A Guide to
1Institute of Neuroscience, University of Oregon

Published 11/07/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Moore, A. K., Wehr, M. A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons. J. Vis. Exp. (93), e51757, doi:10.3791/51757 (2014).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En stor utfordring i nevrofysiologi har vært å karakterisere responsen egenskaper og funksjon av de mange hemmende celletyper i hjernebarken. Vi her dele vår strategi for å oppnå stabile, godt isolerte enkelt enhet opptak fra identifiserte hemmende interneurons i bedøvet mus cortex ved hjelp av en metode utviklet av Lima og kolleger en. Innspillingen er utført på mus som uttrykker Channelrhodopsin-2 (ChR2) i spesifikke nevronale subpopulasjoner. Medlemmer av befolkningen er identifisert ved sitt svar på et kort glimt av blått lys. Denne teknikken - kalt "PINP", eller Photostimulation-assistert Identifikasjon av neuronpopulasjoner - kan gjennomføres med standard ekstracellulære opptaksutstyr. Det kan tjene som et billig og tilgjengelig alternativ til kalsium avbildning eller visuelt guidet patching, i den hensikt å målrette ekstracellulære opptak til genetisk-identifiserte celler. Here vi tilby et sett med retningslinjer for å optimalisere metoden i daglig praksis. Vi raffinert vår strategi spesielt for målretting parvalbumin-positive (PV +) celler, men har funnet ut at det fungerer for andre Interneuron typer også, slik som somatostatin-uttrykke (SOM +) og calretinin-uttrykke (CR +) interneuroner.

Protocol

MERK: Følgende protokollen er i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer som er godkjent av University of Oregon Animal Care og bruk komité.

1. Akutt kirurgi

  1. Bedøve dyret med en ketamin-medetomidin cocktail, via intraperitoneal (ip) injeksjon (tabell 1).
    MERK: Musene som brukes i disse forsøkene er generert ved å krysse en grobunn avhengig ChR2-EYFP transgen line10 å Interneuron driver linjer (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +, Cr-iCre12, CR +). Viral levering av ChR2 eller beslektede opsins bør fungere like bra, forutsatt lignende uttrykk nivåer oppnås.
  2. Før du begynner kirurgi, sikre at dyr utstillinger Ingen respons på en skånsom tå klype. Re-administrere bedøvelsesmidler gjennom hele forsøket som er nødvendig for å opprettholde denne dybden av anestesi. Hvis du bruker injiserbare bedøvelse, eventuelt implantere en ip kateter for vedlikeholds injeksjoner.
  3. Holde dyret hydrert med saltvann eller Ringers løsning gjennom hele forsøket (ca. 3 ml / kg / time), for eksempel ved hjelp av en passende fortynnet bedøvelsesmiddel vedlikeholds cocktail for injeksjoner (tabell 1).
  4. Plasser dyret i en stereotaxic eller annet head-holding apparat. Sørg for at hodeskallen er godt sikret. Dette er viktig for å opprettholde stabile encellete innspillinger.
  5. Påfør opthalamic salve til øynene for å hindre tørrhet. Opprettholde kroppstemperaturen på 36,5 til 37 ° C.
  6. Utfør en cisternal avløp for ytterligere opptak stabilitet. Ved hjelp av en skalpell blad, fjerne vev fra bakre ansiktet av skallen for å eksponere cisterna magna. Lag et lite hakk i dura å drenere cerebrospinalvæsken. Bruk bare helt i spissen av bladet, og unngå kontakt med lillehjernen eller hjernestammen.
  7. Ved hjelp av skalpell, utføre en liten kraniotomi (~ 2 mm 2) over kortikale område av interesse (for auditivcortex, omtrent -2,3 mm bregma av posterior, 4,5 mm lateralt for midtlinjen).
  8. Fjern dura og dekke den eksponerte cortex med et lag av varm agarose 0,5 til 1 mm tykke (1,5% agarose i saltløsning, 0,9% NaCl; anvendelse ved ~ 37 ° C). Hold agarose fuktig gjennom hele eksperimentet ved periodisk å påføre flere dråper av saltløsning.

