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1Institute of Neuroscience, University of Oregon

Published 11/07/2014
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Neuroscience

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Summary

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Moore, A. K., Wehr, M. A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons. J. Vis. Exp. (93), e51757, doi:10.3791/51757 (2014).

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Abstract

Una sfida importante in neurofisiologia è stato quello di caratterizzare le proprietà di risposta e la funzione dei numerosi tipi di cellule inibitoria nella corteccia cerebrale. Siamo qui condividiamo la nostra strategia per l'ottenimento di stabili, ben isolate-single-unit registrazioni da interneuroni inibitori identificati nel topo corticale anestetizzato utilizzando un metodo sviluppato da Lima e colleghi 1. Le registrazioni vengono eseguite in topi che esprimono channelrhodopsin-2 (ChR2) in specifiche sottopopolazioni neuronali. I membri della popolazione sono identificati dal loro risposta ad un breve lampo di luce blu. Questa tecnica - chiamata "PINP", o Identificazione Fotostimolazione-assistita di popolazioni neuronali - possono essere implementati con equipaggiamento di serie di registrazione extracellulare. Può servire come un'alternativa economica e accessibile per l'imaging calcio o patch visivamente guidato, al fine di indirizzare registrazioni extracellulari alle cellule geneticamente identificati. Here mettiamo a disposizione una serie di linee guida per l'ottimizzazione del metodo nella pratica di tutti i giorni. Abbiamo raffinato la nostra strategia specifica per il targeting (PV +), le cellule parvalbumin-positivo, ma abbiamo trovato che funziona per altri tipi di interneuroni, nonché, come ad esempio (CR +) interneuroni-calretinina esprimono-somatostatina che esprimono (SOM +) e.

Protocol

NOTA: Il seguente protocollo è conforme con il National Institutes of linee guida per la salute, come approvato dalla University of Oregon Animal Care and Use Committee.

1. Chirurgia acuta

  1. Anestetizzare l'animale con un cocktail di ketamina-medetomidina, via intraperitoneale (ip) iniezione (Tabella 1).
    NOTA: I topi utilizzati in questi esperimenti sono generati attraversando un cre-dipendente ChR2-EYFP transgenico line10 di interneuroni linee conducente (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Consegna virale di ChR2 o opsine correlati dovrebbe funzionare altrettanto bene, assumendo livelli di espressione simili si ottengono.
  2. Prima di iniziare l'intervento, in modo che le esibizioni di animali non risposta ad un pizzico punta dolce. Ri-somministrare anestetici durante l'esperimento come necessario per mantenere questa profondità dell'anestesia. Se si utilizza anestetici iniettabili, eventualmente impiantare un catetere ip per preparazioni iniettabili di manutenzione.
  3. Mantenere l'animale idratato con soluzione salina o di Ringer lattato durante l'esperimento (circa 3 ml / kg / ora), per esempio usando un cocktail anestetico opportunamente diluito per preparazioni iniettabili manutenzione (Tabella 1).
  4. Posto l'animale in un apparato porta-teste stereotassico o altro. Assicurarsi che il cranio è ben protetto,. Ciò è essenziale per mantenere registrazioni monocellulari stabili.
  5. Applicare una pomata opthalamic agli occhi per prevenire la secchezza. Mantenere la temperatura corporea a 36,5-37 ° C.
  6. Eseguire uno scarico della cisterna per la stabilità ulteriore registrazione. Usando un bisturi, rimuovere il tessuto dalla faccia posteriore del cranio per esporre la cisterna magna. Fare un piccolo nick nella dura per drenare il liquido cerebrospinale. Utilizzare solo la punta della lama, ed evitare qualsiasi contatto il gambo cervelletto o del cervello.
  7. Utilizzando il bisturi, eseguire una piccola craniotomia (~ 2 mm 2) sopra la zona corticale di interesse (per l'acusticacorteccia, circa -2.3 mm posteriormente di bregma, 4,5 millimetri laterale della linea mediana).
  8. Rimuovere la dura e coprire la corteccia esposta con uno strato di agarosio calda 0,5 - spessore di 1 mm (1,5% agarosio in soluzione salina, 0,9% di NaCl; applicare a ~ 37 ° C). Mantenere l'umido agarosio tutto l'esperimento applicando periodicamente alcune gocce di soluzione salina.

