Ultrastructural विश्लेषण के लिए खमीर endosomal प्रणाली की Nanogold लेबल

1Department of Cell Biology, University Medical Center Utrecht
Biology

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Summary

खमीर, Saccharomyces cerevisiae, endosomal प्रणाली की जीवजनन और कार्यों को विनियमित जीन की पहचान और अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख मॉडल जीव किया गया है. यहाँ हम ultrastructural पढ़ाई के लिए endosomal डिब्बों की विशिष्ट लेबलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे.

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Mari, M., Griffith, J., Reggiori, F. Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses. J. Vis. Exp. (89), e51752, doi:10.3791/51752 (2014).

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Abstract

Endosomes कोशिकाओं में चौकियों छँटाई प्रमुख झिल्ली में से एक हैं और वे ज्यादातर प्लाज्मा झिल्ली और Golgi से प्रोटीन की रीसाइक्लिंग या विनाश को विनियमित. नतीजतन endosomal प्रणाली सेल homeostasis को बनाए रखने में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, और vesicular परिवहन से जुड़े organelles के इस नेटवर्क से संबंधित जीन में उत्परिवर्तन, कैंसर और neurobiological विकारों सहित गंभीर विकृतियों का कारण. यह endosomal प्रणाली की जीवजनन और संगठन अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए इसलिए प्रधानमंत्री प्रासंगिकता की है. खमीर के इस कार्य में निर्णायक रही है. विशेष रूप से लेबल और ultrastructural स्तर पर इस मॉडल जीव के endosomal प्रणाली का विश्लेषण करने के लिए, हम यहाँ एक चांदी वृद्धि की प्रतिक्रिया के माध्यम से इन कणों के दृश्य द्वारा पीछा स्फेरोप्लास्ट द्वारा सकारात्मक आरोप लगाया nanogold तेज के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस विधि को भी एक मूल्यवान भी हैendosomal तस्करी में दोष के साथ म्यूटेंट की रूपात्मक परीक्षा के लिए एल. इसके अलावा, यह न केवल ultrastructural परीक्षाओं के लिए लागू है, लेकिन यह भी प्रोटीन स्थानीयकरण जांच के लिए immunogold labelings के साथ जोड़ा जा सकता है.

Introduction

endosomal प्रणाली 1,2 रिसेप्टर्स lysosomal एंजाइम छँटाई रिसेप्टर्स की तस्करी और प्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री) के पुनर्चक्रण सहित कई महत्वपूर्ण सेलुलर भूमिका निभाता है कि एक प्रमुख झिल्ली छँटाई तंत्र है. Endosomes तीन अलग डिब्बों, अर्थात् में विभाजित हैं. जल्दी endosomes (ई), देर endosomes (ले) और पुनर्चक्रण endosomes. इस वर्गीकरण में यह विशिष्ट मार्कर प्रोटीन पर और उनके आकारिकी पर, उन तक पहुँचने के लिए endocytosed सामग्री के लिए लगने वाले समय पर आधारित है. PM से भली भाँति झिल्ली, यानी प्रोटीन और लिपिड bilayers, या तो गिरावट के लिए endosomes माध्यम लाइसोसोम के लिए दिया जा सकता है या वापस पुनर्नवीनीकरण किया. झिल्ली भी लाइसोसोम को जारी रखने या वापस Golgi को पुनः प्राप्त किया, या तो इसी Golgi से endosomes के लिए ले जाया जाता है. इसके अलावा, प्रोटीन endosomal सीमित झिल्ली के गठन की ओर जाता है कि एक प्रक्रिया से आवक नवोदित luminal vesicles में हल किया जा सकता हैले के एक उपश्रेणी, multivesicular निकायों.