2. Opptak Set-up

  1. Forbered en wolframelektrode (7-14 Megohm, 127 mikrometer i diameter, 12 ° konisk spiss, epoxy-belagt). Snabblim elektroden til en glass kapillarrør og tilsett krympeslange for grep (figur 1).
  2. Monter elektrode på en motorisert (eller hydraulisk) micromanipulator, satt til å reise ortogonal til kortikale overflaten. Skyv en wire bakken under huden, mot skallen. Unngå kontakt med musklene på siden av hodet og baksiden av halsen som de kan generere elektromyografiske gjenstander.
  3. Forsterke elektrisk signal ved hjelp av et ekstracellulært ampli fi eh egnet for single-enhet opptak, gjerne utstyrt med en impedans check-modus. Overvåke pågående spiking aktivitet (band pass 300 - 5000 Hz) med to oscilloskop og et sett med høyttalere. Her er det registrert data digitalisert kontinuerlig med en samplingsfrekvens på 10 kHz; spikes er hentet offline.
  4. Advance elektroden gjennom agarose inntil spissen kommer til overflaten av hjernebarken. Observere dette trinnet gjennom et mikroskop. "Zero" denne posisjonen på micromanipulator.
  5. For best å tilnærme dybden av opptaket, visuelt bekrefte at elektrodespissen kommer ut av kortikale overflate i en dybde på null når uttak av elektroden ved enden av en gjennomtrengning.
    MERK: En uoverensstemmelse mellom manipulator lesing og den observerte elektrodeposisjonen indikerer at den har drevet i forhold til vevet. Dette kan være forårsaket av ustabiliteten av hjernen eller dyr, eller manipulator glidning.
    1. Som en ekstra sjekk for å sikre atDette nullinnstillingspunkt svarer til overflaten av hjernebarken, overvåke stimulus-fremkalt feltpotensialer mens fremme gjennom de første flere hundre mikrometer vev. Når overvåking feltpotensialer, senke den nedre band-pass filter cutoff av ekstracellulære forsterkeren til 10 Hz. Bekrefte at polariteten av den lokale feltpotensial reverserer rundt en dybde på ~ 100 um, sjikt nær I / II grensen 13. Dette er en pålitelig referansepunkt for auditiv cortex, men den kan variere for de forskjellige hjernebark.
  6. Montere en optisk fiber er koplet til en blå lyskilde (figur 2) på en manuell mikromanipulator. Ved hjelp av mikroskop, posisjonere spissen av fiberen så nær overflaten av agarose som mulig. Sentrer strålen der elektroden skal gå inn i vevet.
  7. Regulering av utgangen fra lyskilden med en styreenhet er i stand til å levere en TTL (transistor-transistor-logikk) puls tog av bestemt bredde og duration- f.eks, en Arduino (figur 3), en datamaskin I / O-kort (som vist), eller et kommersielt tilgjengelig pulsgenerator.
    1. Overvåke signalet på begge oscilloskop.
  8. Mål total lys kraft (mW) på spissen av den optiske fiber ved hjelp av en kraftmåler. Bruk denne verdi å beregne irradians (mW / mm 2) ved å dividere med den tverrsnittsareal av fiberkjernen. Begynn med en intensitetsverdi i området på 10 - 15 mW / mm 2 og juster nedad om nødvendig, inntil gjenstander er eliminert.
  9. Sjekk for lette gjenstander med elektroden i agarose, klar til å gå inn i vevet. Starte søket pulstog (f.eks 30 ms lyspulser, 500 msek interstimulus intervall (ISI)).
    1. Eliminer transiente lette gjenstander (figur 4) ved å omplassere den optiske fiber i forhold til elektroden for å endre vinkelen på innfallende lys. Hvis gjenstander vedvarer, kan du prøve å redusere lyset makt. I the sjeldent tilfelle at gjenstander ikke kan være helt eliminert (kun minimert), forlenge varigheten av søke puls. Dette kan hjelpe til å identifisere ekte nerve pigger.

