمو كاف للالمصلي.
    ملاحظة: ثقافة نقية من عزل المكورات الرئوية مطلوب للالمصلي. في تجربتنا، متموجة، أو بالقرب متموجة النمو تغطي حوالي ثلث سطح لوحة عادة ما يكون كافيا لإكمال المصلي. كما ثقافات الرئوية قد تكون عرضة للانحلال ذاتي، يجب اختبار الثقافات التي أعدت لالمصلي خلال 24 ساعة من ثقافة فرعية. لا تأخذ لوحة الثقافة من الحاضنة أكثر من 15 إلى 20 دقيقة قبل أن يبدأ المصلي.

4. إجراء تراص اللاتكس المصلي

  1. إزالة جميع الكواشف اللاتكس من الثلاجة والسماح لهم نستريح لRT لحواليimately 30 دقيقة. فورا قبل الاستخدام، عكس بلطف أنابيب لخلط الكواشف.
  2. تسمية شريحة المجهر.
  3. وضع 15 ميكرولتر من السيطرة سلبي اللاتكس كاشف على الشريحة المجهر.
  4. باستخدام العقيمة المتاح 1 ميكرولتر حلقة اتخاذ اكتساح الثقافة الرئوية بحيث تكون الحلقة ما يقرب من نصف كاملة.
  5. تشويه بلطف اللقاح على سطح الشريحة قريبة من قطرة سلبي السيطرة اللاتكس كاشف. يجب أن يكون اللقاح مرئية على شريحة زجاجية.
  6. بسرعة وبدقة خلط اللقاح في السلبي كاشف السيطرة المطاط باستخدام حلقة. تأكد من أن انخفاض لا ينتشر إلى أبعد من حجمها الأولي.
  7. التقاط الشريحة، وعقد في كلا الجانبين. صخرة الشريحة ذهابا وإيابا لمدة 1 دقيقة. العناية للحفاظ على السائل تتحرك ببطء، والتأكد من أن حجم الانخفاض لا يزيد.
    ملاحظة: بدلا من استخدام لوحة الروك.
  8. مراقبة لتراص العيانية (أي بواسطةبالعين المجردة) والمقاصة للتعليق على خلفية سوداء.
  9. إذا أظهر السلبي السيطرة اللاتكس كاشف لا تراص أو تستمر المقاصة اختبار الثقافة، لتحل محل الكواشف اختبار اللاتكس لمراقبة سلبي اللاتكس كاشف في الخطوات 4،1-4،8 أعلاه. يجب استخدام حلقة جديدة في كل مرة. المضي قدما في اختبار الكواشف اللاتكس بدءا من برك.
  10. اختبار كل من "بركة" الكواشف اللاتكس في سلسلة متوالية حتى يتم الحصول على النتيجة الايجابية.
    ملاحظة: ترتيب اختبار يمكن أن يتم في "جولات" برك لتعكس حدوث المحلي من الأنماط المصلية معينة (على سبيل المثال، عن طريق اختبار لثلاثة حمامات الأرجح على الشريحة الأولى وإذا لم يتم الحصول على رد فعل إيجابي، ثم اختبار في اليوم التالي ثلاثة على الأرجح من حمامات المتبقية على الشريحة الثانية، وهلم جرا حتى يتم الحصول على رد فعل إيجابي). هذا يضمن أن الأنماط المصلية الأكثر شيوعا ويتم اختبار أولا، تقليل الوقت والكواشف اللازمة.
  11. باستخدام مفتاح الشركة المصنعة أمصال مضادة لتحديد أي أمصال مضادة فرد تتمثل في تجمع إيجابي.
  12. اختبار كل مجموعة من المجموعات أو الأنواع الواردة في تجمع إيجابي بشكل فردي لتحديد 'مجموعة' أو 'نوع' كما هو الحال في الخطوات 4،1-4،8 أعلاه.
  13. تحديد نتيجة بالرجوع إلى مفتاح الشركة المصنعة أمصال مضادة ل. إذا يتم تحديد "نوع '(على سبيل المثال، النمط المصلي 5)، ثم لا حاجة لمزيد من الاختبارات ويتم تسجيل هذه النتيجة.
  14. إذا يتم تحديد 'المجموعة' (على سبيل المثال، مجموعة 19)، ثم ترجع إلى مفتاح المصنعين لتحديد العوامل التي سيتم اختبارها. مواصلة التجارب الفردية مع "عامل" الكواشف اللاتكس وتحديد النمط المصلي النهائي (على سبيل المثال، 19B المصلي).