खमीर endosomal प्रणाली अपेक्षाकृत कम जटिल उच्च कोशिकाओं में से एक से अधिक है. खमीर endosomes ई और ले में विभाजित हैं. वे पुनर्चक्रण endosomes लेकिन यह भी ऊतक विशेष लाइसोसोम से संबंधित organelles शामिल नहीं है स्तनधारी कोशिकाओं के विपरीत. नतीजतन वे endosomal तस्करी मार्गों 3,4 की एक कम जटिल नेटवर्क है. इसलिए खमीर का प्रतिनिधित्व किया और अब भी endosomal प्रणाली में सिद्धांतों अंतर्निहित झिल्ली यातायात के कुछ अध्ययन करने के लिए एक लाभप्रद प्रायोगिक प्रणाली का प्रतिनिधित्व किया है. यह लाभ endosomal रास्ते में शामिल कई जीनों शुरू में खमीर 5 में आनुवंशिक स्क्रीन के साथ पृथक किया गया है कि इस तथ्य से बल दिया है. जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती कोशिकाओं में खमीर endosomal प्रणाली में बड़े पैमाने पर जैव रासायनिक और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का उपयोग कर अध्ययन किया गया है, वहीं ultrastructural स्तर पर इसकी जांच ही कर दिया गया हैकम से कम. Endosomal organelles से ज्यादातर ने अपने स्पष्ट पहचान 6 मुश्किल बना जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा बीच में रोकना संरचनाओं, के रूप में पहचान कर रहे हैं क्योंकि रूपात्मक विश्लेषण खमीर में विशेष रूप से प्रासंगिक हैं. दुर्भाग्य से खमीर endosomal प्रोटीन मार्कर पहचानने antisera का केवल एक सीमित संख्या (आईईएम) की तैयारी 7-10 इम्युनो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में काम कर रहा है. कुछ प्रोटीन के लिए, इस समस्या हित के जीन की अंतर्जात टैगिंग और यह 7,11,12 पता लगाने के लिए टैग पहचानने एक एंटीबॉडी का उपयोग करके उन्हें धोखा दिया गया है. अक्सर, हालांकि, प्रोटीन, क्योंकि उनके कम अभिव्यक्ति के स्तर की आईईएम द्वारा undetectable हैं. इस दृष्टिकोण organelle आकारिकी / कार्यों में गलत localizations और / या परिवर्तन पैदा कर सकते हैं क्योंकि उनके overexpression एक समाधान नहीं है. इस प्रकार इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ईएम द्वारा detectable एक जांच के साथ endocytic डिब्बों की लेबलिंग एक कारगर विकल्प है. यह विशेष रूप से अगर एक इष्टतम समाधान है जनसंपर्कओबीई यह एक विशिष्ट organelle 6 प्रतीक होगा जब पता करने के लिए अनुमति देता है जो एक समय पर निर्भर ढंग से endocytic मार्ग, प्रवेश कर रहा है.

खमीर स्फेरोप्लास्ट (सेल दीवार enzymatically हटा दिया गया है, जहां यानी. खमीर) द्वारा सकारात्मक आरोप लगाया nanogold के तेज सफलतापूर्वक खमीर endosomal 10 डिब्बों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन कणों को दृढ़ता से जैविक झिल्ली रचना नकारात्मक आरोप लगाया लिपिड करने के लिए बाध्य. इस प्रकार प्रधानमंत्री के साथ सकारात्मक आरोप लगाया nanogold एसोसिएट्स, endocytosis द्वारा सेल प्रवेश और रिक्तिका तक पहुँचने से पहले ई और ले के माध्यम से गुजरता है. इन छोटे सोने के कणों, तथापि, ईएम द्वारा देखा जा करने के लिए एक उचित आकार नहीं है. उन्हें दिखाई प्रस्तुत करना, उनके आकार सोने जांच 13-15 के आसपास चांदी या सोने का बयान करने के लिए नेतृत्व कि रासायनिक प्रतिक्रियाओं द्वारा विस्तारित किया जा सकता है. हम विकसित किया है और सफलतापूर्वक subcellular प्रदर्शन करने Tokuyasu पद्धति पर आधारित एक आईईएम दृष्टिकोण आवेदन किया हैस्थानीयकरण 8,16 अध्ययन करता है. इस विधि आकारिकी 8,17-24 का एक उत्कृष्ट संकल्प के साथ खमीर की तैयारी पर immunogold लेबलिंग प्रदर्शन की अनुमति देता है. हम भी 6 डिब्बों खमीर endosomal प्रणाली की nanogold लेबलिंग के साथ इस आईईएम प्रोटोकॉल के संयोजन एक प्रक्रिया की स्थापना की है. हम आकृति विज्ञान दोष 6,25 एक endosomal तस्करी के साथ म्यूटेंट endosomes के विभिन्न उपवर्गों की विशेषता और ultrastructurally की जांच की है कि इस दृष्टिकोण का उपयोग करना. इसके अलावा, हम इस nanogold लेबलिंग immunogold labelings अलग endosome subpopulations पर ब्याज की एक प्रोटीन का वितरण का पता लगाने के लिए संभावना प्रदान करने के साथ जोड़ा जा सकता है कि प्रदर्शन किया है. यहाँ हम सकारात्मक आरोप लगाया nanogold साथ खमीर endosomal प्रणाली की लेबलिंग व्यावहारिक रूप से किया जाता है कैसे प्रस्तुत करते हैं.

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Protocol

1. Spheroplast तैयारी

  1. प्रयोग के डिजाइन द्वारा निर्धारित उचित माध्यम के 10 एमएल में 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात खमीर सेते हैं.
  2. दिन के बाद, एक दीप्तिमापी का उपयोग कर 600 एनएम (600 आयुध डिपो) में संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के एक आयुध डिपो 0.2-0.4 से 600 के लिए एक ही संस्कृति के माध्यम में कोशिकाओं पतला और के डिजाइन जब तक एक घातीय वृद्धि चरण के लिए उन्हें विकसित प्रयोग एक अलग हालत की आवश्यकता है. संस्कृति एक आयुध डिपो 1-2 की 600 है जब कोशिकाओं घातीय चरण में हैं.
  3. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 5 मिनट के लिए 3500 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं के 10 आयुध डिपो के 600 समकक्ष लीजिए. Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  4. 100 मिमी पाइप (पीएच 9.6) के 5 एमएल, 10 मिमी dithiothreitol और 10 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर incubated में सेल गोली Resuspend.
  5. 5 मिनट के लिए 3500 XG पर centrifugation द्वारा फिर से कोशिकाओं को इकट्ठा. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  6. कोशिकाओं Resuspend मैंएन 1 sorbitol एम और अपघट्य एंजाइम की 5 मिलीग्राम से युक्त (प्रयोग के डिजाइन द्वारा निर्धारित), और कोमल 30 मिनट के लिए झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते माध्यम के 5 मिलीलीटर.
  7. स्फेरोप्लास्ट से मेल खाती है जो गोली अंश, इकट्ठा करने के लिए 5 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  8. बर्फ के ठंडे मीडिया के 960 μl में स्फेरोप्लास्ट Resuspend 1 sorbitol एम युक्त (मध्यम प्रयोग के डिजाइन द्वारा निर्धारित) और एक बर्फ के ठंडे 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में मिश्रण हस्तांतरण.

2. Nanogold तेज

  1. एक विंदुक का प्रयोग, धीरे पानी की 40 μl में resuspended सकारात्मक आरोप लगाया nanogold कणों की 4 nmol साथ spheroplast मिश्रण. मिश्रण के अंतिम मात्रा 1 मिलीग्राम का हो गया है.
  2. 15 मिनट के लिए बर्फ पर प्राप्त सेल निलंबन रखें.
  3. कमरे के तापमान पर निलंबन और स्थानांतरण और ई द्वारा nanogold internalization की अनुमति के लिए आवश्यक समय के लिए यह सेतेndocytosis.
    नोट: एक 15 मिनट तेज (जल्दी और देर endosomes) पूरे endosomal प्रणाली को चिह्नित करने की अनुमति होगी, जबकि एक 5 मिनट तेज मुख्यतः, endocytic vesicles और जल्दी endosomal डिब्बों की लेबलिंग को बढ़ावा मिलेगा. अब ऊष्मायन बार (अधिक से अधिक 30 मिनट) भी रिक्तिका लेबल करने की अनुमति होगी.
    नोट: पल्स-चेस लेबलिंग प्रयोगों इस विधि के साथ नहीं की जा सकती. ले के विश्लेषण के लिए लेबलिंग इसलिए, जब nanogold भी प्रधानमंत्री और inEE पर मिल जाएगा.

3. फिक्सेशन और सेक्शनिंग

  1. दोहरी ताकत लगानेवाला के 1 मिलीलीटर जोड़कर nanogold तेज रोको [4% paraformaldehyde (पीएफए), 0.1 एम PHEM बफर में 0.4% glutaraldehyde (जीए) (20 मिमी पाइप, 50 मिमी HEPES, पीएच 6.9, 20 मिमी EGTA, 4 मिमी MgCl 2)] सेल निलंबन को 1 sorbitol एम युक्त. कमरे के तापमान पर ट्यूब रखा.
  2. धीरे (इस में स्फेरोप्लास्ट रखने के लिए अनुमति देगा 30 मिनट के दौरान micocentrifuge ट्यूबों को मैन्युअल कई बार पलटनानिलंबन) और फिर 25 सेकंड के लिए 1,700 XG पर दो बार यह अपकेंद्रित्र.
  3. सतह पर तैरनेवाला discarding द्वारा और ताजा मानक शक्ति लगानेवाला के 1 मिलीलीटर (2% पीएफए, 0.1 एम PHEM बफर में 0.2% जीए) 1 sorbitol एम युक्त और एक धीरे घूर्णन पहिया पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते जोड़कर लगानेवाला बदलें.
  4. पहले 6 वर्णित के रूप में क्रायो सेक्शनिंग के लिए कोशिकाओं की प्रक्रिया. नोट: nanogold तेज और चांदी वृद्धि प्रक्रियाओं के लिए संकेत दिया प्रोटोकॉल में वर्णित आवधिक एसिड उपचार प्रदर्शन किया जाना नहीं गया है. आवधिक एसिड उपचार बेहतर सेल दीवार 26 permeabilize करने के लिए है, लेकिन इस संरचना स्फेरोप्लास्ट की पीढ़ी के दौरान समाप्त हो गया है.
  5. पहले 8 वर्णित के रूप में एक UCT ultramicrotome का उपयोग कर शुष्क हीरा चाकू से -120 डिग्री सेल्सियस पर 50 एनएम पतली cryosections कट और 50 निकल ग्रिड meshes लेपित Formvar कार्बन पर उन्हें जगह है.

Nanogold कण visua के लिए 4. रजत संवर्धनlization

नोट: प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करने के लिए प्रक्रिया मूल रूप से निर्माता ने संकेत दिया है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रैक्टिकल रूपांतरों, cryosections पर चांदी वृद्धि प्रक्रिया प्रभावी और विश्वसनीय बनाता है.

  1. फ्रीजर से चांदी वृद्धि किट निकालें और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर या नहाने के पानी में यह पिघलना. Thawed जब, (4.7 देखें) का उपयोग करें जब तक एक अंधेरे कमरे में रखा एक 24 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में किट जगह है.
  2. अंधेरे कमरे में हीटिंग थाली प्लेस और 24 डिग्री सेल्सियस के अंतिम तापमान तक गर्म
  3. सतह रक्षक, चमकदार पक्ष अप, और एक टेप के साथ सुरक्षित के साथ हीटिंग प्लेट के ऊपर कवर.
  4. Benchkote पर Parafilm प्लेस और अंधेरे में Parafilm किनारों को देखने के लिए सक्षम होने के लिए एक काला मार्कर के साथ किनारों निशान.
  5. हीटिंग थाली के तापमान पर नजर रखने के लिए Benchkote के शीर्ष पर एक थर्मामीटर टेप. धीरे - धीरे तापमान को समायोजित नहीं तो 24 डिग्री सेल्सियस
  6. पीएलएदोहरा आसुत जल और अंदर चांदी वृद्धि किट के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब CE.
  7. दोहरा आसुत जल के साथ छोटे पेट्री डिश भरें, 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म पानी में ग्रिड, जगह 30 मिनट के लिए, नीचे की ओर नमूना.
  8. इस 4.7 कदम एक बार और दोहराएँ.
  9. भंडारण बॉक्स में ग्रिड स्थानांतरण और अंधेरे कमरे में ले आओ.
  10. हीटिंग प्लेट पर तय किया गया है कि Parafilm पर रखा 24 डिग्री सेल्सियस पर दोहरा आसुत जल के कई बूँदें पर (नीचे नमूना पक्ष के साथ) उन्हें पारित करके फिर से ग्रिड कुल्ला.
  11. 9 अतिरिक्त दोहरा आसुत जल बूंदों चांदी वृद्धि की प्रतिक्रिया के बाद धोने के लिए, parafilm पर तैयार कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें.
  12. प्रकाश बंद करें और सभी रोशनी बंद कर रहे हैं सुनिश्चित करें. लाल बत्ती पर मुड़ें.
  13. 24 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से चांदी वृद्धि किट के ए और बी समाधान बाहर ले जाओ.
  14. पहले एक समाधान के 6 बूँदें और एक 1.5 मीटर में बी समाधान की तो 6 बूँदें रखोएल microcentrifuge ट्यूब, और बुलबुले बनाने के लिए परहेज एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ अच्छी तरह से मिश्रण. समाधान काफी मोटी है और इसे मैन्युअल अंत में इसे संक्षेप में vortexing से पहले एक विंदुक के साथ मिश्रित किया जाना है.
  15. वापस 24 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ए और बी समाधान रखो और सी समाधान बाहर ले.
  16. ए / बी मिश्रण करने के लिए सी समाधान के 6 बूँदें जोड़ें. फिर एक पाश्चर विंदुक के साथ पहले फिर मिश्रण है और फिर vortexing द्वारा, बुलबुले बनाने से बचें.
  17. Parafilm पर (~ 20 μl / ड्रॉप) बूंदों रखकर तुरंत अंतिम मिश्रण का प्रयोग करें.
  18. एक स्वच्छ, विरोधी चुंबकीय चिमटी के साथ, प्राप्त किया जा करने के लिए कामना की वृद्धि (सोने के कणों की अर्थात्. आकार) के आधार पर 6 to15 मिनट के लिए मिश्रण (जैसे., चांदी बढ़ाने प्रतिक्रिया) पर ग्रिड जगह है.
  19. मिश्रण से ग्रिड निकालें और washes के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर चला जाता है दोहरा आसुत जल के शीर्ष पर उनके पास. पहला, तेजी से उत्तराधिकार 6 बूंदों में इस्तेमाल करते हैं और तब ड्रॉप प्रति 7 मिनट ऊष्मायन समय के साथ 3 बूँदें, रोशनी पर बदल से पहले.
  20. अगला कदम है, एक EM जांच के लिए परिणाम कल्पना करने के क्रम में इम्युनो सोने लेबलिंग या झिल्ली धुंधला 27 या तो के लिए आगे बढ़ें.

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Representative Results

प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार, खमीर endosome प्रणाली की आकृति विज्ञान प्रसारण ईएम द्वारा उपयोग किया जा सकता है. चित्रा 1 पर पहुंच गया है और इसलिए nanogold साथ चिह्नित किया गया है कि endosomal डिब्बों के विभिन्न प्रकार से पता चलता है. चांदी बढ़ाया nanogold स्पष्ट रूप से इलेक्ट्रॉन घने कणों के रूप में देखा जा सकता है. चांदी वृद्धि प्रतिक्रिया के लिए स्थापित इष्टतम सेटिंग्स खमीर सेल के फैटी के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है जो 5 और 15 एनएम, के बीच एक समरूप आकार रेंज में सोने के कणों होने की अनुमति देता है. प्लाज्मा झिल्ली के साथ ही ले, प्रस्तुत मामले multivesicular निकायों में, तेज की कम से कम 30 मिनट (चित्रा के बाद इन कणों से लग रहे हैं, जबकि जल्दी endosomal डिब्बों 24 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट ऊष्मायन (चित्रा 1 ए) के बाद nanogold के लिए सुलभ हैं 1 बी). nanogold / चांदी वृद्धि प्रोटोकॉल के साथ हमारे आईईएम प्रक्रिया 8 के संयोजन का संकल्प शक्ति संयुक्त राष्ट्र है यहाँ वर्णितmultivesicular निकायों (चित्रा 1 बी) के आंतरिक पुटिका विशेष रूप से दिखाया गया organelles की आकारिकी के संरक्षण और गुणवत्ता, द्वारा derlined.

चित्रा 1
Nanogold लेबल खमीर endosomal डिब्बों की चित्रा 1. Ultrastructural विश्लेषण. प्रस्तुत प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में स्फेरोप्लास्ट जंगली प्रकार SEY6210 तनाव (MATalpha ura3 -52 leu2-3, 112 HIS3-Δ200 trp1-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 मेल लड़की) से प्राप्त किया गया. स्फेरोप्लास्ट तो 10 (पैनल ए) या 30 मिनट (पैनल बी) के लिए कमरे के तापमान को हस्तांतरित किया जा रहा से पहले 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सकारात्मक आरोप लगाया nanogold के 4 nmol साथ incubated रहे थे. कोशिकाओं बाद में, तय वर्णित के रूप में तैयार करने पर चांदी वृद्धि की प्रतिक्रिया से बाहर ले जाने से पहले 8 cryosectioning के लिए प्रोसेस किया गयाप्रस्तुत प्रोटोकॉल में. खमीर endosomal प्रणाली के ए अर्ली डिब्बों. प्लाज्मा झिल्ली के अलावा, nanogold (5 मिनट) की एक छोटी तेज एकल पुटिका (तीर), संभवतः endocytic पुटिका, और ट्यूबलर संरचना (तीर) का, बहुत संभावना जल्दी endosomes की लेबलिंग की अनुमति देता है. बी खमीर multivesicular शरीर फैटी. एक 30 मिनट ऊष्मायन ले / multivesicular निकायों (तारक) की लेबलिंग, लेकिन यह भी जल्दी endosomes की ओर जाता है और भाग रिक्तिकाएं में () नहीं दिखाया. एम, mitochondria; एन, नाभिक; PM, प्लाज्मा झिल्ली; वी, रिक्तिका. बार = 200 एनएम.

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Discussion

इम्यूनो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इन प्रोटीनों रहते हैं जहां वाहक और organelles की ultrastructural संकल्प के साथ प्रोटीन के स्थानीयकरण के संयोजन की अनुमति देता है कि एक तकनीक है. इसके डिब्बों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में ही बीच में रोकना संरचनाओं प्रकट क्योंकि खमीर endosomal प्रणाली का अध्ययन करने पर यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. यह अलग करने के लिए इसलिए मुश्किल है. इस कारण के लिए उन्हें द्वारा detectable और एक समय पर निर्भर ढंग से endocytic मार्ग में प्रवेश करने के लिए महत्वपूर्ण है एक जांच का उपयोग विशेष रूप से अलग endosomes निशान. जांच के इस प्रकार endocytosis 6 की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए मूल्यवान है और यह antisera का पता लगाने के प्रोटीन मार्कर की कमी के लिए एक विकल्प है.

यहाँ वर्णित प्रक्रिया सकारात्मक endosomal डिब्बों लेबल करने के लिए एक जांच के रूप में nanogold आरोप लगाया शोषण. Cryosectioning विशेष उपकरण और कौशल की आवश्यकता है, प्रस्तुत प्रोटोकॉल तकनीकी रूप से आसान है और फिर से नहीं होता हैविशेष मशीनों गायकगण. इसलिए यह अपने अनुसंधान के लिए इसका इस्तेमाल करना चाहते हैं कि किसी भी प्रयोगशाला के लिए सुलभ है. हालांकि, कुछ सावधानियों चांदी वृद्धि प्रतिक्रिया यानी इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण कदम है, के दौरान लिया जाना है. यह प्रतिक्रिया प्रकाश में बेहद संवेदनशील है और इसलिए कमरे में (लाल एक को छोड़कर) सभी लाइट बंद कर दिया और / या कवर किया जाना है. सभी रासायनिक प्रतिक्रियाओं के रूप में, चांदी वृद्धि की प्रतिक्रिया की गति तापमान से प्रभावित है. एक ही मापदंड का उपयोग सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए, सभी समाधान और उपकरणों सावधानी से 24 डिग्री सेल्सियस पर preincubated किया जाना है यह सही इस प्रतिक्रिया को नियमित प्रदर्शन किया जाएगा, जहां कमरे में चांदी बढ़ाने के लिए ऊष्मायन समय स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. Nanogold का विस्तार नेत्रहीन ईएम से सोने के कण का पता लगाने के लिए सक्षम होने के लिए काफी लंबे समय हो गया है और रूपात्मक विवरण शामिल किया जा सकता है, जो बड़े आकार के कणों की पीढ़ी से बचने के लिए काफी कम हो गया है. इस कारण से, यह दिल से प्रयोगशाला में इस तकनीक की स्थापना जब एक पायलट प्रयोग करने का सुझाव दिया है. इस परीक्षण के दौरान nanogold कणों प्रतिक्रिया के लिए इष्टतम समय निर्धारित करने के लिए अलग अलग समय के लिए बढ़ाया चांदी रहना होगा. ध्यान से, प्राप्त कणों के आयामों के समरूप आकार की नहीं हो सकता है; वहाँ हमेशा कुछ विविधता हो सकता है लेकिन इस 5 के बीच एक सीमा में, संभव के रूप में कम से कम रखा जाना चाहिए होगा - 15 एनएम. Nanogold तेज प्रक्रिया इम्युनो सोने labelings के साथ संयुक्त हो जाएगा अगर यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. परिणामों की व्याख्या करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए एक और पहलू पल्स चेस लेबलिंग प्रयोगों इस विधि के साथ संभव नहीं हो रहा है. नतीजतन प्रधानमंत्री और ई भी ले कल्पना करने के उद्देश्य से एक nanogold तेज में लेबल किया जाएगा.

यह यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अतिरिक्त अनुप्रयोगों को देखने के लिए भी संभव है. एक विकल्प फ्लोरोसेंट microscop साथ nanogold तेज की ईएम डेटा सहसंबंधी हो सकता हैवाई. FM4-64 बजे और, रिक्तिका की राह पर करने के लिए एसोसिएट्स, एक समय पर निर्भर ढंग से endosomal डिब्बों से गुजर रहा है कि एक lipophilic फ्लोरोसेंट मार्कर डाई है. FM4-64 और nanogold दोनों लिपिड के सहयोग से कक्ष में प्रवेश और वे शायद बहुत समान internalization कैनेटीक्स 28,29 है. नतीजतन दोनों रंगों correlative प्रकाश उन्हें में एक ही समय में इस्तेमाल किया जा सकता है एक साथ गतिशील पता लगाने के लिए दृष्टिकोण और endocytic compartments.The के फैटी विधि भी endocytic प्रणाली के माध्यम से 30 रिसेप्टर की मध्यस्थता की तस्करी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रस्तुत किया. Nanogold की Monomaleido और मोनो sulfo-N-हाइड्रोक्सी succinimido डेरिवेटिव covalently प्रोटीन 6 के लिए इन कणों बाध्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए एक या α-कारक के साथ पार से जोड़ने की उनकी विशिष्ट ग्राहकों द्वारा इन दो pheromones के endocytosis निम्नलिखित अनुमति दे सकते हैं.

सब एक साथ, वर्णित प्रोटोकॉल कल्पना करने के लिए अनुमति देता हैifically ईएम द्वारा detectable बनाया जा सकता है जो एक endocytosed जांच, का उपयोग खमीर endosomal प्रणाली की organelles लेबल. इस प्रयोगात्मक उपकरण ultrastructural स्तर पर खमीर endosomal डिब्बों की जीवजनन और संगठन का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है.

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Acknowledgements

लेखकों चित्रा की तैयारी के साथ सहायता के लिए रेने Scriwanek धन्यवाद. एफआर ALW खुले कार्यक्रम (821.02.017 और 822.02.014), DFG-NWO सहयोग (DN82-303) और ZonMW VICI (016.130.606) अनुदान, इको (700.59.003) द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) Merck, Darmstadt, Germany 1,102,200,250
HEPES Merck, Darmstadt, Germany 391,340
EGTA Sigma, St louis, MO E4378
MgCl2·6H2O Merck, Darmstadt, Germany 1,058,330,250
DL-Dithiothreitol Sigma, St louis, MO D0632
Sorbitol Sigma, St louis, MO S1876
Positively charged Nanogold Nanoprobes, Yaphank, NY 2022 store at -20 °C
HQ-silver™ enhancement kit Nanoprobes, Yaphank, NY 2012 store at -20 °C
Paraformaldehyde (PFA) Sigma, St louis, MO 441244
Glutaraldehyde 8% EM grade Polyscience, Inc., Warrington, PA 216 store at -20 °C
Lytic enzyme MP Biomedicals, Santa Ana, CA 153526 store at -20 °C
Parafilm M Sigma, St louis, MO P7793
50 meshes nickel grids  Agar Scientific, Stansted, United Kingdom G209N
Cryo-immuno diamond knife 35° Diatome AG, Biel, Switzerland N.A.
UCT ultramicrotome  Leica, Solms, Germany N.A.
Formvar 15/95 resine Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15800
50 meshes nickel grids  Agar Scientific, Stansted, United Kingdom AGG2050N
Parafilm Sigma, St louis, MO P7793
Grids storage box Leica, Solms, Germany 162-50
Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish Corning, Corning, NY 351029
Pasteur capillary pipettes 150 mm Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands 10216234
1.5 ml microcentrifuge  Sarstedt, Nümbrecht, Germany 72690001
50 ml tube Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands 210296
Benchkote surface protector Whatman, Maidstone, United Kingdom  1159201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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