2. Registrazione Set-up

  1. Preparare un elettrodo di tungsteno (7-14 MW, 127 micron di diametro, 12 ° punta affusolata, rivestimento epossidico). Superglue l'elettrodo di un tubo capillare di vetro e aggiungere termorestringente per una presa (figura 1).
  2. Montare l'elettrodo su un micromanipolatore motorizzato (o idraulico), impostare viaggiare ortogonale alla superficie corticale. Far scorrere un filo di terra sotto la pelle, contro il cranio. Evitare il contatto con i muscoli sul lato della testa e la parte posteriore del collo, in quanto possono generare artefatti elettromiografici.
  3. Amplificazione del segnale elettrico utilizzando un amplificatore extracellulareli fi catore adatto per la registrazione singola unità, preferibilmente dotata di una modalità di controllo dell'impedenza. Monitorare l'attività chiodare in corso (banda passante di 300 - 5.000 Hz) con due oscilloscopi e un set di altoparlanti amplificati. Qui, i dati registrati vengono digitalizzate continuo ad una frequenza di campionamento di 10 kHz; picchi vengono estratti in linea.
  4. Avanzare l'elettrodo attraverso l'agarosio finché la punta raggiunge la superficie della corteccia. Osservare questo passaggio attraverso un microscopio. "Zero" questa posizione sul micromanipolatore.
  5. Per meglio approssimare la profondità della registrazione, confermare visivamente che la punta dell'elettrodo esce dalla superficie corticale ad una profondità di zero quando ritirare l'elettrodo al termine di una penetrazione.
    NOTA: Una discrepanza tra la lettura manipolatore e la posizione dell'elettrodo osservato indica che è spostata rispetto al tessuto. Questo può essere causato da instabilità del cervello o animale, o manipolatore deriva.
    1. Come un ulteriore controllo per garantire chequesto set-punto zero corrisponde alla superficie della corteccia, monitorare potenziali di campo evocati stimolo mentre avanza attraverso le prime diverse centinaia di micrometri di tessuto. Durante il monitoraggio potenziali di campo, abbassare il più basso filtro passa-banda di taglio dell'amplificatore extracellulare a 10 Hz. Verificare che la polarità del potenziale campo locale inverte intorno una profondità di circa 100 micron, in prossimità dello strato di confine I / II 13. Questo è un punto di riferimento affidabile per la corteccia uditiva, ma può essere diverso per le altre aree corticali.
  6. Montare una fibra ottica accoppiata ad una sorgente di luce blu (figura 2) su un micromanipolatore manuale. Utilizzando il microscopio, posizionare la punta della fibra più vicino alla superficie del agarosio possibile. Centrare il fascio in cui l'elettrodo si entra il tessuto.
  7. Regolare l'uscita della sorgente di luce con una unità di controllo in grado di erogare un TTL (transistor-transistor logic) treno di impulsi di larghezza e duratio specificaton- esempio, un Arduino (figura 3), una scheda PC I / O (come mostrato), o un generatore di impulsi disponibile in commercio.
    1. Monitorare il segnale su entrambi oscilloscopi.
  8. Misurare potenza luminosa totale (mW) sulla punta della fibra ottica utilizzando un misuratore di potenza. Utilizzare questo valore per calcolare irradianza (mW / mm 2) dividendo per l'area della sezione trasversale del nucleo della fibra. Iniziare con un valore di intensità nell'intervallo 10 - 15 mW / mm 2 e regolare verso il basso se necessario, fino artefatti sono eliminati.
  9. Verificare la presenza di manufatti leggeri con l'elettrodo nella agarosio, pronta a entrare nel tessuto. Avviare la ricerca treno di impulsi (ad esempio, 30 impulsi di luce msec, 500 msec intervallo interstimulus (ISI)).
    1. Eliminare manufatti leggeri transitori (Figura 4) per riposizionare la fibra ottica rispetto all'elettrodo per cambiare l'angolo della luce incidente. Se artefatti persistono, provare a diminuire la potenza luminosa. In the caso raro che gli artefatti non possono essere completamente eliminati (solo ridotto al minimo), estendere la durata dell'impulso di ricerca. Questo può aiutare a identificare i veri picchi neuronali.