3. Rett PINP-in '

  1. Advance elektroden langsomt gjennom hjernen med en hastighet på omtrent 1 um / sek. Bruk en oscilloskop til å overvåke pågående aktivitet. På den andre, utløse av laser pulser.
  2. Lytt etter svak "hash" av lys-fremkalt pigger på audio skjerm, noe som indikerer at elektroden nærmer seg et ChR2 + celle og kan ofte oppleves i god tid før det elektriske signal er tydelig på oscilloskop. Redusere frekvensen av forhånd.
    MERK: Hvis cellen ligger midt i veien for elektroden, vil lyset-fremkalt aktivitet vokse seg større (og høyere). Etter hvert som elektroden nærmer seg en enkelt interneuron, vil hash løse opp i små, men veldefinerte pigger av uniform størrelse og form.
  3. Så snart liGHT-fremkalt toppene er store nok til å utløse individuelt på oscilloskop, begynne å gjøre det. Juster skalering på den horisontale akse for å observere den nøyaktige formen til piggen bølgeform.
  4. Stoppe og vente på vevet til å bosette seg. Motstå fristelsen til å bevege elektroden nærmere cellen. Dette trinnet er kritisk for et stabilt opptak. Dersom det etter flere minutter signal-til-støy-forhold har ikke forbedret - det vil si, at vevet har lagt seg, men det har ikke ført til cellen noen nærmere spissen av elektroden - 5 um forhånd videre og vente på nytt.
    1. Gjenta denne prosessen til enten toppen eller bunnen av aksjonspotensialet kan bli pålitelig tatt med et spenningsterskel satt godt over støygulvet (f.eks +/- 300 uV eller mer).
      MERK: Det er liten risiko for falske positiver eller tvetydighet når PINPing hemmende interneurons. De fleste celler kan enkelt følge et tog av pulser med varighet på 30 ms og inter-pulse intervallet 500 msek, eller raskere, med en pålitelig første spike ventetid på 2-5 msek (figur 5). Flertallet av PV + celler, i særdeleshet, kan opprettholde avfyring for en full 1 sek (figur 6). Fordi disse er hemmende nerveceller, er disynaptic (indirekte) aktivering ikke et stort problem.
  5. Mens du tar opp, overvåke pågående aktivitet på den første oscilloskop. Holde et tett øye på størrelsen og formen på toppene ved hjelp av andre oscilloskop. Legg merke til kvaliteten på lyden på høyttaleren.
    1. Lytt oppmerksomt for brå endringer, noe som tilsier at cellen er enten tegning for nær elektroden (der det risikerer å bli spiddet eller skadet), eller er drivende bort. Hvis piggene blir store og forvrengt, ut igjen; hvis de vokser mindre, fremme elektroden. Bevege seg sakte i to mikrometer trinn.
    2. Bekrefte kvaliteten på opptaket post-hoc ved over alle pigg bølgeformer, justert til topp eller trau. Varier spennings threshold. Over et bredt spekter av terskelverdier, er det bare skal være en konsekvent pigg form av uniform høyde (figur 5a).
