마우스의 피부와 모낭 패터닝 및 감각 축삭 형태학의 분석에의 응용의 평면 마운트 이미징

Neuroscience

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Summary

이러한 모낭과 신경 엔딩으로 - - 공간 조직의 독특한 패턴을 전시 포유류의 피부 구조의 다양한 배열을 포함합니다. 플랫 마운트로 피부를 분석하는 것은 피부 구조의 전체 두께의 고해상도 이미지를 생성하기 위해이 조직의 2 차원 적 형상을 이용한다.

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Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology. J. Vis. Exp. (88), e51749, doi:10.3791/51749 (2014).

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Abstract

피부가 매우 이질적인 조직이다. 내 피부 구조는 모낭, arrector의 필리 근육 (예 : 메르켈 세포 클러스터 등) 표피 전문, 피지 분비, 신경 및 말초 신경과 모세 혈관이 (가) 있습니다. 이러한 구조의 공간적 배치는 밀접 미시적 제어된다 - 것과 같이, 예를 들면, 단일 모낭 내의 세포 유형의 질서 배열 - 및 거시적 규모 - 헤어 수천의 거의 동일한 배향으로 보이는 피부의 로컬 영역 내에서 난포. 물리적으로 피부를 구획하지 않고 이러한 구조를 떠올리 때문에이 기관의 2 차원 형상으로 할 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 마우스의 피부, 해부 고정 per​​meabilized, 염색, 및 손상되지 않은 두 개의 차원 개체, 평평한 산으로 명확히 할 수 있음을 보여준다. 이 프로토콜은 OPT에 의한 피부의 넓은 영역의 전체 두께를 통해 전체적으로 피부의 구조를 쉽게 시각화 할 수 있습니다iCal의 단면과 재건. 이러한 구조의 이미지는 몸 축에 위치 자세 관계에 관한 정보를 통합 할 수있다.

Introduction

피부는 somato - 감각, 절연 / 온도 조절, 및 면역 방어 1 중요한 기능과 몸에서 가장 큰 기관 중 하나입니다. 피부 개발 및 기능의 분자 및 세포 기초를 이해하기 때문에 생물학적 시스템과 피부과의 관련성 등 피부의 근본적인 중요성의 오랜 관심이었다. 포유류의 피부는 각질 세포의 층리, 피부 결합 조직, 모낭의 여러 종류, 피지선, arrector의 필리 근육, 혈관, 그리고 심성의 12 개 이상의 서로 다른 클래스 (감각)와 원심성 신경을 포함한 다세포 구조의 다양한 포함 섬유 (그림 1). 신체의 다른 영역은 피부의 특징적으로 다른 유형과 연결되어 있습니다. 대부분의 포유 동물에서 거의 몸 전체 표면을 조밀하게 머리 여포로 포장되어 피부에 덮여있다. [인간과 알몸 두더지 쥐 일까지 예외를 구성패턴입니다.] 머리는 전문 표피의 패턴 (dermatoglyphs), 외분비 샘, 감각 신경 말단에 연결된 손과 발,의 손바닥 표면에서 누락되었습니다. 성장, 분화, 그리고 모낭 내 세포의 공간 배열을 제어하는 세포 및 분자 사건은 기관 형성 (2)의 중앙의 여러 기능, 미니어처, 각각의 모낭의 전시와 같은 특별한 관심입니다. 이러한 기능은 줄기 세포의 존재와 줄기 세포 틈새 정확하게 안무 세포 마이그레이션 및 발생 학적으로 서로 다른 구성 요소에서 다세포 구조의 조립이 (가) 있습니다.

이 문서는 해부하는 방법을 설명, 고정, 라벨, 그리고 그대로 두 차원 시트와 같은 이미징 마우스의 피부는 "전체 산"또는 "평면 마운트"준비라고합니다. 마우스의 피부는 비교적 얇기 때문에, 평면화 스키의 전체 두께를 통해 화상에 가능한N 기존의 공 초점 현미경을 사용하여. 그것이함으로써 구조 광학 절편 전적으로 재구성 될 수 있도록, 물리 절편에 대한 필요성을 무시하므로 포유류 피부를 이미징 평면 실장 방식은 기술적으로 유리하다. 거의 전체 피부가 단일 객체로서 처리되기 때문에, 플랫 몸 축에 위치 자세 관계에 관한 정보를 유지하면서 접근 방법은 또한 신체 표면의 복수의 영역의 영상을 용이하게 탑재. 마지막으로, 피부 내 구조는 일반적으로 이와 관련 구조의 체류 대표자의 이미지의 수집을 용이하게 일정한 간격으로 반복되는 패턴으로 존재한다. 이러한 특성은 망막 신경 세포의 형태 (3)의 연구에 대해 유사한 이점을 즐긴다 중추 신경계의 이차원 부분에서 작동 신경 생물 학자에게 익숙하다.

여기에 설명 된 평면 마운트 방식은 특별한 utilit입니다피부의 2 차원 평면 내에서 상대적으로 큰 규모의 공간 조직을 나타내는 구조를 연구하기위한 Y. 메르켈 세포 클러스터, arrector의 필리 근육, 피지 분비, 신경 엔딩 4 - 큰 규모의 공간 조직의 한 예는 모낭과 모낭 관련 구조 조정 극성입니다. 모낭은 피부의 평면에 대하여, 그리고 피부의 2 차원 평면 내에 놓여 여포 벡터의 성분과의 각도로 배향되고, 일반적으로 각각 정확하게 판정 몸 축에 대하여 방향을 나타낸다 몸에 위치. 예를 들어, 주동이에서 다시 포인트에 모낭이 꼬리 지느러미하고 발 등의 표면에 머리는 말단에 근위에서 가리 킵니다. 모낭의 방향은 평면 세포 극성 신호에 의해 제어된다 (PCP;라고도 조직의 극성 5). 이 신호 시스템은 초파리에서 발견 된 곳에 작은코어 PCP 유전자 세트 cuticular 털이 털의 방향을 제어하는​​ 것으로 밝혀졌다. EGF는 7 회 G-타입 수용체 1 (Celsr1), 및 방비와 같은 2 (Vangl2를) LAG cadherin의 frizzled 상동 6 (도 FZ6이라 Fzd6는,), - - 코어 PCP 유전자의 세 가지 포유 동물 orthologues 포유류에서 유사한 역할을 피부, 몸의 축이 모낭의 방향을 조정. PCP 신호가없는 상태에서 기본 결함이 여포의 본질적인 구조에 영향을 미치지 않고, 모낭 방향의 초기 무작위 또는 해체 것을 보여 FZ6 녹아웃 마우스 (- - / 이하 FZ6가라고도 Fzd6 tm1Nat)의 연구 6-8. 두 번째 비 PCP 시스템은 윤 생체과 술 등의 대규모 머리 패턴의 생산에 이르게 근처 여포의 지역 정렬을 촉진하기 위해 나중에 역할을합니다.

대규모의 제 2 예피부 내의 공간 조직은 감각 축삭 아버의 형태학에서 볼 수있다. 피부에 신경을 분포시키다 감각 뉴런은 지느러미 루트 및 삼차 신경에 자신의 세포 기관이있다. 이 신경 세포는 온도, 통증, 가려움, 피부 및 머리 9 충돌 기계적 변형의 다양한 유형을 감지합니다. 이들은 축삭 직경 및 전도 속도, 단말 말초 신경 구조, 및 수용체, 채널 및 다른 분자의 발현 패턴에 따라 하위 유형으로 구분 될 수있다. 때문에 피부 내 신경 분포의 높은 밀도, 즉 (하나의 세포 유형이 형광 기자의 식으로 표시되는 경우와 같이) 모든 축삭 (예를 들면, 반대로 신경 미세 섬유 면역 염색) 또는 단일 클래스의도 모든 축삭을 시각화 관련 분석 일반적으로 불가능 개별 정자의 형태를 정의 할 수 있습니다 축색 돌기의 밀도가 중첩는 보여준다. 이 문제를 회피하기 위해, 우리는 매우 드문 드문 유전자 감독 L을 사용했습니다abeling 개별 잘 격리 된 축삭 아버가 조직 화학적 기자, 인간의 태반 알칼리 포스 파타 아제 (10)의 표현에 의해 가시화되는 등의 피부 샘플을 생성한다. 이 방법은 각각의 축삭 아버 형태학의 명확한 시각화 및 형태 학적 기준에 따라 체성 감각 신경 세포 유형의 정의를 할 수 있습니다.

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Protocol

이 연구는 건강의 국립 연구소의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 설치 하였다. 모든 동물은 승인 기관의 동물 관리 및 사용위원회 존스 홉킨스 의료 기관의 (IACUC) 프로토콜 MO11M29에 따라 처리 하였다. 안락사의 승인 방법은 해당 지역의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 가이드 라인을 참조하십시오. 알데히드 고정 제 또는 유기 용제를 취급 할 때는 장갑, 실험실 코트, 보호 안경을 착용한다.

재료 1. 준비

  1. 실 가드 플레이트를 붓는
    1. 제조업체의 지침에 따라베이스와 경화제를 혼합하고, 플라스틱 막대로 저어.
    2. 피펫 ~ 35 ㎖의 액체 실 가드 10cm 직경의 조직 배양 접시 당. 조직 배양 접시는 표준 세균 요리보다 더 깊은입니다; 이 곤충 핀에 대한 수직 간격을 제공합니다.
    3. 디 배치밤새 실온에서 수평면에 대요. 혼합 과정에서 형성된 거품이 사라집니다.
    4. 중합 후, 실온에서 실 가드 플레이트를 저장합니다.
      참고 : 실 가드가 플레이트에서 분리 될 때까지 실 가드 플레이트를 여러 번 년간 실온에서 저장하고 다시 사용할 수 있습니다.
  2. 솔루션
    1. 벤질 벤조 에이트 및 벤질 알콜 (BBBA). 2 볼륨 벤질 벤조 에이트와 1 볼륨 벤질 알코올을 혼합. 유리 마개 또는 테플론 위에 유리 병에 어두운에 보관.
      주의 : BBBA 사용은 적절하게 유기 용제 폐기물로 처리해야합니다. BBBA 플라스틱에 닿지 않도록하십시오.
    2. 인산염은 식염수 (PBS)를 버퍼. 80 ml의 물에 4g PFA를 추가, 70 ° C가 ~ 5 분 동안 PFA가 완전히 용해 될 때까지 ~에서 뜨거운 접시에 저어, 0.1 ml의 1 N의 NaOH를 추가 한 다음 10 ㎖의 10 배 PBS를 추가하고 100에 볼륨을 일정하게 물 ML.
      주의 : 포름 알데히드 / PFA 및 BBBA 증기를 흡입해야한다덮여 용기에이 솔루션을 유지하여 최소화. 포름 알데히드 / PFA는 발암 물질입니다.
    3. 오일 레드 O. 이소프로판올에 0.5 %의 주식을 준비합니다. 사용 직전에 0.3 % 오일 레드 O의 최종 농도로 물로 희석 한 후 0.2 ㎛의 필터를 통해 필터링.

2. 피부 절개, 고정, 제거 및

  1. 면역 염색과 멜라닌 이미징 피부를 이룬다
    1. 아주 어린 쥐 (예를 들어, 태아 및 출생 후의 날 (P) 0-P3 새끼)의 경우, 이소 플루 란 흡입 쥐를 안락사. 이소 플루 란 흡입 또는 자궁 경부 전위 다음 케타민 / 자일 라진 주입하여 이상 쥐를 안락사.
    2. 전기 면도기와 제모 젤 머리를 제거합니다. P8보다 어린 쥐의 경우,이 단계를 건너 뛸 수 있습니다.
    3. 귀 끝까지 측면을 진행, 각 사지의 기본의 등쪽에 전달, 각 측면을 따라 꼬리의 기지에서 가로 컷을 만들기 위해 면도날을 사용하여코에 주입.
    4. 조심스럽게이 집게에 의해 손상되지 않도록 장갑을 낀 손가락 사이의 피부를 잡고 전방에 후방에서 기본 조직 절차의 피부가 껍질. 귀 수준에서 피부를 박리 할 때, 먼저 가위로 귀를 잘라 피부가이 위치에 눈물 수있는 특히 천천히 진행합니다.
    5. 이 시점에서 이후, 위로 향하도록 안쪽으로 피부의 방향. ~ 20 곤충 핀 균등 둘레 이격 함께 실 가드로 피부를 핀 피부 (그림 2B)를 통해 스트레치를하지 않습니다. PBS의 20 ML로 피부를 커버.
    6. 겸자가 피부에 침투 할 위험을 최소화하기 위해 수평 대향 포셉 뾰족한 단부와 각진 또는 곡선 집게를 사용하여 피부 - 관련 지방 및 결합 조직을 얻어 해부. 부드럽게 피부 표면에 면봉을 압연하여 피부 아래에 갇혀 된 모든 공기 방울을 돌출.
      주 : 피부가가는 경우편평한 마운트 면역 염색 또는 조직 화학에 사용되는 가능한 결합 조직의 한 많이 제거; 피부는 멜라닌 색소에 따라 모낭을 시각화하는 데 사용하는 경우는, 결합 조직의 적은 완전한 제거는 만족합니다. 태아의 피부는 접착 결합 조직의 최소한의 "청소"를 필요로한다.
    7. 10cm 실 가드 플레이트 당 20 새로​​ 제조 한 4 % PFA / PBS의 ML 또는 10 % 포르말린을 첨가하여 고정 된 피부를 수정하거나 새로 제조 20 ㎖ (피부는 멜라닌 영상 또는 알칼리 포스파타제 (AP) 조직 화학에 사용되는 경우) 2 % PFA / PBS (피부 면역 염색 또는 시각화 형질 전환 각질 (KRT) 17-GFP (11)에 사용하는 경우), 부드럽게 추운 방에서 하룻밤 회전. 다음 날,> 10 분 동안 PBS에 세척.
      참고 : 표준 포르말린 37 %의 포름 알데히드입니다; 따라서, "10 % 포르말린은"3.7 % 포름 알데히드이다.
    8. AP 염색 및 면역 염색의 경우, 3 장에서 계속. 멜라닌 IMAG은ING는 실온에서 부드러운 수평 회전 등급 에탄올 시리즈를 통해 피부 (70 %, 95 %, 100 %), 각 단계의 어느 날, 탈수. 잔여 결합 조직을 제거합니다.
    9. 100 % 에탄올 중에서 피부, 곤충 핀을 제거하고, 원하는 경우, 핀 구멍과 피부의 가장 외주 1~2mm을 제거 가위 피부 손질.
    10. , 10cm 직경의 유리 접시에 피부를 전송 말림을 방지하기 위해 피부에 두 유리 현미경 슬라이드를 배치하고 BBBA 20 ㎖를 추가합니다. 피부 BBBA를 추가하기 전에 유리 슬라이드의 무게로 평탄화되는 것이 중요하므로 BBBA 빠르게 조직을 경화.
    11. 다음 몇 시간 동안, BBBA 피부에 세척 할 수 있도록 몇 초 동안 피부 떨어져 슬라이드를 올립니다.
      참고 : BBBA로 작업 할 때 장갑을 착용 할 것. 피부의 나이와 위치에 따라 BBBA있는만큼 30 %의 수축이있을 수 있습니다.
  2. 머리 여포 Patte의 분석을위한 발 피부rning
    참고 : 일반적으로 검사 연령의 범위는 P1-P8입니다.
    1. 안락사 후, 발 발목 관절 이상 차단하고 발바닥을 통해 복부 표면을 따라 하나의 스트레이트 컷을합니다.
    2. 온화 원위 방향으로 진행 근위, 내부 조직으로부터 피부를 벗긴다.
    3. 피부를 해제하고 내부 표면 (그림 2C)를 향 SYLGARD 그것을 핀 숫자를 잘라. 발 피부에 최소한의 결합 조직이있다.
    4. 형질 전환 Krt17-GFP의 피부는 지금 이미징을위한 준비가되어 있습니다. 2.1 절에 설명 된대로 멜라닌 이미징을위한 고정, 탈수 및 BBBA의 청소를 진행합니다.
  3. 떠올리 피지선을위한 발 피부
    1. 안락사 후, 장갑을 낀 손가락과 엄지 손가락으로 피부 표면에 헤어 리무버 젤을 문질러 머리를 제거; 10 분 동안 기다립니다.
      참고 : 섬세한 발 피부를 손상시킬 수있는 전기 면도기를 사용하지 마십시오.
    2. W, 수돗물로 피부 표면을 화산재 해부 2.2 절에 설명 된대로 실 가드로 피부를 핀.
    3. 실온에서 30 분 동안 1 % PFA / PBS로 고정하고 PBS로 세척 하였다.
      참고 :이 첫 번째 머리 사이클 12시 머리 염색의 최하점을 표시하고, 따라서 피지 분비하기 때문에 첫 번째 출생 후 주 후에 개발 발에 피지 분비를 시각화, 오일 레드 O와 분석을위한 최적의 연령은, P21입니다 보다 용이하게 볼 수있다. 흰둥이 마우스로이 분석은 모든 연령에서 수행 할 수 있습니다. 이러한 C57BL/6J-Tyr의 C-2J로 티로시나 아제 돌연변이 라인에 흰둥이 자손 크로스 색소 돌연변이 생쥐를 구하십시오.
  4. 멜라닌의 분포 분석, 모낭 방향 및 피지선 시각화를위한 꼬리 피부 준비
    1. 안락사 후, 꼬리의 기지 주변 원형 절단 한 다음 그 복부의 얼굴을 따라 꼬리의 길이를 실행하는 종 방향 슬릿을합니다.
    2. <리> 단단히 꼬리 뼈 및 / 또는 하나 포셉 한 쌍의 집게의 두 번째 쌍을 사용하여 피부와 결합 조직의 끝을 잡고 끝에서 시작하여 꼬리의 피부를 벗긴다. 실 가드에 꼬리 피부를 핀.
    3. 멜라닌의 분포와 모낭 방향의 분석을 위해, 수정하고 2.1 절에 설명 된대로 피부를 처리합니다. 피지선의 분석을 위해, 일련의 세그먼트에 꼬리 피부를 잘라 ~ 0.5-1 이전의 고정 길이가 CM 진피 - 표피 부착 13 약화 37 ° C에서 하룻밤 PBS / 5 mM의 EDTA의 피부 조각을 품어.
    4. 부드럽게, 진피에서 표피를 벗겨 실 가드 (내부면을 위로)에 표피를 고정하고, 실온에서 1 시간 동안 4 % PFA / PBS에 고정합니다. PBS로 세척하고, 아래에 설명 된대로 오일 레드 O와 얼룩.
      NOTE : 전기 면도기 및 / 또는 제모 젤 전에 이전 꼬리 피부 (예, P21)를 해부에 사용될 수 있지만, 꼬리 머리가 아니기 때문에 이러한 처리는 선택적이며몸의 다른 부분에 한 밀도.

3. 염색 반응

  1. 인간의 태반 알카라인 포스파타제 (AP) 조직 화학 시각화 축삭 아버 10,14,15 유전자 표지 (그림 3A, B)
    1. 실 가드에 PFA 고정 후, 10cm의 유리 접시에서 수정 된 스킨을 배치하고 PBS / 1 mM의 MgCl2를 아래 잠수함. 부드럽게 내생 포스 파타 아제 활성을 파괴하는 90 분 동안 70 ° C에서의 물을 욕조에있는 접시를 돌린다.
    2. 일반적으로 10 ~ 15을 사용하여 0.1 M 트리스, 산도 9.5, 0.1 M의 NaCl, 50 mM의 MgCl2를, 0.34 ㎍ / ㎖의 NBT, 및 0.175 ㎍ / ㎖의의 BCIP에 실온에서 4-48 시간 배양과 histochemically AP 기자 활동을 시각화 P21의 지느러미 피부 근처의 염색 액의 ML. 비특이적 인 NBT 증착에 축삭 염색 강도 상대의 육안 검사가 최적의 시간 넘어 가지 않도록주의하면서, 해부 현미경 반응을 모니터링합니다. 세 1 시간의 과정을 통해 PBS/0.1의 % 트윈 - 20의 변화, 실 가드에 다시 핀 스킨, 에탄올 시리즈를 통해 피부를 탈수 한 다음에 10cm 접시에 스킨을 전송로 세척하여 반응을 중지 BBBA.
      NOTE : BBBA 천천히 NBT 석출물을 용해. BBBA의 처음 몇 시간 동안 침전 NBT의 벌금 배경 용해 것이다; 결과적으로 BBBA 용액 어둡게하고, 피부가 밝게 할 것이다. 몇 시간 후 신선한 BBBA로 변경합니다.
    3. AP-더러워 피부 촬상 후, 실온에서> 1 시간 동안 에탄올로 전송 한 다음 -20 ℃ 신선한 에탄올에 보관 AP-스테인드 스킨은 신호의 손실없이 몇 달 동안이 방법으로 저장 될 수 있습니다.
  2. 오일 레드 O 염색은 피지선 4 (그림 3C-F)를 시각화
    1. 곤충 핀을 제거하고와, 6 잘 조직 배양 플레이트의 우물에 실 가드 판에서 가볍게 고정 발이나 꼬리 스킨을 전송물론 당 두 개의 피부 샘플까지. 60:40 이소프로판올로 세척 : 물을 실온에서 5 분 동안.
    2. 물 (1.2 절 참조)을 실온에서 2 시간 동안 : 60:40 이소프로판올에 2 ㎖의 0.3 % 오일 레드 O에 얼룩.
    3. 60:40 이소프로판올로 세척 : 물을 물 세척 한 다음 실온에서 5 분을 위해. 피부의 표면은 가능한 한 편평 할 수 있도록주의 깊게 미세 가위 핀홀 등 피부의 가장자리를 멀리 트림.
    4. , 물을 몇 방울 또는 수성 장착 매체를 추가 커버 슬립으로 피부를 커버하고 부드럽게 또한 피부를 평평하게 슬라이드에 커버 슬립을 테이프, 외부면이 위를 향하고있는 슬라이드에 피부를 놓습니다.
  3. 플랫 마운트 면역 염색 4,16,17 (그림 3G, H)
    1. 비대칭 컷 (예를 들면 전방 오른쪽 코너 클립)로 방향을 표시, PFA 고정 피부 (예 : 1cm × 0.5 cm)의 사각형을 잘라. 배양 등을 수행회전 수평 플랫폼에 부드러운 회전 단계를 씻어. 6의 우물에서 - 또는 12 - 웰 조직 배양 플레이트, 잔류 PFA를 제거하는 PBS로 여러 번 씻어에서 시간 5-8에 0.3 % 트리톤 X-100 (0.3 % PBST)와 PBS의 10 ~ 변화로 세척 피부를 투과하는 실내 온도.
    2. 실온에서 5 일 동안 5 % 염소 혈청과 20 % DMSO와 0.3 % PBST에 차 항체와 부화. 명확한 테이프 또는 증발 손실을 제거하기 위해 접착제 플라스틱 접시의 우물을 커버.
    3. 5-8 시간에 걸쳐 0.3 % PBST의 10-15 변화로 세척하고 실온에서 3 일 동안 5 % 염소 혈청과 20 % DMSO와 0.3 % PBST에 차 항체와 부화.
    4. 5-8 시간 이상 0.3 % PBST의 15 번 wash.
    5. 5 분, 20 분마다 각 다음 3X 100 % 메탄올, 25 %, 50 %, 75 %의 메탄올 탈수.
    6. 하룻밤 실온에서 BBBA 클리어.
      참고 : 평면보다 젊은 피부의 면역 염색을 탑재~ P1은 전술 한 바와 같이되지만 짧은 인큐베이션하여 수행 번 세탁 할 수있다. 예를 들어, P1 피부 일차 항체에 하룻밤 배양과 이차 항체에 몇 시간 배양과 면역 염색, 및 0.3 % PBST에 2-3 시간의 세척 개입과 함께 할 수 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 젊은 피부는 또한 그들이 BBBA 청산하지 않고 이미지가 될 수 있다는 것을 충분히 얇다.
  4. 형광등 신경 터미널 염료 통풍과 메르켈 세포 클러스터를 떠올리 (3I-L 피규어)
    AMI-43 (녹색), AM4-65 (레드) 비 선택적 양이온 채널 (18)을 통해 세포를 입력 고칠 형광 염료이다. 살아있는 피부에이 염료를 선택적으로 흡수하고 메르켈 세포에 집중.
    1. C. ° -80 분량 씩 1 MG AM1-43 또는 AM4-65 2 ML PBS와 저장소를 녹여
    2. 29 G 바늘을 사용하여 g의 체중 당 2-10 μg 염료로 피하 갓 태어난 새끼를 주입한다.
    3. 어느 날 후, 마우스와들이 상자를 안락사등의 스킨을 CT.
    4. 밤새 4 ° C에서 4 % PFA / PBS에 스킨을 수정 PBS로 세척하고, 3.2 절에 설명 된대로 피부를 탑재합니다.

4. 이미징 및 이미지 분석

  1. 이미징 모낭 방향 (그림 4)
    1. , BBBA에 잠긴 유리 슬라이드 아래에 평평하게, 여전히 유리 접시에 이미지 등의, 발, 또는 꼬리 스킨을 해부 현미경을 사용 -이 방법은 현미경의 BBBA 오염을 최소화 할 수 있습니다.
    2. 아래에서 요리를 조명. 보기의 들판을 가로 질러 빛의 강도의 공간적 변화를 최소화 10cm 해부 현미경의 표준 작업 표면 위 ~ 높이로 유리 접시를 올리고 광원을 통해 확산 플라스틱이나 유리 기판을 배치합니다.
    3. -20 ° C에서 장기 저장을위한 100 % 에탄올로 피부를 반환
      참고 : 하루 이상 BBBA에 피부를 방치하면 멜라닌 과립이 중단됩니다부분. 피부가 BBBA이 처리 된 후에는 강화하고 이후 그 시점에서 고정 유지됩니다. 그들이 냉동실 공간을 절약하기 위해 함께 저장 될 수 있도록 다른 스킨 그들의 전방 및 / 또는 후방에 노치가 끝나는 일련의 코딩 될 수있다.
  2. 이미징 및 추적 축삭 아버 (그림 3A, B)
    1. 작은 단백질 젤에 사용되는 유형의 두 유리 기판 사이에 AP 얼룩진 피부 (3.1.3)을 놓습니다. 접시와 피부 사이에 공기 방울을 도입하지 않도록하고 조심스럽게 종이 타월로 초과 BBBA 멀리 심지. 현미경 단계 (그림 2D)에 판 피부 판의 샌드위치를 ​​놓습니다.
    2. 10X의 목적, 2 μm의 또는 5 μm의 Z-단계 밝은 필드 또는 DIC 조명을 사용합니다. 싱글 3 차원 그레이 스케일 데이터 세트를 생성하기 위해 함께 바느질하는 XY 이미지의 몽타주를 캡처하는 기계화 XY 스테이지를 사용합니다.
      참고 : 하나의 큰 축삭 아버의 경우,이 데이터 세트는 할 수있다5 기가 큰이야.
    3. 수동, 자동, 또는 소프트웨어 패키지의 다양한 어떤으로 축삭 아버의 반 자동화 된 추적을 수행합니다.
      참고 사항 : Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/)와 같은 소프트웨어는 PC 환경에서 실행되는 10 마스터 비교적 쉽게 무료로의 연결을 복원 도구입니다.

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Representative Results

피부 flatmounts의 시야 영상은 멜라닌 색소 침착 (그림 4)를 기반으로 이미지 피부 감각 구 심성 (그림 3A 10)과 모낭 패턴을 사용할 수 있습니다. 피부 flatmounts의 공 촛점 이미징은 안티 아세포-6 또는 안티 시각 오전 염료 흡수 (3I-L 피규어), (2) arrector의 필리 근육과 시각 (1) 메르켈 세포 클러스터의 구조를 정의하는 데 사용할 수 있습니다 평활근 액틴 (그림 3G, H), (3) 오일 레드 O (그림 3C-F)Krt17-GFP 유전자 또는 방지 Krt17 항체로 염색하여 시각화 (4) 모낭과 시각 피지선, 4 (그림 3E-G, K, L). 수동으로 어도비 포토샵이나 일러스트 레이터를 사용하여 구조에 알려진 방향 벡터를 배치 한 다음 quantifyin에 의해 이러한 이미지의 구조의 방향 및 공간 배치 점수 간단합니다G 결과 벡터 인구. 이 방법은 수백 벡터의 규모에 충분하지만, 그것은 10에 엄청나게 지루한 것 - 또는 큰 규모를 100 배.

그림 1
그림 1.의 주요 구조를 보여주는 포유 동물의 털이 피부의 개략도. (저작권, 편지는 테 레스 윈 슬로.)

그림 2
그림 2. 실 가드 판. D)에 고정 실 가드 플레이트에 고정 된 피부 절개 및 샘플 처리.) 해부 도구를 제공합니다. B) P5 지느러미 피부. C) P5 지느러미 뒷발 피부 영상 2 유리 겔 플레이트 사이에 장착 등의 피부 w10X의 목적, DIC 또는 시야 조명 i 번째.

그림 3
평면의 그림 3. 피부 구조는 전망을 탑재합니다. A, B) 하나의 피부 감각 정자 (왼쪽)와 Brn3a CKOAP / +의 P21 지느러미 피부에서의 추적 이미지 (오른쪽). NFL-CreER / + 마우스가 임신 일 17시 타목시펜 낮은 복용량에 노출이 프로토콜은 결과 지느러미 루트 신경절 신경 세포의 아주 작은 부분에있는 기자, 따라서 피부 감각 아버의 작은 부분이 인간의 태반 알칼리 포스파타제 (AP) 기자로 표시되어의 크레 매개 재조합. 레이블 축삭은 NBT / BCIP 조직 화학으로 시각화된다. Brn3a이 동등에서 피지 분비를 시각화하는 오일 레드 O로 염색 테일 피부 Pou4f1. C, D)이라고합니다WT (왼쪽)과 FZ6는 - / - P21에서 (오른쪽) 마우스. FZ6는 - / - 구조는 조직을 파괴합니다. P, 근위; . WT (왼쪽)과 FZ6에서 D, 말초 E, F) 지느러미 발 피부 - / - Krt17-GFP를 들고 (오른쪽) 마우스. 피부는 P21에서 수확 오일 레드 O. FZ6로 염색 한 - / - 피부의 중심에 가마가 있습니다. P, 근위; [안티 평활근 액틴 (SMA와 시각 패널 G)와 arrector의 필리 근육;. P21 보여주는 Krt17-GFP 유전자 및 항-GFP의 면역 염색으로 가시화 모낭 (에 WT 마우스에서 D, 말초 G, H) 지느러미 피부 ) 면역 염색; 패널 H]. 공 촛점 Z-스택 이미지 내 깊이 색상 코드입니다. A, 전방; P, 후방. IL cytokeratin8 면역 염색 또는 AM11-43 염료의 이해와 시각) 메르켈 세포 클러스터 ()와 Krt17-G와 패널 K와 L의 시각화에 위치한 모낭 (FP). 이미지가 표시 유전자형에서 P1의 등쪽 피부에서 얻었다. FZ6 - / - WT 머켈 세포 클러스터가 전방을 향해 개방되어있는 반면 메르켈 세포 클러스터는, 닫힌 원을 형성한다. A, 전방; P, 후방. 스케일 바 : A와 B, 300 μm의; C와 D, 500 μm의; E와 F, 500 μm의; G와 H, 200 ㎛; IL, 50 ㎛. (패널 A와 B가 eLife추계에서 재생된다. NATL. 아카드. 과학. 미국, 허가 4,10으로) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 머리와 P1과 P7의 등쪽 피부에 모낭 멜라닌 색소와 시각. WT와 FZ6에서 A, B) P1 피부 / - - 마우스 M> - / -. FZ6에서 마우스 C, D) P7 피부. 스케일 바 : A와 B, 500 μm의; C와 D, 1mm.

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Discussion

상기 절개 방법의 숙달은 인내, 침착 함, 그리고 몇 가지 좋은 해부 도구가 필요합니다. 등의 피부 절개는 상대적으로 쉽지만, 꼬리와 발 피부 해부 - 특히 출생 초기 연령에서 - 더 도전합니다. (E15 전에 예) 초기 태아 나이에, 피부가 찢어지지 않도록 제거하기가 어렵습니다. 편리하게, 성장과 생쥐의 피부 구조의 패턴의 많은 연구에 대한 관심의 이벤트 arrector의 필리 근육 (19)의 성장 연구에서, 예를 들어 볼 때, 출생 후 발생합니다.

피부가 상대적으로 굴절 반사 조직이므로 깊이 평면 실장 구성의 피부에 이미징 도전이다. 피부 인해 분화와 그 구성 층의 두께를 증가에 성숙이 문제는 더 큰됩니다. 이 문제에 대한 하나의 부분적인 해결책은 진피와 표피를 분리 epiderm을 분석하는 것입니다별도의 구조 ( "표피 전체 마운트") 등이다. 이 방법은 특히 마우스의 꼬리 피부, 모낭 및 관련 구조를 시각화하는 데 유용합니다. 그러나, 마우스의 등쪽 피부로부터 고품질 표피 전체 탈것을 얻는 것은 아마도 인해 깊은 진피 내로 연장 모낭 (1) 고밀도 interfollicular 표피 (13)의 (2) 얇음으로 어렵다.

우리의 경험에서, BBBA 치료는 표피와 진피 층을 분리 할 필요없이 면역 신호를 보존하면서 광학적으로 투명한 피부를 표현하기위한 매우 효과적인 방법입니다. 벤질 벤조 에이트는 수십 년 (20)에 대한 조직을 취소하는 데 사용되어 널리 개구리와 물고기 배아를 취소하는 데 사용됩니다. 그러나 BBBA 그것이 GFP 등의 형광 단백질을 변성시키는 단점이 있고, 이는 오일 레드 O를 용해하고,이 장비 (예를 들어, 현미경)을 오염시킬 수있다. 그것은 가출이 될 것입니다체계적으로 같은 SeeDB 21 ClearT 22 스케일 23, 3DISCO (24), 및 형광 단백질과 호환되는 일부 CLARITY (25)와 같은 다른 정화 방법과 피부의 BBBA 치료를 비교하는 t. BBBA가 샘플을 해부 현미경을 사용하여 묘화 될 종래의 광 / 형광 현미경 또는 공 초점 현미경 아르 처리하면 샘플 BBBA 오염을 최소화하기 위해 유리 접시에 또는 두 개의 대형 유리판 사이에 배치되어야한다.

이 조사에서 생물학적 질문에 대한 특이 체질이기 때문에 우리는 모든 세부 사항에서 데이터 분석을 설명하지 않았습니다. 서두에서 언급 그러나, 이러한 구조는 평면 탈것에 묘화 될 수있는 그러한 모낭, 메르켈 세포 클러스터, 및 신경 말단 및 완성도만큼 거의 동일한 구조의 존재는 구조 또는 형태 학적 파라미터를 측정 할 수있는 기회를 제공한다 통계적으로 엄격한 매사추세츠에있는nner, 피부 감각 축삭의 형태학 (10)의 모낭과 야생형과 돌연변이 생쥐 FZ6 4.8에 난포 관련된 구조의 최근 연구에서, 예를 들어 볼 때. 더 정교한 이미지 분석 도구의 개발과 함께, 그것은 현재함으로써 피부의 넓은 사용을 용이하게 수동으로 수행되는 분석의 일부를 자동화 또는 반 자동화하는 것이 가능할 수있다 평 기본 원리를 조사하는 방법으로 촬상 마운트 다세포 조직.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) Roche 11383221001
AM1-43 Biotium 70024
AM4-65 Biotium 70039
Benzyl alcohol Sigma 402834
Benzyl benzoate Sigma  B-6630
Confocal microscope Zeiss LSM700
Cy3-alpha smooth muscle actin antibody Sigma  C6198 1:400
Cytokeratin-8  Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-c 1:500
Dissecting microscope
Dissection tools  Fine Science Tools scissors and forceps
Electric razor
Fluoromount G EM Sciences 17984-25
Formalin Sigma HT501320
Glass dishes Pyrex  6 cm and 10 cm diameter
Glass plates Amersham Biosciences SE202P-10 10 cm x 8 cm x 1 mm
Hair remover  Nair
Horizontal rotating platform  Hoefer PR250 Orbital shaker
Insect pins Fine Science Tools  26002-20
Ketamine/xylazine Sigma K113
Nitroblue tetrazolium (NBT) Roche  11383213001
Oil Red O Sigma O0625
Paraformaldehyde Sigma  P6148
Razor Blades VWR 55411-055
Secondary antibodies  Invitrogen Alexa-dye conjugated 
Sylgard-184 Fisher Scientific NC9020938
Tissue culture plastic dishes 10 cm diameter
Tissue culture plates 6- and 12-well 

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References

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  22. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
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