Appartement Mont imagerie de la peau de souris et son application à l'analyse des follicules pileux Modélisation et sensorielle Axon Morphologie

Neuroscience

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Summary

La peau des mammifères contient un large éventail de structures - comme les follicules pileux et les terminaisons nerveuses - qui présentent des modèles distinctifs de l'organisation spatiale. Analyser la peau comme un support plat profite de la géométrie à 2 dimensions de ce tissu pour produire toute l'épaisseur des images haute résolution des structures de la peau.

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Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology. J. Vis. Exp. (88), e51749, doi:10.3791/51749 (2014).

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Abstract

La peau est un tissu très hétérogène. Structures intra-dermiques comprennent les follicules pileux, les muscles arrector de pili, spécialisations épidermiques (tels que des amas de cellules de Merkel), les glandes sébacées, les nerfs et les terminaisons nerveuses, et des capillaires. La disposition spatiale de ces structures est étroitement contrôlée à l'échelle microscopique - comme on le voit, par exemple, dans l'agencement ordonné des types de cellules au sein d'un seul follicule de cheveux - et à l'échelle macroscopique - comme on le voit par les orientations presque identiques de milliers de cheveux follicules au sein d'une région locale de la peau. Visualiser ces structures sans sectionnement physiquement la peau est possible en raison de la géométrie à 2 dimensions de cet organe. Dans ce protocole, nous montrons que la peau de la souris peut être disséqué, fixées, perméabilisées, coloré, et a précisé que l'objet de deux dimensions intact, un montage plat. Le protocole permet de visualiser facilement les structures de la peau dans leur totalité à travers toute l'épaisseur de grandes surfaces de peau par optsectionnement ical et la reconstruction. Les images de ces structures peuvent également être intégrés avec des informations sur la position et l'orientation par rapport aux axes du corps.

Introduction

La peau est l'un des organes les plus importants dans le corps, avec des fonctions importantes dans somato-sensation, isolation / thermorégulation, et la défense immunitaire 1. Comprendre les bases moléculaires et cellulaires du développement et de la fonction peau a été de longue date un intérêt en raison de l'importance fondamentale de la peau comme un système biologique et sa pertinence pour la dermatologie. La peau des mammifères contient une variété de structures multicellulaires, y compris les couches stratifiées de kératinocytes, du tissu conjonctif dermique, plusieurs types de follicules pileux, les glandes sébacées, les muscles arrector de pili, les vaisseaux sanguins, et au moins une douzaine de classes distinctes de afférente (sensorielles) et efférentes nerf des fibres (figure 1). Les différentes régions du corps sont associées à des caractéristiquement différents types de peau. Dans la plupart des mammifères, près de la surface du corps est recouvert d'une peau qui est très dense avec les follicules pileux. [Les humains et les rats-taupes nus constituent des exceptions à THest modèle.] cheveux est absent de la face palmaire des mains et des pieds, qui sont également associés avec des motifs spécialisées de l'épiderme (les dermatoglyphes), les glandes exocrines, et les terminaisons nerveuses sensorielles. Les événements cellulaires et moléculaires qui contrôlent la croissance, la différenciation et la disposition spatiale des cellules dans le follicule pileux sont d'un intérêt particulier que chaque follicule expositions, en miniature, un grand nombre des caractéristiques centrales de l'organogenèse 2. Ces caractéristiques comprennent l'existence de cellules souches et une niche de cellules souches, les migrations cellulaires précisément chorégraphiés, et l'ensemble des structures multicellulaires de composants embryologiquement distinctes.

Cet article décrit les méthodes de dissection, la fixation, l'étiquetage et la peau imagerie de la souris comme une feuille bidimensionnelle intact, dénommé un «tout support» ou «plat monter" préparation. Comme la peau de la souris est relativement mince, il est possible d'image à travers toute l'épaisseur de ski aplatin en utilisant la microscopie confocale classiques. L'approche plat de montage à l'imagerie peau de mammifère est techniquement avantageuse car elle contourne la nécessité de sectionnement physique, permettant ainsi des structures à reconstruire entièrement par sectionnement optique. Etant donné que la presque totalité de la peau est traité comme un seul objet, la monture plate approche facilite également la formation d'image de plusieurs régions de la surface du corps tout en conservant des informations sur la position et l'orientation par rapport aux axes du corps. Enfin, les structures à l'intérieur de la peau sont généralement présents dans des motifs qui se répètent à intervalles réguliers, ce qui facilite le recueil d'images à partir de plusieurs représentants d'une structure donnée. Ces caractéristiques sont familiers aux neurobiologistes qui travaillent sur ​​la rétine, une partie en deux dimensions du système nerveux central qui bénéficie des avantages analogues pour les études de morphologie neuronale 3.

L'approche plat monter décrit ici est de utilit spécialey pour l'étude des structures qui présentent une organisation spatiale sur une échelle relativement grande dans le plan en deux dimensions de la peau. Un exemple d'organisation à grande échelle spatiale est la polarité coordonnée des follicules pileux et des structures du follicule associée cheveux - amas de cellules de Merkel, arrecteur muscles de pili, les glandes sébacées, et les terminaisons nerveuses 4. Les follicules pileux sont orientées selon un angle par rapport au plan de la peau, et la composante du vecteur du follicule qui se trouve dans le plan 2-dimensionnel de la peau présente généralement une orientation par rapport aux axes du corps qui est déterminée avec précision pour chaque position sur le corps. Par exemple, les follicules pileux sur le point de rostrale de retour à caudale et les cheveux sur la surface dorsale des pieds font de proximal en distal. Follicule pileux orientation est commandée par la signalisation de la polarité planaire cellulaire (PCP; également appelé polarité tissulaire 5). Ce système de signalisation a été découvert chez la drosophile, où un petitensemble de gènes de PCP de base a été trouvé pour contrôler l'orientation des poils et des poils cuticulaires. Trois orthologues mammifères de gènes PCP de base - homologues crépus 6 (Fzd6, aussi appelé Fz6), cadhérine FEM LAG sept-pass récepteur de type G 1 (Celsr1), et vang-like 2 (Vangl2) - jouent des rôles analogues à des mammifères peau, de coordonner les orientations de follicules pileux avec les axes du corps. Les études de FZ6 knockout souris (Fzd6 tm1Nat, ci-après dénommé Fz6 - / -) montrent que le défaut primaire en l'absence de signalisation de PCP est une randomisation initiale ou la désorganisation de l'orientation du follicule pileux, sans effet sur ​​la structure intrinsèque des follicules 6-8. Un deuxième système non-PCP agit plus tard à promouvoir alignement local de follicules à proximité, ce qui conduit à la production de modèles de cheveux à grande échelle tels que tours et des touffes.

Un deuxième exemple de grande échelleorganisation spatiale dans la peau est vu dans les morphologies des tonnelles axonales sensorielles. Les neurones sensoriels qui innervent la peau ont leurs corps cellulaires dans la racine dorsale et les ganglions de Gasser. Ces neurones détectent la température, la douleur, les démangeaisons, et divers types de déformations mécaniques incidentes sur la peau et les cheveux 9. Ils peuvent être divisés en sous-types basés sur le diamètre de l'axone et la vitesse de conduction, de la structure de terminaison du nerf terminal, et les profils d'expression de récepteurs, de canaux et d'autres molécules. En raison de la forte densité d'innervation à l'intérieur de la peau, des analyses qui impliquent la visualisation de l'ensemble des axones (par exemple, l'immunomarquage anti-neurofilaments) ou même tous les axones d'une seule classe (comme on le voit lorsque un seul type cellulaire est caractérisée par l'expression d'un rapporteur fluorescent) révèle généralement une superposition dense des axones qui rend impossible de définir la morphologie d'un arbre individuel. Pour contourner ce problème, nous avons utilisé très clairsemée l génétiquement dirigéeAbeling pour produire des échantillons de peau dorsale dans laquelle chaque tonnelles axonales bien isolées sont visualisés par l'expression d'un journaliste histochimique, la phosphatase alcaline placentaire humaine 10. Cette approche permet la visualisation sans ambiguïté des différents morphologies axone tonnelle et une définition des types de neurones somato-sensoriel basé sur des critères morphologiques.

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Protocol

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Tous les animaux ont été traités selon approuvé protection des animaux et l'utilisation comité (IACUC) protocole MO11M29 des Johns Hopkins Medical Institutions. Consultez vos directives locales du Comité de protection et d'utilisation des animaux institutionnels pour les méthodes d'euthanasie approuvées. Porter des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité lors de la manipulation des fixateurs d'aldéhydes ou des solvants organiques.

Une. Préparation des matériaux

  1. Verser Assiettes SYLGARD
    1. Suivez les instructions du fabricant, mélanger le durcisseur avec la base, et remuez avec une tige en plastique.
    2. Pipette ~ 35 ml Sylgard liquide par 10 cm de diamètre tissu boîte de culture. des boîtes de culture de tissus sont plus profondes que les plats bactériens standard; cela donne dégagement vertical pour les broches d'insectes.
    3. Placez le dishes sur une surface horizontale à température ambiante jusqu'au lendemain. Bulles formées pendant le mélange disparaîtront.
    4. Après la polymérisation, stocker les plaques Sylgard à la température ambiante.
      REMARQUE: Les plaques Sylgard peuvent être stockés à température ambiante pendant des années et réutilisés plusieurs fois jusqu'à ce que le Sylgard se détache de la plaque.
  2. Solutions
    1. Benzoate de benzyle et d'alcool benzylique (BBBA). Mélanger 2 volumes de benzoate de benzyle et de 1 volume d'alcool benzylique. Conserver dans l'obscurité dans une bouteille en verre avec un bouchon en verre ou en téflon haut.
      ATTENTION: Utilisé BBBA doit être convenablement traité comme les déchets de solvant organique. Ne laissez pas BBBA Contact plastique.
    2. Solution tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 4 g PFA à 80 ml d'eau, ajouter 0,1 ml de NaOH 1 N, mélanger sur une plaque chaude à ~ 70 ° C pendant environ 5 min jusqu'à ce que la PFA est complètement dissous, puis ajouter 10 ml 10x PBS et porter le volume à 100 ml avec de l'eau.
      ATTENTION: L'inhalation de formaldéhyde / PFA et bbba vapeurs devrait êtreminimisée par le maintien de ces solutions dans des récipients couverts. Formaldéhyde / PFA est un cancérogène.
    3. Oil Red O. Préparez 0,5% stock dans de l'isopropanol. Immédiatement avant utilisation diluées avec de l'eau à une concentration finale de 0,3% Oil Red O, puis filtrer à travers un filtre de 0,2 um.

2. Dissection de la peau, la fixation et de compensation

  1. Dorsale peau pour Immunocoloration et mélanine Imaging
    1. Pour les très jeunes souris (par exemple, les fœtus et jour postnatal (chiots P) 0-P3), euthanasier les souris par inhalation d'isoflurane. Euthanize souris âgées par inhalation d'isoflurane ou par injection de kétamine / xylazine suivie par dislocation cervicale.
    2. Retirer les cheveux avec un rasoir électrique et le gel de l'épilation. Pour les jeunes souris à P8, cette étape peut être sautée.
    3. Utiliser une lame de rasoir pour faire une coupe horizontale à partir de la base de la queue le long de chaque flanc, en passant sur la face dorsale de la base de chaque branche, en procédant latérale pour les oreilles et finment au niveau du nez.
    4. Retire la peau de la procédure de tissu sous-jacent d'arrière en avant en tenant la peau entre les doigts gantés de sorte qu'il ne soit pas écrasé par une pince. Lorsque le pelage de la peau au niveau des oreilles, la première coupe les oreilles avec une paire de ciseaux et procéder notamment lentement que la peau peut se déchirer à cet endroit.
    5. Partir de ce point, orienter la peau avec l'intérieur vers le haut. Epingler la peau de Sylgard avec ~ 20 broches insectes régulièrement espacées autour de la périphérie; ne pas trop étirer pas la peau (figure 2B). Couvrir la peau avec 10-20 ml de PBS.
    6. Disséquer la graisse associée peau et du tissu conjonctif à l'aide des pinces angulaires ou courbes avec l'extrémité pointue de la pince face horizontalement afin de minimiser le risque que les pinces seront pénétrer dans la peau. Extruder les bulles d'air qui ont été emprisonnés sous la peau par de douces d'un coton-tige sur la surface de la peau.
      NOTE: Si la peau est en trainêtre utilisé pour immunomarquage montage à plat ou histochimie, enlever le plus de tissus conjonctifs que possible; si la peau est en train d'être utilisée pour visualiser les follicules pileux sur la base de la mélanine pigmentation, l'élimination complète de moins de tissu conjonctif est satisfaisante. Peau prénatal nécessite un minimum de "nettoyage" du tissu conjonctif adhérent.
    7. Fixer la peau goupillé en ajoutant 20 ml de 4% fraîchement préparé PFA / PBS ou de formaline à 10% tamponnée par 10 cm de plaque Sylgard (si la peau est utilisée pour l'imagerie de la mélanine ou la phosphatase alcaline (AP) histochimie) ou 20 ml de fraîchement préparée PFA 2% / PBS (si la peau sera utilisée pour immunologique ou transgénique visualiser kératine (KRT) 17-GFP 11), et tourner doucement la nuit dans une chambre froide. Le lendemain, laver dans du PBS pendant> 10 min.
      NOTE: formol standard est de 37% de formaldéhyde; par conséquent, "10% de formol" est de 3,7% de formaldéhyde.
    8. Pour la coloration AP et immunologique, continuer dans la section 3. Pour mélanine imagment, déshydrater la peau à travers une série d'éthanol à (70%, 95%, 100%), un jour pour chaque étape, avec une rotation horizontale douce à température ambiante. Retirer les tissus conjonctifs résiduelles.
    9. Avec la peau 100% d'éthanol, retirer les broches d'insectes et, si désiré, couper la peau avec des ciseaux pour enlever le plus périphérique de 1-2 mm de la peau avec les trous d'épingle.
    10. Transférer la peau dans un plat en verre de 10 cm de diamètre, placer deux lames de microscope en verre sur la peau pour l'empêcher de curling, et ajouter 20 ml de BBBA. BBBA durcit rapidement le tissu de sorte qu'il est important pour la peau d'être aplatie sous le poids des plaques de verre avant d'ajouter le BBBA.
    11. Au cours des prochaines heures, lever les diapositives sur la peau pendant quelques secondes pour permettre au BBBA à laver sur la peau.
      REMARQUE: Portez des gants lorsque vous travaillez avec BBBA. Selon l'âge et le lieu de la peau, il peut y avoir jusqu'à 30% de retrait dans BBBA.
  2. peau des pieds pour l'analyse des follicules pileux Patterning
    REMARQUE: La gamme d'âges habituellement examinées est P1-P8.
    1. Après l'euthanasie, couper les pieds au-dessus de la cheville et faire une seule coupe droite le long de la surface ventrale par la plante des pieds.
    2. Retirez délicatement la peau du tissu sous-jacent, de procéder à une extrémité proximale de direction distale.
    3. Couper les chiffres de libérer la peau et la broche à SYLGARD avec la surface intérieure vers le haut (figure 2C). Il est minimal du tissu conjonctif de la peau du pied.
    4. Peau transgénique Krt17-GFP est maintenant prêt pour l'imagerie. Pour l'imagerie de mélanine procéder à la fixation, la déshydratation et BBBA compensation tel que décrit à la section 2.1.
  3. peau des pieds pour visualiser glandes sébacées
    1. Après l'euthanasie, enlever les poils en frottant gel dépilatoire sur la surface de la peau avec un doigt ganté et le pouce; attendre pendant 10 min.
      NOTE: Ne pas utiliser un rasoir électrique, qui peuvent endommager la peau de pied délicat.
    2. Wcendre la surface de la peau avec de l'eau du robinet, disséquer et épingler la peau de Sylgard comme décrit dans la section 2.2.
    3. Fixer avec 1% de PFA / PBS pendant 30 min à température ambiante, puis lavez en PBS.
      REMARQUE: Pour visualiser les glandes sébacées sur les pieds, qui se développent après la première semaine après la naissance, l'âge optimal pour l'analyse avec Oil Red O est P21, car cela marque le nadir de la pigmentation des cheveux pendant le premier cycle de cheveux 12, et par conséquent, les glandes sébacées on peut le voir plus facilement. Avec la souris albinos cette analyse pourrait être effectuée à tout âge. Pour obtenir des descendants des souris mutantes pigmentée croix albinos à une lignée mutante tyrosinase comme C57BL/6J-Tyr c-2J.
  4. Préparation queue de la peau pour l'analyse de mélanine Distribution, follicule pileux Orientation et glande sébacée Visualisation
    1. Après l'euthanasie, faire une coupe circulaire autour de la base de la queue, puis une fente longitudinale qui s'étend le long de la queue le long de sa face ventrale.
    2. <li> Retirez la peau de la queue à partir de la pointe en tenant fermement le bout de la queue d'os et / ou de tissu conjonctif avec une paire de pinces et la peau avec une deuxième paire de pinces. Epingler la queue à la peau Sylgard.
    3. Pour l'analyse de la répartition de la mélanine du follicule pileux et l'orientation, fixer et traiter la peau tel que décrit à la section 2.1. Pour l'analyse des glandes sébacées, couper la peau de la queue en une série de segments ~ 0,5 à 1 cm de longueur avant la fixation et incuber les morceaux de peau en mM EDTA PBS / 5 pendant une nuit à 37 ° C pour affaiblir le derme-épiderme adhérence 13.
    4. Retirez délicatement l'épiderme du derme, l'épiderme à la broche Sylgard (face intérieure vers le haut), et le fixer à 4% PFA / PBS pendant 1 heure à température ambiante. Laver avec du PBS, et tacher avec Oil Red O comme décrit ci-dessous.
      REMARQUE: Un rasoir électrique et / ou gel d'épilation peuvent être utilisés avant la dissection plus peau de la queue (par exemple, P21), mais ce traitement est facultative puisque le poil de la queue n'est pasaussi dense que ailleurs sur le corps.

3. Réactions de coloration

  1. Phosphatase alcaline placentaire humaine (AP) histochimie pour visualiser génétiquement marqué Axon Tonnelles 10,14,15 (figures 3A, B)
    1. Après PFA fixation sur Sylgard, placez peaux fixes dans un plat en verre de 10 cm et plongez dans PBS / 1 mM de MgCl2. Tournez doucement le plat dans un bain d'eau à 70 ° C pendant 90 min à détruire l'activité de la phosphatase endogène.
    2. Visualiser l'activité du rapporteur AP histochimique avec une incubation de 4 à 48 h à la température ambiante dans du Tris 0,1 M, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl 2, 0,34 pg / ml de NBT et 0,175 ug / ml de BCIP, en utilisant typiquement de 10 à 15 ml de solution de coloration par P21 peau dorsale. Surveillance de la réaction sous le microscope de dissection, en prenant soin de ne pas laisser passer au-delà de la période optimale, à en juger par l'inspection visuelle de l'axone coloration intensité relative au dépôt NBT non spécifique. Arrêter la réaction par lavage avec trois changements de PBS contenant 0,1% de Tween-20 au cours de 1 heure, re-broches les peaux à Sylgard, déshydrater la peau à travers une série d'éthanol, puis transférer les peaux dans un plat de 10 cm avec BBBA.
      REMARQUE: BBBA dissout lentement le précipité NBT. Pendant les premières heures de BBBA, une amende fond de précipité NBT va se dissoudre; par conséquent, la solution BBBA s'assombrit, et la peau alléger. Changer de BBBA frais après quelques heures.
    3. Après l'imagerie de la peau AP-souillé, transférer à l'éthanol pour> 1 h à température ambiante, puis le stocker dans de l'éthanol frais à -20 ° C. Peaux AP-colorées peuvent être stockés de cette manière pendant plusieurs mois sans perte de signal.
  2. Oil Red O coloration pour visualiser glandes sébacées 4 (figures 3C-F)
    1. Retirer les repères d'insectes et de transférer le pied fixe ou légèrement peaux de queue de la plaque de Sylgard dans les puits d'une plaque de culture tissulaire à 6 puits, avecjusqu'à deux échantillons de peau par puits. Laver avec de l'isopropanol 60:40: l'eau pendant 5 min à température ambiante.
    2. Colorer dans 2 ml de 0,3% Oil Red O 60:40 isopropanol: eau (voir section 1.2) à la température ambiante pendant 2 heures.
    3. Laver avec de l'isopropanol 60:40: eau pendant 5 min à température ambiante, suivi d'un lavage à l'eau. Couper avec précaution loin des bords de la peau, y compris les trous d'épingle, avec des ciseaux fins pour que la surface de la peau peut être fait le plus plat possible.
    4. Placez la peau sur une lame avec la surface extérieure vers le haut, ajouter quelques gouttes d'eau ou de milieu de montage aqueux, couvrir la peau avec une lamelle, puis scotchez délicatement la lamelle sur la lame pour aplatir davantage la peau.
  3. Appartement Mont Immunocoloration 4,16,17 (figures 3G, H)
    1. Découpez un rectangle de peau PFA fixe (par exemple 1 cm x 0,5 cm), marquant son orientation avec une coupe asymétrique (par exemple, couper le coin droit antérieur). Effectuez l'incubation etétapes de lavage avec une légère rotation sur une plate-forme horizontale tournant. Dans les puits d'une 6 - ou plaque à 12 puits pour culture de tissus, laver à plusieurs reprises avec du PBS pour éliminer PFA résiduel, laver avec ~ 10 changements de PBS avec 0,3% de Triton X-100 (0,3% PBST) plus de 5-8 heures à la température ambiante, pour perméabiliser la peau.
    2. Incuber avec l'anticorps primaire à 0,3% du PBST avec 5% de sérum de chèvre et 20% de DMSO, pendant cinq jours à la température ambiante. Couvrir les puits de la plaque avec du ruban adhésif transparent ou en plastique adhésif pour éliminer les pertes par évaporation.
    3. Laver avec de 10 à 15 changements de PBST 0,3% au-dessus de 8.5 hr et incuber avec un anticorps secondaire dans du PBST à 0,3% avec 5% de sérum de chèvre et 20% de DMSO pendant 3 jours à température ambiante.
    4. Laver avec 10-15 changements de 0,3% PBST plus de 5-8 heures.
    5. Déshydrater à 25%, 50% et 75% de methanol pendant 5 minutes chacun, puis 3x dans du methanol à 100% pendant 20 minutes chacun.
    6. Effacer dans BBBA une nuit à température ambiante.
      REMARQUE: Plat immunologique de la peau plus jeune que monter~ P1 peut être effectuée comme décrit ci-dessus mais avec une incubation plus courte et lavez fois. Par exemple, la peau P1 peut être immunocoloré avec une nuit d'incubation dans l'anticorps primaire et une heure d'incubation de plusieurs dans l'anticorps secondaire, et intervenant lavages de seulement 2-3 heures dans 0,3% PBST. Comme indiqué ci-dessus, peaux jeunes sont aussi suffisamment minces qu'ils peuvent être visualisés sans BBBA compensation.
  4. Visualisation Merkel amas de cellules nerveuses avec fluorescent Terminal Dye absorption (figures 3I-L)
    AMI-43 (vert) et AM4-65 (rouge) sont des colorants fluorescents qui pénètrent dans les cellules pouvant être fixés par l'intermédiaire de canal cationique non sélectif 18. Dans la peau vivante de ces colorants sont sélectivement absorbés et concentrés dans les cellules de Merkel.
    1. Dissoudre 1 mg AM1-43 ou AM4-65 dans 2 ml de PBS et de stocker en aliquots à -80 ° C.
    2. Injecter nouveau-nés voie sous-cutanée avec 2-10 pg colorant par rapport au poids de corps de gramme en utilisant une aiguille 29 G.
    3. Un jour plus tard, euthanasier les souris et dissect les peaux dorsales.
    4. Fixer les peaux à 4% PFA / PBS à 4 ° C pendant la nuit, se laver avec du PBS, et monter la peau tel que décrit dans la section 3.2.

4. D'imagerie et d'analyse de l'image

  1. Imagerie follicule pileux Orientation (Figure 4)
    1. Utiliser un microscope de dissection à l'image dorsale, pied, ou peaux de la queue qui sont immergés dans BBBA, aplati sous une lame de verre, et toujours dans le plat en verre - cette approche minimise la contamination BBBA du microscope.
    2. Éclairer le plat ci-dessous. Afin de minimiser la variation spatiale de l'intensité lumineuse dans le champ de vision, d'élever le verre plat à une hauteur ~ 10 cm au-dessus de la surface de travail standard de la loupe binoculaire et placer un plastique diffusant ou plaque de verre sur la source de lumière.
    3. Retour à la peau de l'éthanol à 100% pour le stockage à long terme à -20 ° C.
      NOTE: En sortant de la peau dans BBBA pour plus d'une journée amène les granules de mélanine pour briser unepartie. Une fois que la peau a été traitée BBBA il va durcir et rester stable partir de ce point. Différentes peaux peuvent être codées avec une série d'encoches à leur antérieure et / ou postérieure se termine, de sorte qu'ils peuvent être stocker ensemble, pour gagner de la place dans le congélateur.
  2. Imagerie et traçage Axon Tonnelles (figures 3A, B)
    1. Placez AP teinté peau (section 3.1.3) entre deux plaques de verre du type utilisé pour les petits gels de protéines. Éviter d'introduire des bulles d'air entre les plaques et la peau, et ensuite soigneusement évacuer tout excès BBBA avec une serviette en papier. Placer le sandwich de type plaque-plaque sur la peau une platine de microscope (Figure 2D).
    2. Utilisez champ lumineux ou éclairage DIC avec un objectif 10X et 2 um ou 5 um Z-étapes. Utilisez une platine XY mécanisée pour capturer un montage d'images XY qui sont cousus ensemble pour créer un ensemble unique de données d'échelle de gris en trois dimensions.
      NOTE: Pour un seul grand arbre de l'axone, cet ensemble de données peut être uns grand que 5 Gb.
    3. Effectuer manuel, automatisé ou semi-automatisé traçage des tonnelles axonales avec toute une variété de progiciels.
      NOTE: Des logiciels tels que Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) est un outil de reconstruction neuronale gratuit qui s'exécute dans un environnement de PC et est relativement facile à maîtriser 10.

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Representative Results

imagerie de fond clair de flatmounts de la peau peut être utilisée pour l'image afférences sensorielles cutanées (figure 3A) et 10 modèles de follicules pileux sur la base de pigmentation mélanique (Figure 4). L'imagerie confocale d'flatmounts de la peau peut être utilisée pour définir la géométrie de (1) des agrégats de cellules Merkel, visualisées avec un anticorps anti-cytokératine-6 ​​ou à l'absorption AM de teinture (figures 3I-L), (2) les muscles arrector de pili, visualisé avec un anti- actine de muscle lisse (figures 3G, H), (3) les glandes sébacées, visualisées avec Oil Red O (figures 3C-F), et (4) les follicules pileux, visualisées avec un transgène Krt17-GFP ou par coloration avec des anticorps anti-Krt17 4 (figures 3E-G, K, L). Il est facile de marquer manuellement les orientations et les dispositions spatiales des structures dans ces images en plaçant les vecteurs d'orientation connue sur les structures à l'aide d'Adobe Photoshop ou Illustrator, puis quantifying les populations de vecteurs résultant. Bien que cette approche suffit pour une échelle de plusieurs centaines de vecteurs, il serait trop fastidieux sur un 10 - ou 100 fois plus grande échelle.

Figure 1
Figure 1. Schéma de peau velue mammifères montrant les grandes structures. (Droit d'auteur, Terese Winslow.)

Figure 2
Figure 2. dissection de la peau et la manipulation des échantillons. A) des outils de dissection. B) Un P5 dorsale peau épinglé à une plaque Sylgard. C) Un P5 dorsale derrière la peau de pied coincé sur une plaque Sylgard. D) Une peau dorsale monté entre deux plaques de gel de verre pour l'imagerie wvec un objectif 10X et DIC ou éclairage en fond clair.

Figure 3
Structures de la peau Figure 3. Dans plat monter vues. A, B) Un arbre unique cutanée sensorielle (à gauche) et son tracé image (à droite) à partir d'une peau P21 dorsale d'un Brn3a CKOAP / +;. NFL CREER / + souris exposée à de faibles doses de tamoxifène à jour de gestation 17 résultats Ce protocole dans la recombinaison à médiation par Cre du rapporteur dans une très petite fraction des neurones de ganglions de la racine dorsale, et donc une petite fraction des mandrins sensoriels cutanés sont marquées avec la phosphatase alcaline placentaire (AP) reporter humaine. Les axones marqués sont visualisées avec NBT / BCIP histochimie. Brn3a est équivalente appelée Pou4f1. C, D) la peau de la queue colorée avec Oil Red O de visualiser les glandes sébacées deWT (à gauche) et Fz6 - / - (à droite) des souris à la P21. FZ6 - / - structures sont désorganisés. P, proximale; . D, distale E, F) Dorsale peau de pied de WT (à gauche) et Fz6 - / - (à droite) des souris porteuses Krt17-GFP. La peau a été récolté à P21 et coloré avec Oil Red O. FZ6 - / - peau a une spirale de cheveux en son centre. P, proximale; . D, distale G, H) Dorsale peau d'une souris WT à P21 montrant les follicules pileux (visualisées avec un transgène Krt17-GFP et anti-GFP immunologique; panneau G) et les muscles arrector de pili [visualisées avec des anticorps anti-actine musculaire lisse (SMA ) immunologique; panneau H]. Profondeur dans l'image confocale Z-stack est codé en couleur. A, antérieure; P, postérieure. IL) pôle de la cellule A Merkel (visualisées avec immunomarquage de cytokeratin8 ou AM11-43 colorant absorption) et de son follicule pileux central (visualisée en panneaux K et L avec Krt17-GFP). Les images ont été obtenues à partir de P1 dorsale peau contre les génotypes indiqués. FZ6 - / - grappe de cellules de Merkel forme un cercle fermé, tandis que l'amas de cellules WT Merkel est ouverte vers la partie antérieure. A, antérieure; P, postérieur. Barres d'échelle: A et B, 300 um; C et D, 500 pm; E et F, 500 um; G et H, 200 um; IL, 50 um. (Panneaux A et B sont reproduits à partir eLife et Proc. Natl. Acad. Sci. Etats-Unis, avec la permission 4,10) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Cheveux et les follicules pileux dans la peau du dos à P1 et P7 visualisées avec pigmentation mélanique. A, B) P1 peau de WT et Fz6 - / -. souris C, D) peau P7 de FZ6 - / - souris. Barres d'échelle: A et B, 500 um; C et D, 1 mm.

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Discussion

Maîtrise des méthodes de dissection décrites ci-dessus ne nécessite patience, d'une main ferme, et quelques bons outils de dissection. La dissection de la peau dorsale est relativement facile, mais la queue et la peau de pied dissections - en particulier aux âges postnatales - sont plus difficiles. Au début des âges prénatal (par exemple, avant E15), la peau est difficile à enlever sans le déchirer. Idéalement, pour de nombreuses études sur la croissance et la structuration des structures de la peau chez la souris, les événements intéressants se produisent après la naissance, comme on le voit par exemple dans les études de la croissance des muscles arrector de pili 19.

Imagerie en profondeur dans la peau d'une configuration plane de montage est difficile parce que la peau est un tissu relativement réfractile. Ce défi devient plus que la peau vient à échéance en raison de la différenciation et l'augmentation de l'épaisseur de ses couches constitutives. Une solution partielle à ce problème est de séparer le derme et l'épiderme et analyser l'épidermeest comme une structure distincte ("épidermiques ensemble des supports"). Cette approche est utile pour la visualisation de follicules pileux et leurs structures associées, en particulier pour la peau de la queue de la souris. Toutefois, l'obtention épidermiques montures entières de haute qualité de la peau dorsale de la souris est difficile, sans doute en raison de (1) la forte densité des follicules pileux qui s'étendent profondément dans le derme et (2) la finesse de l'épiderme interfolliculaires 13.

Dans notre expérience, le traitement BBBA est une méthode très efficace pour rendre la peau optiquement transparent, tout en préservant les signaux d'immunofluorescence sans la nécessité de séparer les couches épidermiques et dermiques. Benzyl-benzoate a été utilisée pour effacer les tissus pendant des décennies 20 et il est largement utilisé pour effacer grenouilles et poissons embryons. Cependant, BBBA présente l'inconvénient qu'elle dénature GFP et d'autres protéines fluorescentes, il se dissout Oil Red O, et il peut contaminer l'équipement (par exemple les microscopes). Il serait interest de comparer systématiquement le traitement BBBA de la peau avec d'autres méthodes de clarification tels que SeeDB 21, ClearT 22, échelle 23, 3DISCO 24, et CLARITY 25, dont certains sont compatibles avec des protéines fluorescentes. Si BBBA échantillons traités sont à imager l'aide d'un microscope à dissection, une lumière / microscope à fluorescence conventionnelle, ou un microscope confocal, les échantillons doivent être placés dans un plat en verre ou entre deux grandes plaques de verre pour minimiser la contamination BBBA.

Nous n'avons pas discuté l'analyse des données en détail, ce qui serait plus idiosyncrasique à la question biologique à l'étude. Toutefois, comme indiqué dans l'introduction, la présence de nombreuses structures presque identiques tels que les follicules pileux, des amas de cellules de Merkel, et les terminaisons nerveuses, et l'exhaustivité avec laquelle ces structures peuvent être imagés dans les montagnes plates donne l'occasion de mesurer les paramètres structurels ou morphologiques dans un ma statistiquement rigoureusenner, comme on le voit par exemple dans des études récentes de cutanées morphologies sensorielles axonales 10 et des follicules pileux et des structures du follicule associée à de type sauvage et des souris mutantes Fz6 4,8. Avec le développement d'outils d'analyse d'images plus complexes, il peut être possible d'automatiser ou semi-automatiser certaines des analyses qui, à l'heure actuelle, sont effectuées manuellement, ce qui facilite une utilisation plus large de la peau imagerie monter plat comme une méthode pour étudier les principes sous-jacents organisation pluricellulaire.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) Roche 11383221001
AM1-43 Biotium 70024
AM4-65 Biotium 70039
Benzyl alcohol Sigma 402834
Benzyl benzoate Sigma  B-6630
Confocal microscope Zeiss LSM700
Cy3-alpha smooth muscle actin antibody Sigma  C6198 1:400
Cytokeratin-8  Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-c 1:500
Dissecting microscope
Dissection tools  Fine Science Tools scissors and forceps
Electric razor
Fluoromount G EM Sciences 17984-25
Formalin Sigma HT501320
Glass dishes Pyrex  6 cm and 10 cm diameter
Glass plates Amersham Biosciences SE202P-10 10 cm x 8 cm x 1 mm
Hair remover  Nair
Horizontal rotating platform  Hoefer PR250 Orbital shaker
Insect pins Fine Science Tools  26002-20
Ketamine/xylazine Sigma K113
Nitroblue tetrazolium (NBT) Roche  11383213001
Oil Red O Sigma O0625
Paraformaldehyde Sigma  P6148
Razor Blades VWR 55411-055
Secondary antibodies  Invitrogen Alexa-dye conjugated 
Sylgard-184 Fisher Scientific NC9020938
Tissue culture plastic dishes 10 cm diameter
Tissue culture plates 6- and 12-well 

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References

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