  6. Hvis du på noe punkt signalet blir forurenset med pigger fra et nærliggende nevron, gå videre. Avansere sakte, på off-sjanse for at elektroden vil passere utenfor rekkevidde av nabocellen, men er fortsatt innenfor rekkevidde av målet nervecellen. (Dette er vanligvis mislykket.)
  7. Bevege elektroden gjennom hele dybden av cortex (900 + um) i hvert gjennomtrengning. Hvis ingen lys-responsive nevroner er oppstått etter mange gjennomføringer eller omvendt, blir opptakene rutinemessig forurenset med pigger fra nabo ChR2- celler, prøv en ny elektrode.
    MERK: Selv innenfor et enkelt parti, kan geometri impedansen og tips av individuelle elektroder variere betydelig. Begge faktorer bidrar til den effektive "lytter radius" av elektroden, som må være stor nok til å detektere lys-fremkalt pigger while søking, men begrenset nok til at spille inn en singel interneuron i isolasjon.
  8. Teste impedansen av elektroder som ønsket. For å unngå skade på vev, gjør dette med spissen av elektroden i den øvre delen av sjiktet agarose, godt utenfor hjernen. Innenfor området 7-14 Megohm, er den eksakte impedans ikke en sikker prediktor for ytelse, eller yield, for dette programmet. Når det er sagt, det er en rimelig proxy for å lytte radius: lavere impedans elektroder plukke opp flere enheter; høyere impedans, færre.
  9. Ved slutten av forsøket, ved å avlive dyret institusjons-godkjente midler, slik som anestetikum dosering, eller cervikal dislokasjon under et dypt planet av anestesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi her dele vår strategi for å skaffe enkelt enhet opptak fra genetisk-klassifiserte hemmende interneurons i bedøvet mus cortex, ved hjelp av en optogenetic metode utviklet av Lima et al. 1. Tabell 1 detaljene den foreslåtte bedøvelse cocktail, Ketamin-Medetomidin-acepromazin (" KMA "). Figur 1 viser en wolfram microelectrode, forberedt for opptak. Figur 2 inneholder et koplingsskjema for en enkel LED-styreenhet. Figur 3 inneholder konfigurasjonen og koden for gating lysmengde med en Arduino mikrokontroller. Figur 4 viser et eksempel på lys-indusert elektriske gjenstander omtalt i protokollen. Artifacts er tidvis møtt (venstre panel), men lett korrigert (høyre panel). Figur 5 viser eksempel opptak fra tre typer optisk identifiserte interneuroner (PV +, CR +, og SOM +). Den venstre panel viser rå spennings spor og justert bølgeformer, representant for den type signal-til-støy-forhold man kan forvente å oppnå med denne strategien. Piggene på en pålitelig måte fanges med en fast spenningsterskel av flere hundre mikrovolt. En raster plot (høyre panel) viser kort ventetid og pålitelighet av lys-fremkalt respons, som gir mulighet for entydig identifikasjon av ChR2-positive interneuroner. Figur 6 viser spenning spor fra tre PV + interneuroner, svarer til en 1 sek lys puls. Flertallet av PV + celler kan opprettholde høy frekvens for avfyring hundre millisekunder, noe som gjør dem spesielt lett å identifisere.