3. Dritto PINP-in '

  1. Avanzare l'elettrodo lentamente attraverso il cervello ad una velocità di circa 1 micron / sec. Utilizzare un oscilloscopio per monitorare l'attività in corso. Dall'altro, scatenare gli impulsi laser.
  2. Attendere il 'hash' deboli di picchi luce evocata sul monitor audio, che indica che l'elettrodo si avvicina una cella ChR2 + e spesso può essere percepito ben prima del segnale elettrico risulta sull'oscilloscopio. Rallentare la velocità di avanzamento.
    NOTA: Se la cella si trova direttamente nel percorso dell'elettrodo, l'attività di luce evocata crescerà più grande (e più forte). Come l'elettrodo si avvicina un singolo interneuroni, l'hash risolverà in piccoli ma ben definiti picchi di forma e dimensione uniformi.
  3. Appena lipicchi GHT-evocato sono grandi abbastanza per innescare della singolarmente sull'oscilloscopio, cominciano a farlo. Regolare la scala sull'asse orizzontale per osservare la forma esatta della forma d'onda di picco.
  4. Fermarsi e attendere per il tessuto di stabilirsi. Resistete alla tentazione di spostare l'elettrodo più vicino alla cella. Questo passaggio è fondamentale per una registrazione stabile. Se dopo alcuni minuti il ​​rapporto segnale-rumore non è migliorata - cioè, il tessuto è costante, ma non ha portato la cella più vicino alla punta dell'elettrodo - avanzamento 5 micron ulteriormente e attendere.
    1. Ripetere questo processo fino a quando la punta o la depressione del potenziale d'azione possono essere catturati in modo affidabile con una soglia di tensione impostata ben al di sopra del rumore di fondo (ad esempio, +/- 300 mV o superiore).
      NOTA: C'è poco rischio di falsi positivi o ambiguità quando PINPing interneuroni inibitori. La maggior parte delle cellule in grado di seguire facilmente un treno di impulsi di durata di 30 msec e inter-pulIntervallo SE 500 msec, o più veloce, con una certa latenza primo picco di 2-5 msec (Figura 5). La maggior parte delle cellule fotovoltaiche +, in particolare, può sostenere cottura per un totale di 1 sec (Figura 6). Perché questi sono neuroni inibitori, disynaptic attivazione (indiretto) non è una preoccupazione importante.
  5. Durante la registrazione, monitorare l'attività in corso sul primo oscilloscopio. Tieni d'occhio le dimensioni e la forma del picchi utilizzando il secondo oscilloscopio. Si noti la qualità del loro suono sull'altoparlante.
    1. Ascoltate con attenzione per i cambiamenti improvvisi, che indicano che la cella è sia volge troppo vicino all'elettrodo (dove rischia di essere impalato o danneggiato), o è alla deriva. Se le punte si allargano e distorta, tornare indietro; se crescono più piccolo, far avanzare l'elettrodo. Si muovono lentamente in 2 micron passi.
    2. Verificare la qualità della registrazione post-hoc sovrapponendo tutte le forme d'onda di picco, allineati a picco o depressione. Variare le THRES tensionetenere. Attraverso una vasta gamma di valori di soglia, ci dovrebbe essere solo una forma coerente picco di altezza uniforme (figura 5a).
  6. Se in qualsiasi momento il segnale venga contaminato con punte da un neurone vicino, andare avanti. Avanza lentamente, sulla remota possibilità che l'elettrodo passerà fuori dalla portata della cella vicina, ma rimanere nel raggio d'azione del neurone bersaglio. (Questo è di solito senza successo.)
  7. Spostare l'elettrodo attraverso l'intera profondità della corteccia (900 + micron) in ogni penetrazione. Se non ci sono i neuroni di luce-sensibili si incontrano dopo molti penetrazioni o, al contrario, le registrazioni sono regolarmente contaminati con punte di cellule ChR2- vicini, provare un nuovo elettrodo.
    NOTA: Anche all'interno di una stessa partita, la geometria impedenza e punta di singoli elettrodi può variare considerevolmente. Entrambi i fattori contribuiscono alla effettiva "ascolto raggio" dell'elettrodo, che deve essere sufficientemente grande per rilevare i picchi di luce evocati whricerca ile, ma limitato sufficiente per permettere la registrazione di un singolo interneuroni in isolamento.
  8. Testare l'impedenza degli elettrodi lo desideri. Per evitare di danneggiare il tessuto, farlo con la punta dell'elettrodo nella parte superiore dello strato di agarosio, ben al di fuori del cervello. All'interno della gamma di 7-14 MW, l'impedenza esatta non è un sicuro indicatore delle prestazioni, o cedere, per questa applicazione. Detto questo, si tratta di un proxy ragionevole per l'ascolto radio: elettrodi più bassa impedenza raccogliere più unità; elevata impedenza, meno.
  9. Alla fine dell'esperimento, eutanasia dell'animale mediante istituzionalmente approvati, quali overdose di anestetico, o dislocazione cervicale sotto un profondo piano di anestesia.

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Representative Results

Siamo qui condividiamo la nostra strategia per ottenere registrazioni singola unità da interneuroni inibitori geneticamente classificati nel topo corticale anestetizzato, utilizzando un metodo optogenetic sviluppato da Lima et al. Tabella 1 i dettagli cocktail anestetico suggerito, Ketamina-Medetomidina-acepromazina (1. " KMA "). La Figura 1 illustra un microelettrodo di tungsteno, preparato per la registrazione. La figura 2 contiene uno schema circuitale di una semplice unità di controllo LED. La figura 3 contiene la configurazione e il codice per gating potenza di illuminazione con un microcontrollore Arduino. Figura 4 mostra un esempio di i manufatti elettrici di luce indotta discusso nel protocollo. Gli artefatti sono a volte incontrano (pannello di sinistra), ma facilmente corretti (pannello di destra). La Figura 5 mostra esempi di registrazioni da tre tipi di interneuroni otticamente-identificati (PV +, CR + e + SOM). Il pa sinistraNel presenta tracce di tensione prima e forme d'onda allineate, rappresentativo del tipo di rapporto segnale-rumore si può sperare di ottenere con questa strategia. Picchi sono catturati in modo affidabile con una soglia di tensione fissa di diverse centinaia di microvolt. Una trama raster (pannello di destra) mostra la breve latenza e l'affidabilità delle risposte di luce evocata, che consentono l'identificazione univoca degli interneuroni ChR2-positivi. La figura 6 mostra la tensione tracce da tre PV + interneuroni, rispondendo a un impulso di luce 1 sec. La maggior parte dei + celle fotovoltaiche in grado di sostenere ad alta frequenza di emissione per centinaia di millisecondi, che li rende particolarmente facile da identificare.

Figura 1
Figura 1. Preparazione di un elettrodo.   (A) Schema di un elettrodo preparato. L'elettrodo è affisso ad un tubo capillare di vetro utilizzando due piccole gocce di colla eccellente e una quantità minima di acceleratore (come Zap-E). Guaina termorestringente viene aggiunto per la presa, con fuoco molto basso. Gli elettrodi vengono spediti con la. (B) Fotografia pin del connettore precedentemente montate di un microelettrodo di tungsteno preparato montato in un portaelettrodo.

Figura 2
Figura 2. Schema elettrico per un'unità di controllo LED. Un circuito semplice ed economico per la consegna della luce. Un LED super luminoso (475 nm) è collegato a un dissipatore di calore ed accoppiato all'altra estremità di un cavo a fibre ottiche (800 micron di diametro). L'uscita del LED è recintato con un impulso TTL. L'unità di controllo comprende un alimentatore di tensione-mode per intensità di luce regolabile. 2K POT: potenziometro per controllare l'intensità della luce. P / S: DC supp potere mente (ad esempio, caricatore del computer portatile). SUGGERIMENTO 122: transistor Darlington. 4N35: isolatore ottico. Le parti elencate qui costano <$ 10.

Figura 3
Figura 3. Codice e la configurazione Arduino. Un treno di impulsi TTL per gating emissione di luce possono essere generati utilizzando un microcontrollore Arduino. Il programma specifica una durata dell'impulso e ISI per un treno di impulsi loop. Le istruzioni per il caricamento del programma sulla scheda possono essere trovati nella pagina di Arduino "Getting Started" ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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. Figura 4. manufatto Luce elettrodi metallici sono suscettibili di manufatti leggeri, presenti al momento della comparsa e l'offset di impulsi (pannello di sinistra, segnale filtrato, 300 - 5.000 Hz). In genere possono essere completamente eliminati (pannello destro) riposizionando la fibra ottica rispetto all'elettrodo per cambiare l'angolo della luce incidente e / o diminuendo la potenza luminosa.

Figura 5
Figura 5. Esempio cellule. (A) Esempio registrazioni tipici interneuroni otticamente-identificati, PV + (viola), CR + (verde), SOM + (rosso). Le cellule rispondono al treno di impulsi di ricerca (durata dell'impulso 30 ms, ISI 500 ms) con una raffica affidabile di punte. Il pannello di destra mostra 100 picchi di valle-allineati e. la forma d'onda media interpolato (10x sovracampionato da una frequenza di campionamento di 10 kHz) (B) Trame raster per gli stessi file mostrano la breve latenza (~ 2-5 msec). e la tempistica coerente di picchi di luce evocata (C) Media e deviazione standard delle latenze di prima Spike (5 - 10 impulsi) per un campione di 44 PV + interneuroni (media media e deviazione standard: 3.4 +/- 2.6 msec). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Esempi di risposte sostenuta Si può essere particolarmente fiducioso per identificare PV + interneuroni come la maggior parte di loro in grado di sostenere ad alta frequenza di emissione per centinaia di millisecondi -. Che ricorda le loro risposte a correnteiniettabile in vitro 14. Tre cellule ChR2 / PV rispondono a impulsi di luce 1 sec: due che sparano regolarmente durante tutta la durata dell'impulso, ed una insolita esempio di una cella che non è così (<10% delle cellule incontrate).

Tabella 1. La ketamina-Medetomidina-Acepromazine ("KMA"). Knock-down e la dose di mantenimento di un topo adulto, diluito per mantenere l'idratazione. Il cocktail è ri-somministrato ogni 40-90 minuti, se necessario.

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Discussion

Anche se PINP è concettualmente semplice, può essere difficile in pratica. Un fattore determinante del successo è la scelta dell'elettrodo. Il raggio di ascolto elettrica è il parametro critico. Deve essere sufficientemente grande per rilevare i picchi di luce evocata quando la punta è ancora lontano da una cella ChR2 +, in modo che si può regolare la velocità di avanzamento di conseguenza. Allo stesso tempo, deve essere limitato sufficiente a consentire un buon isolamento singola unità. Cioè, l'elettrodo non deve anche prendere picchi dalla vicina unità ChR2-. Trovare il giusto equilibrio in termini di ascolto raggio sarà una sfida per qualsiasi tipo di cellula bersaglio, ma è particolarmente vero per interneuroni inibitori, che sono sparse, piccole, e spesso si trovano in prossimità di piramidale cellule, che che hanno relativamente grande extracellulare picchi. Anche usando le strategie espresse, il rendimento atteso non è elevato. Il nostro rendimento tipico è 0-2 PV + neuroni / animale, data la nostra criteria di eccellente isolamento singola unità e le registrazioni della durata di oltre mezz'ora.

Quando PINPing neuroni inibitori, disynaptic attivazione (indiretto) non è una preoccupazione importante, perché i neuroni inibitori sono relativamente improbabili per attivare indirettamente cellule post-sinaptiche. Per PINPing i neuroni eccitatori, l'attivazione disynaptic è comune; molti neuroni che si attivano in risposta alla luce non esprimono ChR2, ma ricevono potente eccitazione sinaptica da quelli che lo fanno. Strategie per directly- discriminante dai neuroni indirettamente attivati ​​sono discusse in dettaglio a Lima et al. 1.

Considerazioni elettrodi

Abbiamo sistematicamente esplorato una varietà di elettrodi e tecniche di registrazione: pipette patch di vetro con punte di diverse dimensioni, microelettrodi di tungsteno di varia impedenza e geometria della punta, e array multicanale (ad esempio, tetrodi). Angolari, ad alta impedenza microelettrodi di tungsteno(Come suggerito qui) ha dato, di gran lunga, il miglior rendimento. Una discussione dei problemi incontrati con ciascuna di queste tecniche segue.

Usando gli array tetrodo a bassa impedenza e le sonde multi-canale, abbiamo regolarmente rilevato picchi di luce evocati; Tuttavia, essi sono raramente abbastanza grandi per ordinare affidabile. In altre parole, il rapporto segnale-rumore (SNR) era insoddisfacente. Abbiamo fatto tanto in tanto ottenere eccellenti registrazioni con tetrodi, ma la resa asintotico era più alta con i microelettrodi singoli tungsteno, e la qualità delle registrazioni era molto meglio. Punte tetrodo sono relativamente smussato pure, che limita il numero totale di penetrazioni possibili per animale. I problemi che abbiamo incontrato con sonde multi-canale sono stati probabilmente esacerbati dall'uso di ampia illuminazione di superficie. A differenza di mira, la stimolazione a bassa potenza da una fibra impiantato, l'illuminazione di superficie causerà cottura sincrono in ChR2 + neuroni al di là del sito di registrazione, che porta a forme d'onda picco sovrappostiche sono più difficili da risolvere.

Elettrodi di patch di vetro, come quelli utilizzati per le registrazioni standard di cellulari-attached sciolti, sono stati, inoltre, non particolarmente adatti al compito, ma per ragioni diverse. Una resistenza bassa (<5 MW) elettrodi di patch sono fortemente orientate verso le cellule piramidali, che rende difficile per indirizzare interneuroni inibitori. Anche se questo può essere corretto in una certa misura, utilizzando una maggiore resistenza (punta più piccolo) elettrodi, il problema più grande con elettrodi di patch è il loro raggio di ascolto estremamente limitato. Anche se le registrazioni di patch di cellule-attached forniscono un elevato SNR, le cellule luce-sensibili non possono essere rilevati al di fuori della modalità cellulare iscritti. La strategia con elettrodi di patch è, inevitabilmente, per ottenere in modo casuale e sequenziale registrazioni cellulari-attached, pochissimi dei quali sono ChR2-esprimono interneuroni inibitori.

Con l'alta impedenza elettrodi di tungsteno si puòsia di rilevare picchi di luce evocata da lontano, e raggiungere un buon isolamento singola unità. La geometria della punta è probabilmente il fattore più importante. Abbiamo provato elettrodi di tungsteno da due produttori, con impedenze che vanno 2-14 MW, e gli angoli punta 5-12 °. Abbiamo trovato che 12 ° angoli di punta erano superiori, ma che l'impedenza precisa era meno importante, nell'intervallo di 7 - 14 MW. Abbiamo scoperto che gli elettrodi di vetro rivestite erano più suscettibili di manufatti leggeri rispetto agli elettrodi con rivestimento epossidico, quindi si consiglia di quest'ultimo. Non abbiamo tentato di fare le nostre elettrodi di tungsteno personalizzato. Come con qualsiasi tipo di elettrodo, modi comuni di errore sono a perdere l'isolamento o ferire un neurone. Diversi parametri di ribaltamento non sembrano avere molta influenza su questo. Piuttosto, in attesa che il tessuto si depositino è il fattore più importante nel mantenere registrazioni di alta qualità.

Consegna Luce

Poiché la luce è utilizzato solosa dire di identificare cellule ChR2-positivi - piuttosto che regolare la loro produzione in modo specifico - nella gamma di intensità utilizzabili per questo esperimento è ampia. Un limite inferiore è impostato dal fatto che l'intensità deve essere sufficiente ad attivare le cellule ChR2-positivi alla profondità massima di cellule di interesse. Abbiamo scoperto che irradianze punta> 5 mW / mm 2 (misurata a 470 nm) sono stati sufficienti per ottenere risposte robuste da PV + cellule in strato profondo 6. Irraggiamento a profondità specifiche all'interno del cervello può essere stimata utilizzando una calcolatrice sulla base di misure dirette a mammiferi tessuto cerebrale (ad esempio, http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php ), ma si consiglia vivamente di determinare il minimo per i propri esperimenti empiricamente, utilizzando un microelettrodo bassa impedenza (1 - 3 MW, per l'attività dell'unità multipla). Un limite superiore è impostato dal fatto che l'alta intenle piazzole possono causare artefatti leggeri, che possono complicare il rilevamento di picchi evocati. Negli animali transgenici, di alta intensità può anche causare artefatti elettromiografici attivando ChR2 in PV esposto + muscoli sul collo e la testa.

Nel costruire il nostro sistema di erogazione di luce, abbiamo trovato che un accoppiamento di un LED con una fibra ottica è in definitiva più conveniente di piazzare il LED direttamente sopra il cervello. Quest'ultimo è un modo molto efficace per fornire la luce, ma ha alcuni inconvenienti pratici. La corrente che attraversa il dispositivo produce artefatti elettrici che devono essere protette, e il LED genera calore sostanziale che deve essere dissipata con una grande dissipatore. Inoltre, manufatti leggeri (sia fotovoltaici e elettromiografici) sono molto più difficili da controllare con l'ampio schema di illuminazione dei LED. Accoppiamento fibra risolve tutti questi problemi.

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Materials

KMA (20.0 ml)
2 ml di 100 mg / ml di ketamina (10 mg / ml, una volta diluito)
0,4 ml di 1 mg / ml DEXDOMITOR (medetomidina; 0,02 mg / ml, una volta diluito)
0,05 ml di 100 mg / ml Acepromazine (0,25 mg / ml, una volta diluito)
17,55 ml di soluzione salina allo 0,9%
Dosaggio, topo adulto (15 - 40 g)
Knock-down: 0.012 ml / g * massa corporea (ketamina = 120 mg / kg)
Manutenzione: 0,0025 ml / g * massa corporea (ketamina = 25 mg / kg)
Name Company Catalog Number Comments
ChR2-EYFP Line Jackson Colonies 12569
Pvalb-iCre (PV) Line Jackson Colonies 8069
Sst-iCre (SOM) Line Jackson Colonies 13044
Cr-iCre (CR) Line Jackson Colonies 10774
Agarose Sigma-Aldrich A9793 Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook) FST 10066-15
Surgical Scissors FST 14084-09
Scalpel FST 10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment Foster & Smith 9N-76855
Homeothermic Blanket Harvard Apparatus 507220F
Tungsten Microelectrodes A-M Systems 577200 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing Warner Instruments G150TF-3
Heat Shrink Tubing DigiKey A332B-4-ND
Zapit Accelerator DVA SKU ZA/ZAA Use with standard Super Glue. 
Microelectrode AC Amplifier 1800 AM Systems 700000
MP-285 Motorized Micromanipulator Sutter MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes Tektronix TDS2000C
Powered Speakers Harman Model JBL Duet
Manual Manipulator Scientifica LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable ThorLabs FC/PC BFL37-800
Power Meter ThorLabs PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E DigiKey XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO DigiKey 1050-1024-ND

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References

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