Representative Results

يحدث رد فعل إيجابي لاتكس عند نوع معين الأجسام المضادة التي تعلق على الجسيمات اللاتكس بربط كبسولة من المكورات الرئوية، وتراص من الأجسام المضادة المسماة جزيئات تستتبعه 15. يبين الشكل 1A رد فعل إيجابي التي تتميز تراص مرئية والمقاصة من الخلفية تعليق. ويتسم رد فعل سلبي من قبل تراص اللاتكس كاشف تعليق المتبقية على نحو سلس والأبيض (الشكل 1B). هي الأمثل الكواشف بحيث ينبغي مراعاة رد فعل إيجابي قبل نهاية الفاصل الزمني دقيقة واحدة (عادة اكتشافها في حوالي 20 ثانية). لا نوصي قراءة ردود الفعل بعد الفاصل الزمني 1 دقيقة. أحيانا جدا، عرض ردود الفعل الضعيف تراص حول حافة الهبوط الذي لا يرافقه تطهير لتعليق الخلفية، أو تظهر "مفتول العضلات" مع عدم وجود خلفية المقاصة (لا تظهر البيانات). هذه هي الأكثر مثل لاي ردود فعل سلبية. في مثل هذه الحالات، من المستحسن إعادة الاختبار و / أو إجراء مزيد من التحقيقات باستخدام طريقة أخرى المصلي (على سبيل المثال رد فعل الانتباج 17).

الشكل 1
الرقم 1. ردود الفعل تراص اللاتكس الإيجابية والسلبية. محضرات من المكورات الرئوية عزلها مختلطة مع تراص اللاتكس كاشف يظهر رد فعل إيجابي (A) أو رد فعل سلبي (B). ويعتبر تراص يرافقه المقاصة من الخلفية في رد فعل إيجابي (A) وليس هناك تراص مرئية السلبي مع سيطرة اللاتكس كاشف أو في اختبار رد فعل سلبي (B). الصور 8 تستخدم مع إذن."الهدف =" _ على بياض "> الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تراص اللاتكس هو طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة لالمصلي المكورات الرئوية. هي المكورات الرئوية التجارية الكواشف تراص اللاتكس المتاحة، ولكنها حاليا لا تفرق عن المكورات الرئوية المعروفة الأنماط المصلية 10،12. ومع ذلك، لاتكس الكواشف تراص يمكن أن تنتج بسهولة في المنزل باستخدام أمصال مضادة شراؤها التي أثيرت ضد مستضدات معينة محفظية الرئوية. في الطريقة الموصوفة هنا، وترد بشكل سلبي الأجسام المضادة لجزيئات اللاتكس لجعل مجموعة من الكواشف تراص اللاتكس.

يحدث رد فعل إيجابي عندما اللاتكس أجسام مضادة محددة منضمة إلى جزيئات اللاتكس نعلق على مستضدات على كبسولة السكاريد من المكورات الرئوية عزل 18،19. جزيئات اللاتكس تعلق على الأجسام المضادة تسمح ردة فعل معينة الضد مستضد أن تصور بدون تكبير.

تراص اللاتكس هي طريقة مناسبة لمختبرات إنتاجية عالية ود أيضا للبيئات الفقيرة الموارد. المزايا الرئيسية لطريقة تراص اللاتكس هي ما هو مطلوب أي معدات متخصصة لأداء الاختبار، الكواشف لديها الصلاحية لا يقل عن 2 سنوات عند تخزينها في 4 درجات مئوية وأنها غير مكلفة وبسيطة وسريعة لأداء. التصنيف المصلي لعزل المكورات الرئوية من تراص اللاتكس يستغرق حوالي 10 دقيقة، ويمكن اختبار ما يصل إلى أربعة الكواشف اللاتكس بالتوازي على شريحة واحدة. وعلاوة على ذلك، إذا كان من المعروف انتشار الأنماط المصلية لتحديد وبائية ذات الصلة، والاختبار لا يمكن أن يؤديها في جولات بدءا من أحواض تحتوي على الأنماط المصلية الأكثر شيوعا على غرار اختبار الانتباج 17. هذا النهج يقلل من عدد من الاختبارات اللازمة لتحديد النمط المصلي. هذه الطريقة أيضا تكرار للغاية بين المشغلين مختلفة (لا تظهر البيانات). عيوب تراص اللاتكس المصلي هو أن إنتاج الكواشف وقتا طويلا، مع حوالي 4 ساعة. على الرغم من الكواشف متعددةيمكن بسهولة أن تنتج اليلة بشكل متواز. وعلاوة على ذلك، بعض المضادات شائعة عبر الأنماط المصلية الرئوية المختلفة، مما أدى إلى ردود فعل عبر مع بعض أمصال مضادة (على سبيل المثال، النمط المصلي 29، 42 والمجموعة 35). ومع ذلك، تتميز هذه التفاعلات عبر جيدا عند استخدام أمصال مضادة التجاري (والتي عادة ما preabsorbed لإزالة الأجسام المضادة عبر التفاعل أكثر إشكالية) والجداول رد فعل إضافية يتم توفيرها من قبل الشركة المصنعة من أجل التمييز التي المصلي هو الحاضر. تتفاعل الكواشف اللاتكس قد تعبر أيضا إذا لم يتم محاذاة الأجسام المضادة بشكل صحيح على جزيئات اللاتكس. تم الكشف عن هذه الإخفاقات ومراقبة الجودة. في تجربتنا، QC صارمة أمر أساسي لنجاح هذه الطريقة، حتى عند استخدام أمصال مضادة المتاحة تجاريا للإنتاج. QC يستغرق حوالي 15 دقيقة لكل كاشف وتعتمد على مجموعة من العزلات QC المناسبة كما هو موضح أعلاه.

الطريقة الموصوفة هنا النتائج في الكواشف التي تعطي رد فعل إيجابي جيدا وايرقيقة فترة الاختبار. في تجربتنا، وايجابيات كاذبة نادرة في الممارسة (لا تظهر البيانات). ويلاحظ ردود فعل سلبية كاذبة في بعض الأحيان. عادة ما تتصل هذه المشكلات المعروفة مع مصل معين (على سبيل المثال، الزمرة المصلية 6 العزلات قد لا تتفاعل مع تجمع مصل B)، أو تنظيم لأسفل من كبسولة التعبير من قبل عزل. باستخدام algrorithm التصنيف المصلي المقدمة من قبل الشركة المصنعة المهم أيضا، كما هو الحال في معظم الحالات رد فعل إيجابي أو سلبي كاذبة ستؤدي الى نتيجة "نهاية عمياء". في هذه الحالات، وعندما يصعب تفسير ردود الفعل، ونحن نوصي تكرار الاختبار و / أو اختبار بواسطة طريقة بديلة مثل رد فعل الانتباج.

مطلوب بعض المشاكل أحيانا إلى جعل الكواشف اللاتكس مرضية. في طريقة وصفها هنا، يتم إرفاق أجسام مضادة لجزيئات اللاتكس عبر الامتزاز السلبي 15،19، لذلك المتغير الحاسم هو تركيز الأجسام المضادة المستخدمة، والذي يحدد مدىيتم تغطية سطح جزيئات اللاتكس والمحاذاة لاحقة من الأجسام المضادة المواقع المفعلة 15،20. بالتالي، إذا تم إرفاق كافية أو الزائد الأجسام المضادة للجزيئات اللاتكس، ردود فعل الضد مستضد لن يكون الأمثل، ويمكن أن تنتج المواد الكيميائية غير مرضية 15،20،21. كما التتر الضد تختلف بين الكثير مختلفة من أمصال مضادة، مجموعة قياسية من التخفيفات قد لا تنتج الكواشف التي تحقق أداء جيدا 8. وهناك نقطة انطلاق مفيدة هو استخدام 01:40 التخفيف من مصل، وإذا لم يكن هذا بنجاح، يخفف من مصل أبعد من ذلك. في تجربتنا هذه عادة حل المشكلة 8. في عدد قليل من الحالات قد تظهر الكواشف ضعيفة تراص الذي لا يرافقه المقاصة لتعليق عند اختباره مع يعزل الهدف. في هذه الحالات تمييع مصل لا تحسين نوعية الكاشف، ولكن يمكن عادة أن تنتج الكواشف مرضية، بحذف الطرد المركزي وغسل الخطوات 8،22

وتستخدم الأجسام المضادة المغلفة الجسيمات اللاتكس عادة في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي للكشف وتحديد أو المصلي العديد من الميكروبات المختلفة 15،20. على هذا النحو، فإن الطريقة الموصوفة هنا قد تكون مناسبة لإعداد الكواشف اللاتكس لأغراض أخرى، شريطة أمصال مضادة مناسبة متاحة ويتم اعتماد إجراءات مراقبة الجودة الكافية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microparticles based on polystyrene, 800 nm Sigma 65984-10 ml-F Or other volumes as required
Normal rabbit serum Antibodies Australia  NRS-1ml Or other volumes as required, bring to RT before use
Pneumococcus (Neufeld) antisera SSI Diagnostica Various Bring to RT before use
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Sterile Bovine Albumin  Sigma A-4503 Bring to rRT before use
Sodium azide 10% (v/v) solution  VWR International ROAC3902/100ml Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml Eppendorf 0030 120.094 Round bottom
Sodium chloride Merck 10241.AP
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl Copan CD175SO1
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm Thermo Fisher Scientific LBS 2950RC
5 M NaOH BDH 10252 Caution: highly corrosive
Glycine Merck 10119.05
Horse Blood Agar (HBA) plates Thermo Fisher Scientific PP2001 Bring to RT before use
http://www.thermofisher.com.au
Rotating wheel Wyble Engineering Development Corporation
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml Technoplas S5016SU
60 ml syringes without needles Terumo SS-60L
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RS
Brochure on Neufeld antisera Statens Serum Institut Key to determining serotypes
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Key to pneumococcal factor serum Statens Serum Institut 18058 For determining serotype within Groups
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
*alternative sources are available for most materials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudan, I., et al. Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries. J Glob Health. 3, (10401), (2013).
  2. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  3. Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
  4. Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).
  5. Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
  6. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
  7. Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. (2013).
  8. Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping. BMC Res Notes. 6, (49), (2013).
  9. Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).
  10. Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex). J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).
  11. Turner, P., et al. Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray. J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).
  12. Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae. J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).
  13. Lalitha, M. K., et al. Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries. Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).
  14. Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates. J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).
  15. Gella, F., Serra, J., Gener, J. Latex agglutination procedures in immunodiagnosis. Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).
  16. Pneumococcus Key to S. pneumoniae types and pneumococcal diagnostic antisera. SSI Diagnostica. Available from: http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013).
  17. Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction. J. Vis. Exp. (84), (2014).
  18. Arai, S., et al. Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae. Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).
  19. Lafong, A. C., Crothers, E. Simple latex agglutination method for typing pneumococci. J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).
  20. Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests. J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).
  21. Yap, K. L. Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection. Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).
  22. Severin, W. P. Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis. J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats