Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia

Neuroscience

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Summary

Pelle dei mammiferi contiene una gamma diversificata di strutture - come i follicoli piliferi e le terminazioni nervose - che presentano modelli distintivi di organizzazione spaziale. Analizzando pelle come cavalcatura piatto approfitta della geometria 2-dimensionale di questo tessuto per produrre tutto spessore immagini ad alta risoluzione delle strutture cutanee.

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Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology. J. Vis. Exp. (88), e51749, doi:10.3791/51749 (2014).

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Abstract

La pelle è un tessuto altamente eterogeneo. Strutture intra-dermiche includono follicoli piliferi, i muscoli erettore del pelo, specializzazioni epidermiche (come gruppi di cellule di Merkel), ghiandole sebacee, nervi e terminazioni nervose e capillari. La disposizione spaziale di queste strutture è strettamente controllata su scala microscopica - come si è visto, ad esempio, nella disposizione ordinata di tipi cellulari all'interno di un singolo follicolo pilifero - e su scala macroscopica - come visto dagli orientamenti quasi identiche di migliaia di capelli follicoli in una regione locale di pelle. Visualizzazione queste strutture senza sezionare fisicamente la pelle è possibile a causa della geometria 2-dimensionale di questo organo. In questo protocollo, dimostriamo che la pelle del mouse può essere sezionato, fisso, permeabilizzate, macchiato, e ha chiarito come un oggetto a due dimensioni intatte, un monte piatto. Il protocollo consente una facile visualizzazione delle strutture cutanee nella loro interezza attraverso l'intero spessore di grandi aree di pelle optsezionamento iCal e ricostruzione. Immagini di queste strutture possono essere integrate con le informazioni sulla posizione e l'orientamento rispetto agli assi del corpo.

Introduction

La pelle è uno dei più grandi organi del corpo, con importanti funzioni somato-sensazione, isolamento / termoregolazione e difesa immunitaria 1. Comprensione delle basi molecolari e cellulari della pelle sviluppo e la funzione è stata di interesse di lunga data per l'importanza fondamentale della pelle come un sistema biologico e la sua rilevanza per dermatologia. Pelle dei mammiferi contiene una varietà di strutture multicellulari, tra cui stratificazioni di cheratinociti, il tessuto connettivo dermico, diversi tipi di follicoli piliferi, le ghiandole sebacee, muscoli erettore del pelo, vasi sanguigni, e almeno una dozzina di classi distinte di afferenti (sensoriali) ed efferenti del nervo fibre (Figura 1). Diverse regioni del corpo sono associate caratteristicamente diversi tipi di pelle. Nella maggior parte dei mammiferi, quasi tutta la superficie corporea è coperto con la pelle che è densamente compresso con follicoli piliferi. [Gli esseri umani e talpe nude costituiscono deroghe al secoloè modello.] Capelli manca dalle superfici palmari delle mani e dei piedi, che sono anche associati con modelli specializzati epidermiche (dermatoglifi), ghiandole esocrine, e le terminazioni nervose sensoriali. Gli eventi cellulari e molecolari che controllano la crescita, la differenziazione e la disposizione spaziale delle cellule all'interno del follicolo pilifero sono di particolare interesse in quanto ogni follicolo mostre, in miniatura, molte delle caratteristiche centrali della organogenesi 2. Queste funzionalità includono l'esistenza delle cellule staminali e una nicchia di cellule staminali, le migrazioni cellulari coreografati con precisione, e il montaggio di strutture multicellulari dai componenti embriologicamente distinte.

Questo articolo descrive i metodi per la dissezione, il fissaggio, l'etichettatura, e la pelle del mouse di imaging come un foglio bidimensionale intatta, indicato come un "tutto il monte" o "flat mount" di preparazione. Poiché la pelle mouse è relativamente sottile, è possibile immagine attraverso l'intero spessore di sci appiattitan usando la microscopia confocale convenzionale. L'approccio piatta monte all'imaging pelle del mammifero è tecnicamente vantaggioso perché evita il bisogno di sezionamento fisico, consentendo in tal modo strutture da ricostruire interamente sezionamento ottico. Poiché quasi tutta la pelle viene elaborato come un singolo oggetto, il piatto di montaggio approccio facilita anche l'imaging di più regioni della superficie del corpo, preservando informazioni sulla posizione e l'orientamento rispetto agli assi del corpo. Infine, le strutture all'interno della pelle sono tipicamente presenti nei modelli che si ripetono a intervalli regolari, facilitando così la raccolta di immagini da più rappresentanti di una data struttura. Queste caratteristiche sono familiari a neurobiologi che lavorano sulla retina, una parte bidimensionale del sistema nervoso centrale che gode di vantaggi analoghi per studi di morfologia neuronale 3.

L'approccio montare piatto qui descritto è di utilit specialey per lo studio delle strutture che presentano organizzazione spaziale su scala relativamente grande sul piano bidimensionale della pelle. Un esempio di grande organizzazione spaziale è la polarità coordinata dei follicoli piliferi e delle strutture follicolo-associato capelli - gruppi di cellule di Merkel, muscoli muscolo piloerettore, ghiandole sebacee, e le terminazioni nervose 4. Follicoli piliferi sono orientate ad un angolo rispetto al piano della pelle, e la componente del vettore follicolo che sia situato sul piano 2-dimensionale della pelle generalmente esibisce un orientamento rispetto agli assi del corpo che è preciso per ciascun posizione sul corpo. Ad esempio, i follicoli dei capelli sul punto di ritorno da rostrale a caudale e capelli sulla superficie dorsale dei piedi puntano da prossimale a distale. Capelli orientamento follicolo è controllato da segnali di polarità planare delle cellule (PCP, chiamato anche la polarità del tessuto 5). Questo sistema di segnalazione è stato scoperto in Drosophila dove un piccoloinsieme di geni essenziali PCP è stata trovata per controllare l'orientamento di peli e cuticolare setole. Tre orthologues mammiferi di geni fondamentali PCP - omologhi frizzled 6 (Fzd6, noto anche come FZ6), caderina EGF LAG sette-pass G-recettore tipo 1 (Celsr1), e vang-like 2 (Vangl2) - svolgono ruoli analoghi in mammiferi pelle, coordinando gli orientamenti dei follicoli dei capelli con gli assi del corpo. Studi di FZ6 topi knockout (Fzd6 tm1Nat, di seguito denominato FZ6 - / -) mostrano che il difetto primario in assenza di segnalazione PCP è una randomizzazione iniziale o disorganizzazione dell'orientamento follicolo pilifero, senza alcun effetto sulla struttura intrinseca dei follicoli 6-8. Un secondo sistema non-PCP agisce successivamente per favorire l'allineamento locale di follicoli vicini, che porta alla produzione di grandi schemi per capelli come spirali e ciuffi.

Un secondo esempio di grande scalaorganizzazione spaziale all'interno della pelle è visto nelle morfologie di pergole assoni sensoriali. Neuroni sensoriali che innervano la pelle hanno i loro corpi cellulari nella radice dorsale e gangli del trigemino. Questi neuroni rilevano temperatura, dolore, prurito, e vari tipi di deformazioni meccaniche che influiscono sulla pelle e capelli 9. Essi possono essere suddivisi in sottotipi in base diametro dell'assone e velocità di conduzione, struttura terminale del nervo finale, e gli schemi di espressione dei recettori, canali e altre molecole. A causa della elevata densità di innervazione all'interno della pelle, analisi che coinvolgono visualizzare tutti assoni (ad esempio, immunocolorazione anti-neurofilamenti) o anche tutti assoni di una singola classe (come visto quando un singolo tipo di cellula è marcata mediante espressione di un reporter fluorescente) generalmente rivela una fitta sovrapposizione di assoni che rende impossibile definire la morfologia di un individuo Arbor. Per aggirare questo problema, abbiamo utilizzato molto radi geneticamente diretto lAbeling per produrre campioni di pelle dorsali in cui i singoli pergole assone ben isolate sono visualizzabili da espressione di un giornalista istochimica, fosfatasi alcalina placentare umano 10. Questo approccio permette la visualizzazione inequivocabile delle singole morfologie assone pergolato e una definizione dei tipi di neuroni somatosensoriali sulla base di criteri morfologici.

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Protocol

Questo studio è stato eseguito in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Tutti gli animali sono stati trattati secondo approvata la cura degli animali istituzionale e l'uso comitato (IACUC) protocollo MO11M29 delle istituzioni mediche del Johns Hopkins. Consultare le linee guida Istituzionale cura degli animali e uso comitato per i metodi approvati di eutanasia locali. Indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza quando si maneggiano fissativi aldeide o solventi organici.

1. Preparazione dei Materiali

  1. Versare Piatti SYLGARD
    1. Seguire le istruzioni del produttore, mescolare il catalizzatore con la base, e mescolare con una bacchetta di plastica.
    2. Deporre circa 35 ml di liquido Sylgard per 10 cm di diametro tessuto piatto di coltura. Tissue Culture piatti sono più profondo i piatti batterici standard; ciò fornisce spazio verticale per i perni di insetti.
    3. Posizionare il dishes su una superficie orizzontale a temperatura ambiente per una notte. Bolle formatesi durante la miscelazione spariranno.
    4. Seguendo polimerizzazione, memorizzare le piastre Sylgard a temperatura ambiente.
      NOTA: le piastre SYLGARD possono essere conservati a temperatura ambiente per anni e riutilizzati più volte fino a quando il Sylgard stacca dalla piastra.
  2. Soluzioni
    1. Benzil benzoato e alcool benzilico (BBBA). Mescolare 2 volumi benzile benzoato e 1 volume di alcool benzilico. Conservare al buio in una bottiglia di vetro con un tappo di vetro o teflon top.
      ATTENZIONE: Occasione BBBA deve essere opportunamente gestito come rifiuto solvente organico. Non permettere BBBA per contattare plastica.
    2. Soluzione tampone fosfato (PBS). Aggiungere 4 g PFA a 80 ml di acqua, aggiungere 0,1 ml 1 N NaOH, mescolate su un piatto caldo a ~ 70 ° C per ~ 5 minuti fino a quando il PFA è completamente sciolto, quindi aggiungere 10 ml 10x PBS e portare il volume a 100 ml con acqua.
      ATTENZIONE: L'inalazione di formaldeide / PFA e BBBA vapori dovrebbe essereminimizzato mantenendo queste soluzioni in contenitori coperti. Formaldeide / PFA è una sostanza cancerogena.
    3. Oil Red O. Preparare uno stock di 0,5% in isopropanolo. Immediatamente prima dell'uso diluire con acqua ad una concentrazione finale di 0,3% Oil Red O, quindi filtrare attraverso un filtro da 0,2 micron.

2. Dissezione pelle, Fissazione, e Clearing

  1. Dorsale pelle per Immunostaining e Melanina Imaging
    1. Per i più giovani topi (ad esempio, feti e giorno postnatale (PUP P) 0-P3), eutanasia il mouse per inalazione isoflurano. Euthanize topi più anziani per inalazione isoflurano o per iniezione ketamina / xylazina seguita da dislocazione cervicale.
    2. Rimuovere i capelli con un rasoio elettrico e gel per capelli rimozione. Per i topi di età inferiore P8, questo passaggio può essere saltato.
    3. Utilizzare una lama di rasoio per fare un taglio orizzontale dalla base della coda lungo ogni fianco, passando sul lato dorsale della base di ciascun arto, procedendo laterale alle orecchie e finezione al naso.
    4. Buccia delicatamente la pelle dal procedimento tessuto sottostante da posteriore ad anteriore mantenendo la pelle tra le dita guantate in modo che non venga pizzicato dalla pinza. Staccando la pelle a livello delle orecchie, tagliare le orecchie con un paio di forbici e procedere lentamente soprattutto come la pelle può strappare in questa posizione.
    5. Da questo punto in poi, orientare la pelle con la parte interna rivolta verso l'alto. Appunta la pelle per Sylgard con ~ 20 vie di insetti distribuiti uniformemente attorno alla periferia; non più di-tendere la pelle (Figura 2B). Coprire la pelle con 10-20 ml di PBS.
    6. Sezionare il grasso della pelle e del tessuto connettivo associato con pinze inclinate o curve con l'estremità appuntita della pinza fronte orizzontalmente per minimizzare il rischio che la pinza penetrino nella pelle. Estrudere eventuali bolle d'aria intrappolate sotto la pelle da dolci un applicatore con punta di cotone sulla superficie cutanea.
      NOTA: Se la pelle sta andandoda utilizzare per appartamento immunoistochimica montaggio o istochimica, rimuovere la maggior quantità di tessuto connettivo possibile; se la pelle sta per essere utilizzato per visualizzare follicoli piliferi basato su melanina pigmentazione, rimozione meno completa del tessuto connettivo è soddisfacente. Pelle prenatale richiede una minima "pulizia" del tessuto connettivo aderente.
    7. Fissare la pelle appuntato con l'aggiunta di 20 ml di preparati al momento 4% PFA / PBS o il 10% formalina tamponata per 10 cm piatto Sylgard (se verrà utilizzata la pelle di melanina imaging o della fosfatasi alcalina (AP) istochimica) o 20 ml di appena preparato 2% PFA / PBS (se verrà utilizzata la pelle di immunoistochimica o visualizzare transgenico cheratina (KRT) 17-GFP 11), e ruotare delicatamente durante la notte in una stanza fredda. Il giorno dopo, lavare in PBS per> 10 min.
      NOTA: formalina standard è 37% di formaldeide; Pertanto, "il 10% di formalina" è del 3,7% di formaldeide.
    8. Per AP colorazione e immunostaining, continuare al punto 3. Per melanina imaging, disidrata la pelle attraverso una serie graduata di etanolo (70%, 95%, 100%), un giorno per ogni passo, con lieve rotazione orizzontale a temperatura ambiente. Rimuovere tessuti connettivi residue.
    9. Con la pelle in 100% di etanolo, rimuovere i perni di insetti e, se desiderato, tagliare la pelle con forbici per rimuovere il più periferica 1-2 mm di pelle con i fori dei perni.
    10. Trasferire la pelle per un piatto di vetro 10 cm di diametro, posizionate due vetrini da microscopio di vetro sulla pelle per evitare che il curling, e aggiungere 20 ml di BBBA. BBBA indurisce rapidamente tessuto quindi è importante per la pelle per essere appiattito sotto il peso dei vetrini prima di aggiungere il BBBA.
    11. Nel corso dei prossimi parecchie ore, sollevare le diapositive fuori la pelle per un paio di secondi per consentire alla BBBA per lavare la pelle.
      NOTA: Indossare guanti quando si lavora con BBBA. A seconda dell'età e della pelle ci può essere fino al 30% di ritiro in BBBA.
  2. La pelle del piede per l'Analisi del follicolo pilifero Patterning
    NOTA: La gamma di età tipicamente esaminati è P1-P8.
    1. Dopo l'eutanasia, tagliare i piedi sopra la caviglia e fare un unico taglio dritto lungo la superficie ventrale attraverso le piante dei piedi.
    2. Staccare delicatamente la pelle dal tessuto sottostante, procedendo in una direzione prossimale a distale.
    3. Tagliare le cifre per rilasciare la pelle e il pin per Sylgard con la superficie interna rivolta verso l'alto (Figura 2C). C'è tessuto connettivo minimo sulla pelle del piede.
    4. Pelle transgenica Krt17-GFP è ora pronto per l'imaging. Per l'imaging melanina procedere con la fissazione, disidratazione e BBBA compensazione come descritto nella sezione 2.1.
  3. La pelle del piede per la visualizzazione ghiandole sebacee
    1. Dopo l'eutanasia, rimuovere i capelli sfregando gel per capelli di rimozione sulla superficie cutanea con un dito guantato e il pollice; attendere per 10 min.
      NOTA: non utilizzare un rasoio elettrico, che danneggia la pelle delicata del piede.
    2. Wcenere la superficie della pelle con acqua di rubinetto, sezionare e il pin la pelle a Sylgard come descritto nella sezione 2.2.
    3. Fissare con 1% PFA / PBS per 30 minuti a temperatura ambiente e poi lavare in PBS.
      NOTA: Per visualizzare ghiandole sebacee sui piedi, che si sviluppano dopo la prima settimana post-natale, l'età ottimale per l'analisi con Oil Red O è P21, perché questo segna il nadir della pigmentazione dei capelli durante il primo ciclo del capello 12, e quindi le ghiandole sebacee si può vedere più facilmente. Con i topi albino questa analisi può essere eseguita a qualsiasi età. Per ottenere albino progenie croce pigmentato topi mutanti per una linea mutante tirosinasi come C57BL/6J-Tyr c-2J.
  4. Preparazione Tail pelle per l'analisi di melanina Distribution, Capelli follicolo Orientamento e ghiandola sebacea visualizzazione
    1. Dopo eutanasia, fare un taglio circolare intorno alla base della coda, e poi una fessura longitudinale che corre la lunghezza della coda lungo la faccia ventrale.
    2. <li> Togliere la pelle coda partendo dalla punta impugnando saldamente la punta della coda-osso e / o tessuto connettivo con una coppia di pinze e la pelle con una seconda coppia di pinze. Pin la pelle coda Sylgard.
    3. Per l'analisi della distribuzione della melanina e capelli orientamento del follicolo, correggere ed elaborare la pelle come descritto nella sezione 2.1. Per l'analisi delle ghiandole sebacee, tagliare la pelle coda in una serie di segmenti ~ 0,5 a 1 cm di lunghezza prima del fissaggio e incubare i pezzi di pelle in PBS / EDTA 5 mM notte a 37 ° C per indebolire il derma-epidermide adesione 13.
    4. Staccare delicatamente l'epidermide dal derma, appuntare l'epidermide a Sylgard (faccia interna verso l'alto), e fissare nel 4% PFA / PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare con PBS, e macchiare con Oil Red O come descritto di seguito.
      NOTA: Un rasoio elettrico e / o capelli gel rimozione possono essere utilizzate prima di sezionare pelle coda anziani (es. P21), ma questo trattamento è facoltativo poiché i capelli sulla coda non èdenso come altre parti del corpo.

3. Reazioni colorazione

  1. Umano placentare fosfatasi alcalina (AP) Istochimica per visualizzare geneticamente etichettati Axon conici 10,14,15 (Figure 3A, B)
    1. Dopo PFA fissazione sulla Sylgard, collocare pelli fissati in un piatto di vetro da 10 cm ed immergere in PBS / 1 mM MgCl 2. Ruotare delicatamente il piatto in un bagno d'acqua a 70 ° C per 90 minuti per distruggere l'attività della fosfatasi endogena.
    2. Visualizza dell'attività giornalista AP istochimica con un hr incubazione 4-48 a temperatura ambiente in 0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl 2, 0,34 mg / ml NBT, e 0,175 mcg / ml BCIP, tipicamente usando 10-15 ml di soluzione colorante per la pelle dorsale P21. Monitorare la reazione sotto il microscopio da dissezione, facendo attenzione a non lasciarlo procedere al di là del tempo ottimale, come giudicato mediante ispezione visiva delle assone colorazione intensità rispetto al aspecifica NBT deposizione. Arrestare la reazione mediante lavaggio con tre cambi di PBS/0.1% Tween-20 nel corso di 1 ora, ri-pin bucce al Sylgard, disidratare le bucce attraverso una serie di etanolo, e poi trasferire le bucce per un piatto di 10 centimetri con BBBA.
      NOTA: BBBA dissolve lentamente il precipitato NBT. Durante le prime ore di BBBA, uno sfondo multa di precipitato NBT si dissolverà; come risultato, la soluzione BBBA si scurisce, e la pelle alleggerirà. Passare alla BBBA fresca dopo poche ore.
    3. Dopo l'imaging della pelle AP-tinto, trasferirlo in etanolo per> 1 ora a temperatura ambiente e poi riporla in etanolo fresco a -20 ° C. Pelli AP-colorati possono essere memorizzati in questo modo per molti mesi senza perdita di segnale.
  2. Oil Red O di colorazione per visualizzare ghiandole sebacee 4 (Figure 3C-F)
    1. Rimuovere spilli insetti e trasferire il piede fisso leggera o pelli coda dalla piastra Sylgard ai pozzetti di una piastra di coltura tissutale da 6 pozzetti, confino a due campioni di pelle per pozzetto. Lavare con 60:40 isopropanolo: acqua per 5 minuti a temperatura ambiente.
    2. Colorare con 2 ml di 0,3% Oil Red O in 60:40 isopropanolo: acqua (vedere paragrafo 1.2) a temperatura ambiente per 2 ore.
    3. Lavare con 60:40 isopropanolo: acqua per 5 minuti a temperatura ambiente, seguito da un lavaggio con acqua. Con attenzione via i bordi della pelle, compresi i fori, con forbici sottili in modo che la superficie della pelle può essere fatta più piatta possibile.
    4. Mettere la pelle su un vetrino con la superficie esterna rivolta verso l'alto, aggiungere alcune gocce di acqua o mezzo di montaggio acquoso, coprire la pelle con un vetrino, e poi il nastro delicatamente il coprioggetto al vetrino per appiattire ulteriormente la pelle.
  3. Appartamento Monte Immunostaining 4,16,17 (Figure 3G, H)
    1. Tagliate un rettangolo di pelle PFA fisso (ad esempio uno centimetri x 0,5 cm), segnando il suo orientamento con un taglio asimmetrico (ad esempio ritagliare l'angolo anteriore destro). Eseguire l'incubazione elavare con passaggi lieve rotazione su una piattaforma rotante orizzontale. Nei pozzetti di un 6 - o 12-pozzetti di coltura tissutale, lavata diverse volte con PBS per rimuovere residui PFA, lavare con ~ 10 cambi di PBS con 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST) oltre 5-8 ore a temperatura ambiente per permeabilize la pelle.
    2. Incubare con l'anticorpo primario a 0,3% PBST con siero di capra al 5% e 20% DMSO per cinque giorni a temperatura ambiente. Coprire i pozzetti della piastra con nastro adesivo trasparente o di plastica adesivo per eliminare le perdite per evaporazione.
    3. Lavare con 10-15 cambiamenti di 0,3% PBST oltre 5-8 ore e incubare con l'anticorpo secondario in 0,3% PBST con siero di capra al 5% e 20% DMSO per 3 giorni a temperatura ambiente.
    4. Lavare con 10-15 cambiamenti del 0,3% PBST oltre 5-8 ore.
    5. Disidratare in 25%, 50%, e 75% di metanolo per 5 minuti ciascuna e quindi 3x in 100% di metanolo per 20 minuti ciascuno.
    6. Pioggia in BBBA notte a temperatura ambiente.
      NOTA: Appartamento montare immunoistochimica della pelle più giovane~ P1 può essere eseguita come descritto sopra ma con incubazione più breve e tempi di lavaggio. Ad esempio, la pelle P1 può essere immunostained considerando un notte di incubazione in anticorpo primario e vari ore di incubazione in anticorpo secondario, e con intervenendo lavaggi di solo 2-3 ore in 0,3% PBST. Come notato sopra, le pelli più giovani sono anche sufficientemente sottili da poter essere ripreso senza BBBA compensazione.
  4. Visualizzazione Merkel gruppi di cellule con Nerve fluorescente Terminal Dye assorbimento (Figure 3I-L)
    AMI-43 (verde) e AM4-65 (rosso) sono fissabili coloranti fluorescenti che entrano cellule via non selettivo canale cationico 18. Nella pelle vivente questi coloranti vengono selettivamente assorbiti e concentrati in cellule di Merkel.
    1. Sciogliere 1 mg AM1-43 o AM4-65 in 2 ml di PBS e conservare in aliquote a -80 ° C.
    2. Iniettare cuccioli appena nati per via sottocutanea con 2-10 mg colorante per grammo di peso corporeo con un ago G 29.
    3. Un giorno dopo, eutanasia topi e diffuCT Il pelli dorsali.
    4. Fissare le pelli in 4% PFA / PBS a 4 ° C per una notte, lavare con PBS, e montare la pelle come descritto nella sezione 3.2.

4. Imaging and Image Analysis

  1. Imaging follicolo pilifero Orientamento (Figura 4)
    1. Utilizzare un microscopio da dissezione di dorsale immagine, a piedi, o pelli di coda che sono immersi in BBBA, schiacciata sotto un vetrino, e ancora nel piatto di vetro - questo approccio minimizza la contaminazione BBBA del microscopio.
    2. Illuminare il piatto da sotto. Per minimizzare la variazione spaziale dell'intensità della luce attraverso il campo di vista, elevare il piatto di vetro ad una altezza circa 10 cm sopra il piano di lavoro standard del microscopio da dissezione e posizionare un diffusore di plastica o lastra di vetro sopra la sorgente di luce.
    3. Ritorno alla pelle di 100% etanolo per la conservazione a lungo termine a -20 ° C.
      NOTA: Lasciando la pelle in BBBA per più di un giorno fa sì che i granuli di melanina per rompere unparte. Una volta che la pelle è stata trattata BBBA si indurisce e rimane piatta da quel punto in avanti. Pelli differenti possono essere codificati con una serie di tacche al loro anteriore e / o posteriore termina, in modo che possano essere conservare insieme, per risparmiare spazio nel congelatore.
  2. Imaging and Tracing Axon conici (Figure 3A, B)
    1. Posizionare AP macchiato pelle (sezione 3.1.3) tra due lastre di vetro del tipo usato per i piccoli gel proteici. Evitare l'introduzione di bolle d'aria tra le piastre e la pelle, e quindi favorire la attentamente tutta BBBA eccesso con un tovagliolo di carta. Posizionare il panino della piastra-pelle-piatto su un palco microscopio (Figura 2D).
    2. Utilizzare in campo chiaro o illuminazione DIC con un obiettivo 10X e 2 micron o 5 micron Z-passi. Utilizzare una fase XY meccanizzato per catturare un montaggio di immagini XY che vengono cuciti insieme per creare un unico set di dati tridimensionali in scala di grigi.
      NOTA: Per un unico grande pergolato assone, questo set di dati può essere uns grande come 5 Gb.
    3. Eseguire manuale, automatico, o tracciato semi-automatizzata delle pergole assoni con qualsiasi di una varietà di pacchetti software.
      NOTA: Software come neuromantico (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) è uno strumento di ricostruzione neuronale gratuito che viene eseguito in un ambiente PC ed è relativamente facile da padroneggiare 10.

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Representative Results

Brightfield imaging flatmounts pelle può essere utilizzato per immagine afferenze cutanee sensoriali (Figura 3A 10) e modelli follicolo basato su melanina pigmentazione (Figura 4). Confocale di flatmounts pelle può essere utilizzato per definire la geometria di (1) gruppi di cellule Merkel, visualizzati con anti-citocheratina-6 o con AM colorante assorbimento (figure 3I-L), (2) i muscoli erettore del pelo, visualizzati con anti- actina muscolo liscio (Figure 3G, H), (3) ghiandole sebacee, visualizzati con Oil Red O (Figure 3C-F), e (4) follicoli piliferi, visualizzati con un transgene Krt17-GFP o mediante colorazione con anticorpi anti-Krt17 4 (figure 3E-G, K, L). E 'semplice da segnare manualmente gli orientamenti e disposizioni spaziali di strutture in tali immagini inserendo vettori di orientamento nota sulle strutture utilizzando Adobe Photoshop o Illustrator, e quindi quantifying popolazioni vettore risultante. Mentre questo approccio è sufficiente per una scala di diverse centinaia di vettori, sarebbe proibitivo noioso su un 10 - o 100 volte più grande scala.

Figura 1
Figura 1. Schema di pelle peloso mammifero che mostra le principali strutture. (Copyright, Terese Winslow.)

Figura 2
Figura 2. Dissezione della pelle e manipolazione del campione. A) strumenti di dissezione. B) pelle dorsale A P5 appuntato ad un piatto Sylgard. C) A P5 dorsale pelle del piede posteriore appuntato ad un piatto Sylgard. D) Una pelle dorsale montato tra due piastre di gel di vetro per l'imaging wesima un obiettivo 10X e DIC o illuminazione campo chiaro.

Figura 3
Strutture Figura 3. Della pelle in appartamento montaggio viste. A, B) Un singolo arbor cutanea sensoriale (a sinistra) e la sua immagine tracciato (a destra) da una pelle P21 dorsale di un Brn3a CKOAP / +;. NFL-créer / + topo esposto ad una bassa dose di tamoxifene al giorno di gestazione 17 risultati di questo protocollo in ricombinazione Cre-mediata del reporter in una frazione molto piccola di neuroni dorsali radice gangliari, e quindi una piccola frazione di mandrini sensoriali cutanei sono etichettati con il placentare fosfatasi alcalina (AP) giornalista umano. Gli assoni etichettati vengono visualizzate con NBT / BCIP istochimica. Brn3a è equivalente indicato come Pou4f1. C, D) la pelle di coda colorate con Oil Red O di visualizzare ghiandole sebacee daWT (a sinistra) e FZ6 - / - (a destra) topi a P21. La FZ6 - / - strutture sono disorganizzati. P, prossimale; . D, distale E, F) Dorsale pelle del piede da WT (a sinistra) e FZ6 - / - (a destra) topi portatori Krt17-GFP. La pelle è stato raccolto in P21 e colorate con Oil Red O. FZ6 - / - pelle ha un ciuffo di capelli nel suo centro. P, prossimale; . D, distale G, H) Dorsale pelle di un topo WT a follicoli piliferi (P21 mostrando visualizzati con un transgene Krt17-GFP e anti-GFP immunoistochimica; pannello G) e muscoli erettore del pelo [visualizzati con l'actina anti-muscolo liscio (SMA ) immunostaining; pannello H]. Profondità all'interno dell'immagine Z-stack confocale è un codice colore. A, anteriori; P, posteriore. IL) cluster di cellulare Una Merkel (visualizzato con cytokeratin8 immunocolorazione o AM11-43 dye assorbimento) e il suo follicolo pilifero centrale (visualizzato in pannelli di K e L con Krt17-GFP). Le immagini sono state ottenute da pelle dorsale P1 dai genotipi indicati. La FZ6 - / - cluster di cellule di Merkel forma un circolo chiuso, mentre il gruppo di cellule WT Merkel è aperta verso l'anteriore. A, anteriori; P, posteriore. Bar Scala: A e B, di 300 micron; C e D, 500 micron; E e F, 500 micron; G e H, 200 micron; IL 50 micron. (Pannelli A e B sono riprodotti da eLife e Proc.. Natl. Acad. Sci.. Stati Uniti d'America, con il permesso 4,10) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Capelli e follicoli piliferi in pelle dorsale a P1 e P7 visualizzati con pigmentazione della melanina. A, B) la pelle P1 da WT e FZ6 - / -. topi C, D) pelle P7 da FZ6 - / - mice. Bar Scala: A e B, 500 micron; C e D, 1 mm.

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Discussion

Padronanza dei metodi di dissezione sopra descritti richiede solo pazienza, una mano ferma e un paio di buoni strumenti di dissezione. La pelle dissezione dorsale è relativamente facile, ma la coda e la pelle del piede dissezioni - soprattutto in età precoce postnatale - sono più impegnativo. In età precoce prenatale (ad esempio, prima di E15), la pelle è difficile da rimuovere senza strapparla. Opportunamente, per molti studi di crescita e patterning di strutture della pelle nei topi, gli eventi di interesse si verificano dopo la nascita, come si è visto ad esempio negli studi della crescita dei muscoli erettore del pelo 19.

Imaging in profondità nella pelle in una configurazione piatta montaggio è impegnativo, perché la pelle è un tessuto relativamente rifrangenti. Questo problema diventa maggiore come la pelle matura a causa della differenziazione e aumento dello spessore degli strati costituenti. Una parziale soluzione a questo problema è quello di separare il derma e dell'epidermide e analizzare l'epidermideè come una struttura separata ("epidermiche supporti interi"). Questo approccio è utile per la visualizzazione follicoli piliferi e le loro strutture associate, in particolare per la pelle coda di topo. Tuttavia, ottenere epidermiche alta qualità intere montaggi dalla pelle dorsale mouse è difficile, presumibilmente a causa di (1) l'alta densità di follicoli che si estendono in profondità nel derma e (2) la sottigliezza dell'epidermide interfollicolari 13.

Nella nostra esperienza, trattamento BBBA è un metodo altamente efficace per rendere la pelle otticamente trasparente preservando segnali immunofluorescenza senza la necessità di separare gli strati epidermici e dermici. Benzil-benzoato è stato usato per cancellare i tessuti per decenni 20 e viene ampiamente usato per cancellare rana e pesce embrioni. Tuttavia, BBBA ha lo svantaggio che denatura GFP e altre proteine ​​fluorescenti, si dissolve Oil Red O, e può contaminare attrezzature (ad esempio, microscopi). Sarebbe di interest per confrontare sistematicamente trattamento BBBA di pelle con altri metodi di chiarificazione come SeeDB 21, ClearT 22, Scala 23, 3DISCO 24, e CLARITY 25, alcuni dei quali sono compatibili con proteine ​​fluorescenti. Se BBBA trattata campioni devono essere ripreso utilizzando un microscopio da dissezione, un / microscopio convenzionale luce fluorescente, o un microscopio confocale, i campioni devono essere posti in un piatto di vetro o fra due lastre di vetro di grandi dimensioni per minimizzare la contaminazione BBBA.

Non abbiamo discusso l'analisi dei dati in dettaglio, in quanto questo è più idiosincratica la questione biologica sotto inchiesta. Tuttavia, come osservato nell'Introduzione, la presenza di molte strutture quasi identici come follicoli piliferi, gruppi di cellule Merkel e terminazioni nervose, e la completezza con cui queste strutture possono essere esposte in supporti piatti offre l'opportunità di misurare i parametri strutturali e morfologiche in un ma statisticamente rigorosanner, come si è visto ad esempio in recenti studi cutanee morfologie assoni sensoriali 10 e dei follicoli piliferi e delle strutture follicolo-associato di tipo selvatico e FZ6 topi mutanti 4,8. Con lo sviluppo di strumenti di analisi delle immagini più sofisticate, può essere possibile automatizzare o semi-automatizzare alcune analisi che, attualmente, vengono eseguite manualmente, facilitando così ampio uso di pelle piatta montare immagini come un metodo per studiare i principi alla base organizzazione multicellulare.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) Roche 11383221001
AM1-43 Biotium 70024
AM4-65 Biotium 70039
Benzyl alcohol Sigma 402834
Benzyl benzoate Sigma  B-6630
Confocal microscope Zeiss LSM700
Cy3-alpha smooth muscle actin antibody Sigma  C6198 1:400
Cytokeratin-8  Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-c 1:500
Dissecting microscope
Dissection tools  Fine Science Tools scissors and forceps
Electric razor
Fluoromount G EM Sciences 17984-25
Formalin Sigma HT501320
Glass dishes Pyrex  6 cm and 10 cm diameter
Glass plates Amersham Biosciences SE202P-10 10 cm x 8 cm x 1 mm
Hair remover  Nair
Horizontal rotating platform  Hoefer PR250 Orbital shaker
Insect pins Fine Science Tools  26002-20
Ketamine/xylazine Sigma K113
Nitroblue tetrazolium (NBT) Roche  11383213001
Oil Red O Sigma O0625
Paraformaldehyde Sigma  P6148
Razor Blades VWR 55411-055
Secondary antibodies  Invitrogen Alexa-dye conjugated 
Sylgard-184 Fisher Scientific NC9020938
Tissue culture plastic dishes 10 cm diameter
Tissue culture plates 6- and 12-well 

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References

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