Figur 1
Figur 1. Forberede en elektrode.   (A) Diagram av en forberedt elektrode. Elektroden er Affixed til en glass kapillarrør ved hjelp av to små dråper av super lim og en minimal mengde av akselerator (slik som Zap-It). Krympeslange er lagt for grep, ved hjelp av svært lav varme. Elektroder vanligvis leveres med en kontaktpinne pre-festet. (B) Fotografi av en forberedt wolfram microelectrode montert i en elektrodeholder.

Figur 2
Figur 2. Koblingsskjema for en LED styreenhet. En enkel og rimelig krets for lys levering. En super-LED lys (475 nm) er festet til et varmeavløp og er koplet til den andre enden av en fiberoptisk kabel (800 um diameter). Utgangen av LED er inngjerdet med en TTL puls. Styreenheten har en spenning-mode strømforsyning for justerbar lysstyrke. 2K POT: potensiometer for å regulere lysintensiteten. P / S: DC strøm supp ly (f.eks laptop lader). TIPS 122: Darlington transistor. 4N35: Optisk isolator. Delene som er oppført her koster <$ 10.

Figur 3
Figur 3. Arduino kode og konfigurasjon. En TTL-puls-tog for gating lyseffekt kan genereres ved hjelp av en Arduino mikrokontroller. Programmet angir en pulsvarighet og ISI for en looping pulstog. Instruksjoner for hvordan du legger programmet inn i styret kan bli funnet på Arduino "Komme i gang" -siden ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

igur 4 "fo: content-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 51757 / 51757fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. Figur 4. Lys artefakt Metal elektroder er utsatt for lette gjenstander, til stede ved starten og offset av pulser (venstre panel, filtrert signal, 300 - 5000 Hz). De kan vanligvis bli fullstendig eliminert (høyre panel) ved å reposisjonere den optiske fiber i forhold til elektroden for å endre vinkelen på innfallende lys, og / eller redusere lyseffekten.

Figur 5
Figur 5. Eksempel celler. (A) Typisk eksempel opptak fra optisk identifiserte interneuroner, PV + (lilla), CR + (grønn), SOM + (rød). Cellene reagerer på søke pulstog (pulsvarighet 30 ms, ISI 500 ms) med en pålitelig utbrudd av toppene. Panelet til høyre viser 100 trough-justert pigger og. gjennomsnittlig interpolert bølgeform (10x oversamplede fra en samplingsfrekvens på 10 kHz) (B) Raster tomter for de samme filene viser kort ventetid (~ 2-5 msek). og konsekvent timing av lys-fremkalt spikes (C) Mean og standardavvik på første-spike ventetider (5 - 10 pulser) for et utvalg av 44 PV + interneuroner (gjennomsnittlig gjennomsnitt og standardavvik: 3,4 +/- 2,6 msek). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Eksempler på vedvarende responser Man kan være spesielt trygg på å identifisere PV + interneuroner som de fleste av dem kan opprettholde høy frekvens avfyring for hundrevis av millisekunder -. Minner om deres svar på nåværendeinjeksjon in vitro 14. Tre ChR2 / PV-celler som responderte til 1 sek lyspulser: to som skyter med jevne gjennom hele varigheten av pulsen, og en uvanlig eksempel på en celle som ikke gjør det (<10% av påtreffes celler).

Tabell 1. Ketamin-Medetomidin-Acepromazin ("KMA"). Knock-down og vedlikeholdsdose for en voksen mus, fortynnet for å opprettholde hydratiseringen. Cocktail er re-administrert hver 40 - 90 minutter, etter behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv PINP er konseptuelt grei, kan det være utfordrende i praksis. En viktig faktor for suksess er valg av elektroden. Den elektriske lytte radius er den kritiske parameter. Det må være tilstrekkelig stor til å oppdage lys-fremkalt pigger når spissen er fortsatt et stykke unna en ChR2 + celle, slik at man kan justere hastigheten på forhånd tilsvarende. Samtidig må det være begrenset nok til å muliggjøre god enkeltenhet isolasjon. Det vil si at elektroden må ikke også plukke opp toppene fra nabo ChR2- enheter. Finne den rette balansen i form av å lytte radius vil være en utfordring for enhver målrettet celletype, men det er spesielt sant for hemmende interneurons, som er sparsom, liten, og ofte finnes i umiddelbar nærhet til pyramidale celler, som som har forholdsvis store ekstracellulære spikes. Selv bruker strategier som foreslås her, er forventet avkastning ikke høy. Vår typiske utbyttet var 0-2 PV + nevroner / dyr, gitt vår criteria av utmerket single-enhet isolasjon og innspillinger som varer over en halv time.

Når PINPing hemmende nerveceller, er disynaptic (indirekte) aktivering ikke et stort problem, fordi hemmende nerveceller er relativt usannsynlig å indirekte aktivere postsynaptiske celler. For PINPing eksitatoriske nevroner, er disynaptic aktivering felles; mange nevroner som ild i respons til lys ikke uttrykke ChR2, men heller får kraftig synaptic eksitasjon fra de som gjør det. Strategier for diskriminerende directly- fra indirekte-aktiverte nevroner blir diskutert i detalj i Lima et al. 1.

Elektrode Betraktninger

Vi utforsket systematisk en rekke elektroder og opptaksteknikker: glass patch pipetter med tips i forskjellige størrelser, tungsten microelectrodes varierende i impedans og tips geometri, og flerkanals arrays (f.eks tetrodes). Kantete, høy impedans wolfram microelectrodes(Som foreslått her) ga langt, den beste avkastningen. En diskusjon av problemene som oppstår med hver av disse teknikkene følger.

Ved hjelp av lav impedans tetrode arrays og flerkanals onder, vi rutinemessig oppdaget lys-fremkalt pigger; imidlertid var de sjelden store nok til å sortere en pålitelig måte. Med andre ord, signal-til-støy-forholdet (SNR) var utilfredsstillende. Vi noen ganger få gode opptak med tetrodes, men den asymptotiske utbyttet var høyere med enkle wolfram mikroelektroder, og kvaliteten på opptakene var mye bedre. Tetrode tips er relativt sløv også, noe som begrenset det totale antall gjennomføringer mulige per dyr. De problemene vi møtte med flerkanals prober ble sannsynligvis forsterket ved bruk av brede overflaten belysning. I motsetning til målrettet, lavt strømforbruk stimulering fra en implantert fiber, vil overflaten belysning forårsake synkron avfyring i ChR2 + nevroner utenfor registreringsstedet, som fører til overlagrede pigg bølgeformersom er mer vanskelig å sortere.

Glass patch elektroder, som de som brukes for standard løse celle-festet innspillinger, ble heller ikke godt egnet til oppgaven, men av forskjellige grunner. Lav motstand (<5 Megohm) patch elektroder er sterkt forspent mot pyramideceller, noe som gjør det vanskelig å målrette inhibitoriske interneuroner. Selv om dette kan rettes til en viss grad ved å bruke høyere motstand (mindre tip) elektroder, jo større problem med patch elektroder er deres ekstremt begrenset lytting radius. Selv om celle-festet patch opptak gir en meget høy SNR, kan lys-responsive celler ikke bli oppdaget utenfor celle-festet modus. Strategien med patch elektroder er uunngåelig, tilfeldig og sekvensielt få celle-festet innspillinger, svært få av dem er ChR2-uttrykker hemmende interneurons.

Med høy impedans wolfram elektroder man kanbåde oppdage lys-fremkalt pigger på avstand, og oppnå god single-unit isolasjon. Geometrien av spissen er trolig den viktigste faktoren. Vi prøvde wolfram elektroder fra to produsenter, med impedanser som spenner 2-14 Megohm og tippe vinkler 5-12 °. Vi fant at 12 ° tippevinkler var overlegen, men at den nøyaktige impedans var mindre viktig, innenfor området fra 7 - 14 Megohm. Vi fant ut at glassbelagt elektroder var mer utsatt for lette gjenstander sammenlignet med epoxy belagte elektroder, så vi anbefaler det siste. Vi gjorde ikke forsøk på å gjøre våre egne tilpassede wolfram elektroder. Som med alle typer elektrode, vanlige moduser av svikt er å miste isolasjon eller skade en nervecelle. Ulike tips parametere synes ikke å ha mye innflytelse på dette. Snarere venter på vevet til å bosette er mer viktig faktor i å opprettholde høy kvalitet på opptakene.

Lys Levering

Fordi lyset er bare en bruktSA betyr å identifisere ChR2-positive celler - i stedet for å regulere sin produksjon på en bestemt måte - utvalget av brukbare intensiteter for dette eksperimentet er bredt. En nedre grense er bestemt av det faktum at intensiteten må være tilstrekkelig til å aktivere ChR2-positive celler ved den maksimale dybde av cellene av interesse. Vi fant at tippe irradianser> 5 mW / mm 2 (målt ved 470 nm) var nok til å lokke fram robuste svar fra PV + celler i dyp Layer 6. Irradians på bestemte dyp i hjernen kan estimeres ved hjelp av en kalkulator basert på direkte målinger i pattedyr hjernevev (f.eks http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php ), men vi anbefaler på det sterkeste å bestemme minimum for dine egne eksperimenter empirisk, ved hjelp av en lav impedans microelectrode (1 - 3 Megohm, for multiunit aktivitet). En øvre grense er bestemt av det faktum at høye intensivesities kan føre til lette gjenstander, noe som kan komplisere påvisning av fremkalt pigger. I transgene dyr, kan høye intensiteter også forårsake elektromyografiske gjenstander ved å aktivere ChR2 i utsatt PV + muskel på halsen og hodet.

I bygge vårt eget lysutleveringssystem, fant vi at en kopling en LED til en optisk fiber er i siste instans mer praktisk enn å plassere LED direkte over hjernen. Sistnevnte er en svært effektiv måte å levere lys, men har noen praktiske ulemper. Straumen gjennom enheten produserer elektriske gjenstander som må være skjermet, og LED genererer betydelig varme som må ledes bort med en stor kjøleribbe. Videre lette gjenstander (både fotovoltaiske og elektromyografiske) er mye mer vanskelig å kontrollere med bred belysning mønster av lysdioder. Fiber koblings løser alle disse problemene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

KMA (20,0 ml)
2 ml 100 mg / ml ketamin (10 mg / ml, en gang fortynnet)
0,4 ml av 1 mg / ml Dexdomitor (medetomidin; 0,02 mg / ml, en gang fortynnet)
0,05 ml 100 mg / ml Acepromazin (0,25 mg / ml, en gang fortynnet)
17,55 ml 0,9% saltvann
Dosering, voksen mus (15 - 40 g)
Knock-down: 0,012 ml / g * kroppsmasse (Ketamin = 120 mg / kg)
Vedlikehold: 0,0025 ml / g * kroppsmasse (Ketamin = 25 mg / kg)
Name Company Catalog Number Comments
ChR2-EYFP Line Jackson Colonies 12569
Pvalb-iCre (PV) Line Jackson Colonies 8069
Sst-iCre (SOM) Line Jackson Colonies 13044
Cr-iCre (CR) Line Jackson Colonies 10774
Agarose Sigma-Aldrich A9793 Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook) FST 10066-15
Surgical Scissors FST 14084-09
Scalpel FST 10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment Foster & Smith 9N-76855
Homeothermic Blanket Harvard Apparatus 507220F
Tungsten Microelectrodes A-M Systems 577200 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing Warner Instruments G150TF-3
Heat Shrink Tubing DigiKey A332B-4-ND
Zapit Accelerator DVA SKU ZA/ZAA Use with standard Super Glue. 
Microelectrode AC Amplifier 1800 AM Systems 700000
MP-285 Motorized Micromanipulator Sutter MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes Tektronix TDS2000C
Powered Speakers Harman Model JBL Duet
Manual Manipulator Scientifica LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable ThorLabs FC/PC BFL37-800
Power Meter ThorLabs PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E DigiKey XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO DigiKey 1050-1024-ND

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
  2. Moore, A. K., Wehr, M. Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency. J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).
  3. Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals. Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).
  4. Markram, H., et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).
  5. Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli. Neuron. 73, 159-170 (2012).
  6. Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo. Nature. 488, 343-348 (2012).
  7. Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480, 331-335 (2011).
  8. Pi, H. J., et al. Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature. 503, 521-524 (2013).
  9. Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. A neural circuit for spatial summation in visual cortex. Nature. 490, 226-231 (2012).
  10. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  11. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3, 159 (2005).
  12. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  13. Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex. J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).
  14. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8, 70553 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats