Imagens de fluorescência com um nanômetros Precisão (Fiona)

1Department of Physics, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Center for the Physics of Living Cells, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Center for Biophysics and Computational Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign
* These authors contributed equally
Biology

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Summary

Fluorophores individuais podem ser localizados com precisão nanométrica usando FIONA. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado, e como a realização de experimentos Fiona é descrito.

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Wang, Y., Cai, E., Sheung, J., Lee, S. H., Teng, K. W., Selvin, P. R. Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA). J. Vis. Exp. (91), e51774, doi:10.3791/51774 (2014).

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Abstract

Imagens de fluorescência com uma precisão de um nanômetro (Fiona) é uma técnica simples, mas útil para localizar fluorophores individuais com precisão nanométrica no plano xy. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado e exemplos de pesquisas que têm sido realizados utilizando FIONA são descritas resumidamente. Em primeiro lugar, como configurar o equipamento necessário para experimentos de FIONA, ou seja, um total de microscopia de fluorescência de reflexão interna (TIRFM), com detalhes sobre o alinhamento da ótica, é descrito. Em seguida, como para realizar uma experiência simples fIONA em localizar moléculas imobilizadas com Cy3 de ADN individuais utilizando os protocolos apropriados, seguindo-se a utilização de fIONA para medir o tamanho do passo de 36 nm, de um único motor de miosina Va truncado marcado com um quantum dot, é ilustrado. Por fim, o esforço recente para estender a aplicação da FIONA para amostras espessas é relatado. Mostra-se que, utilizando uma objectiva de imersão em água e pontos quânticos embebido profundamente em sol-gel e córneas do olho de coelho (>200 mm), a precisão da localização 2-3 nm pode ser atingida.

Introduction

Por volta de 1882, Ernst Abbe descobriu que a resolução de um microscópio de luz visível é ~ λ / 2NA, ou ~ 200 nm (onde λ é o comprimento de onda e NA é a abertura numérica) 1,2. Por conseguinte, qualquer objecto mais pequeno do que esta dimensão que aparecem como uma mancha de difracção limitada, no microscópio óptico. No entanto, é possível determinar o centro do ponto, isto é, a localização do objecto, com uma precisão muito superior 3. Imagens de fluorescência com uma precisão de um nanômetro (Fiona) é uma técnica simples, mas útil para localizar fluorophores individuais com precisão nanométrica no plano xy 4. A precisão da localização, σ μ (ou seja, o erro padrão da média), depende do número total de fotões recolhidos, Equação 1 , Onde N é o número de fotões, s é o desvio padrão da mancha fluorescente, um éo tamanho do pixel do detector de imagens, e b é o desvio padrão do fundo de 3,4. Para um fluoróforo que emite fótons ~ 10.000, FIONA pode alcançar ~ 1 nm precisão 4.

FIONA pode ser utilizada para determinar com precisão a posição de um emissor estacionário, ou um movimento (assumindo que as imagens podem ser feita suficientemente rápida). FIONA pode ser aplicado, sequencialmente, para os quadros do filme e, assim, controlar o movimento da única molécula 4 a 8. Reagentes foto-proteção pode ser necessário garantir que a amostra não photodegrade. Além disso, o próprio objecto fluorescente pode ser de qualquer tamanho, menor ou maior do que a difracção LIMIT- por exemplo, pode consistir de um organelo (~ 1 mm) com muitas proteínas fluorescentes dispersas sobre a sua membrana. Usando FIONA ainda pode render um (nanômetros) média muito precisos de sua média de centro de massa. A grande melhoria na precisão de localização por Fiona permite resolver nanometer movimentos escala ao longo do tempo. Isso levou microscopia na escala de comprimento molecular 4 a 8.

Desde a sua invenção, as variantes do fIONA têm sido desenvolvidos. Por exemplo, a imagem de campo claro com uma precisão de um nanômetro (bFIONA) 9, uma ligeira variante da FIONA, imagens e localiza objetos densos como melanossomas in vivo (objetos escuros contendo o pigmento melanina) com luz transmitida. Além disso, fIONA tem sido empregue para resolver vários corantes. Por exemplo, uma única molécula de alta resolução de imagem com fotodegradação (camarão) 10,11 ou uma única molécula de alta resolução co-localização (SHREC) 12 foram desenvolvidos para resolver dois corantes dentro de cerca de 10 nm. (Note-se que esta é a resolução, ou seja, a precisão com que se pode contar corantes idênticos separados.) Mais recentemente, a análise FIONA tem contribuído para o processo de localização de certos microscopia de super-resolução, como reco óptica estocásticamicroscopia nstruction (STORM) 13 e 15 e microscopia de localização ativados por foto (PALM) 16, em que fluorophores escuras temporárias está animado, e, em seguida, a fluorescência é localizada. Por várias vezes bastante interessante uma baixa densidade de corantes (menos do que um por difracção limitada local), e, em seguida, recolhendo a fluorescência, a análise de cada um deles por fIONA, pode-se construir um mapa de alta resolução. A resolução é, então, apenas limitado pelo número de fotões cada corante coloca fora, bem como coisas como manter a amostra estacionária (incluindo, por exemplo, a fase de microscópio), durante a aquisição.

Neste trabalho, um resumo da técnica FIONA e descrever brevemente exemplos de pesquisas que têm sido realizadas utilizando FIONA é relatado. Em primeiro lugar, como configurar o equipamento necessário para experimentos de FIONA, ou seja, um total de microscopia de fluorescência de reflexão interna (TIRFM), com detalhes sobre o alinhamento da ótica, é descrito. Então, comorealizar uma experiência simples FIONA em localizar moléculas imobilizadas Cy3-DNA único meio de protocolos apropriados, é ilustrado. Depois disso, o uso de fIONA para medir o tamanho do passo de 36 nm, de um único motor de miosina Va truncado marcado com um quantum dot é apresentado. Miosina Va é uma proteína motora processive essencial que transporta carga celular enquanto translocação ao longo dos filamentos de actina. Aqui uma miosina Va construir truncada é utilizado para remover os domínios irrelevantes para o tamanho do passo, e com um marcador FLAG adicionado ao terminal C para permitir a facilidade de marcação com quantum dots funcionalizados com anticorpos anti-FLAG. Esta experiência é realizada em condições de baixa ATP para abrandar a miosina e permitir a utilização de longos tempos de exposição suficiente para obter uma boa contagem de fotões em cada quadro. Qualquer marcador fluorescente suficientemente brilhante pode ser substituído no seguinte protocolo. Por fim, é relatado recente esforço de estender a aplicação da FIONA a amostras de espessura. Como princípio de prova de, pontos quânticos foram embebidosem sol-gel e córneas do olho de coelho e, em seguida, analisados ​​e localizado com Fiona. Para imagem, uma objectiva de imersão em água 60X com NA = 1.2 foi usado porque este objectivo tem uma distância maior do que trabalhar utilizado anteriormente objetiva de imersão em óleo de 100X. Para compensar a perda na ampliação da objetiva, uma lente extra-ampliação (3.3X ou 4.0X) foi inserido no caminho de emissões. Além disso, a epi-fluorescência (não TIR), microscopia precisa de ser utilizado para acesso a regiões profundas nas amostras grossas. Mostra-se que os pontos quânticos embebidos no fundo do sol-gel e em córneas do olho de coelho (Z> 200 mM) podem ser localizados com precisão 2-3 nm.

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Protocol

Declaração de Ética: O tecido da córnea de coelhos foi coletado de acordo com a Universidade de Illinois Institutional Animal Care e Uso diretrizes.

Configuração 1 TIRFM

NOTA: Utilizar óculos de laser de segurança o tempo todo.

  1. Certifique-se de que todos os componentes ópticos necessários listados na Lista de Materiais estão disponíveis e prontos para o alinhamento. Se necessário, usar substitutos com funções equivalentes de outras empresas. Certifique-se de que os espelhos e lentes devem ter (AR) revestimentos anti-reflexo que correspondem o laser em uso.
  2. Definir as alturas de todos os elementos ópticos com a altura do centro do microscópio para trás da porta.
  3. Monte a laser, obturador laser e filtro ND (s). Uso de filtros ND para atenuar a energia do laser para baixo tão baixo quanto possível, mantendo o feixe visível. Apertar os parafusos com chaves sextavadas apropriadas.
  4. Planeje um caminho do feixe e marcá-lo com fita adesiva ou marcador na mesa óptica (dotted linhas azuis na Figura 1). Para simplificar, manter caminhos retos ao longo de linhas de furos na tabela óptica.
  5. Local espelho M1 (Figura 1), na primeira vez em ângulo recto. Coloque as duas íris ao longo da segunda seção reta do caminho do feixe planejado. Ajuste a posição ea inclinação do M1 tal que o laser atravessa a íris.
  6. Local espelho M2 (Figura 1) no segundo turno ângulo recto. Inserir o expansor de feixe de 10x (L1 e L2, a Figura 1) ao longo da terceira secção do percurso linear. Ajustar a inclinação tal que o expansor de feixe é paralelo tanto a tabela e o caminho óptico do feixe planeado.
    1. Ajustar M1 e M2 de forma iterativa de tal forma que o laser passa a direito através dos centros das duas lentes de o expansor de feixe. Repita este passo até que o perfil do feixe do feixe expandido não é cortada de Gauss.
  7. Ajuste M1 para centralizar o feixe em L1 (Fifigura 1) e M2 para centrar a viga na L2 (Figura 1) de forma iterativa. Um perfil de feixe mau geralmente significa que o laser é cortada; usar uma folha de papel branca para bloquear o feixe depois do expansor de feixe para verificar o perfil do feixe com os olhos. Para a análise de alta precisão, use um profiler feixe óptico.
  8. Ajustar a distância entre L1 e L2 de tal modo que o feixe é colimado. Repita o passo 1.8 e 1.9, se necessário.
    NOTA: Quando o tamanho do feixe não muda com a distância, o feixe é colimado suficiente para uma instalação TIRFM. Para melhorar ainda mais a colimação do feixe, ferramentas como um interferômetro de corte poderia ser utilizado. Um tamanho típico feixe depois da expansão é de aproximadamente 20 mm.
  9. Obturador do laser. Desenrosque a objetiva do microscópio e parafuso em um alvo alinhamento fluorescente. Colocar espelhos M3 e M4 (Figura 1) para direccionar o feixe expandido na porta microscópio e sobre o espelho dicróico dentro da torre. Certifique-se de que o feixe de laser rebate tele dicróicas e para o teto.
  10. Ajuste M3 para centralizar a parte mais brilhante do feixe no alvo fluorescente, e M4 para ajustar a inclinação do feixe a ser vertical.
  11. Obturador o laser e parafuso o objetivo novamente. Se o alinhamento na etapa anterior é bem feito deve haver um ponto simétrico de sair do objetivo. Ajuste as inclinações do M3 e M4 para otimizar a potência do laser e perfil do feixe do objetivo.
  12. Montar uma câmera EMCCD ao microscópio e conectar a câmera a um computador. Inicie o software para a câmera.
  13. Montar uma amostra fluorescente (solução de fluoróforos) sobre o microscópio. Olhe para a mancha fluorescente brilhante na câmara. Verifique se o local não se desloque na tela como o foco é alterado.
  14. Coloque a lente TIR (L3, Figura 1) na fase de tradução XYZ, a uma distância a partir do plano focal posterior da objectiva, que é igual ao comprimento focal de L3 (~ 30 cm). Ajuste a posição da L3de tal forma que o laser passa através do centro da lente.
  15. Traduzir L3 ao longo do percurso do feixe para ajustar a colimação de feixe. Certifique-se de que o feixe ainda está centrada no monitor e simétricos em forma.
    NOTA: A área de iluminação no plano da amostra aumenta com a diminuição da lente TIR comprimento focal. Em geral, use o comprimento focal menor que poderia caber no set-up.
  16. Traduzir L3 perpendicular à trajetória do feixe de inclinar a trave do objectivo. Manter traduzindo a lente de modo a que TIR TIR é alcançado. Observar uma amostra de partículas fluorescentes através da câmera EMCCD, e afinar L3 para obter um bom SNR.

Figura 1
Figura 1 configuração óptica para microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM).

2. fIONA em Cy3 ADN

  1. Clâminas de microscópio e magras lamelas: Lavar lâminas de microscópio e lamelas com DDH 2 O e isopropanol e seque-os com gás nitrogênio; coloque as lâminas e lamelas do limpador de plasma por 5 min sob plasma de argônio.
  2. Construir câmaras de amostras (como esboçado na Figura 2).
    1. Coloque um tecido sobre o banco e, em seguida, colocado um pedaço de papel de lente na parte superior do tecido. Coloque o slide no papel lente. Certifique-se de que o lado limpo do slide é para cima.
    2. Aplicar duas tiras de fita dupla face para o slide ao longo das bordas longas, deixando um espaço de 3-5 mm no centro. Coloque a lamela limpa em cima do slide. Certifique-se de que o lado limpo da lamela está voltada para o slide.
    3. Use uma ponteira para pressionar para baixo sobre a fita dupla face. Use uma navalha para remover o excesso de fita a partir da corrediça de modo que a fita se mantém apenas sob a lamela.
      NOTA: As extremidades abertas da câmara são deixadas abertas e servem como entrada e para foradeixar. O volume da câmara é de vários microlitros.

Figura 2
Figura 2 Esboço de uma câmara de amostra típica (a) Vista superior.; (B) Vista lateral da direita; (C) Vista lateral da parte dianteira.

  1. Imobilizar Cy3 DNA em superfícies internas das câmaras de amostra.
    1. Preparar tampão de T-50 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de NaCl). Prepare a BSA-biotina em T-50 a uma concentração final de 1 mg / ml. Preparar tampão de T50-BSA por dissolução de BSA em T-50 a uma concentração final de 10 mg / ml.
    2. Prepare a 0,5 mg / ml de neutravidina em tampão de BSA-T50. Prepare ADN biotinilado marcado com Cy3 (Cy3-ADN) para T50-BSA numa concentração final de 5-10 pM.
    3. Pipetar 10 ul de BSA-biotina (1 mg / ml) para dentro da câmara da amostra. Espere por 5 min.
    4. Lava-se a câmara com 40 ul de BSA-T50. Pipetar 20 ul Cy3 ADN para dentro da câmara da amostra. Incubar durante 5 min e em seguida a câmara de lavagem com 80 ul de BSA-T50.
  2. Imagem Cy3-DNA moléculas individuais sob TIRFM.
    1. Preparar tampão de imagem (100 ul) por mistura de 1 mL Protocatecoate-3,4-dioxigenase (PCD, 5 mM), 4 uL de ácido protocatecuico (APC, 62,5 mM), 50 ul 6-hidroxi-2,5,7,8- ácido (Trolox, 2 mM em T-50) carboxílico tetramethylchromane-2-, e 45 ul de BSA-T50.
    2. Pipeta em tampão de imagem de 30 mL e esperar por 8-10 min.
    3. Montar a amostra para imagiologia numa TIRFM que é equipado com um laser verde (532 nm), um objectivo de imersão em óleo de 100X (NA 1,45), e uma câmara EMCCD.
    4. Defina o tempo de exposição a 100 a 500 ms e ganho de EM de 25 a 100 Adquirir um filme da amostra para 1,000 quadros.
  3. Realizar análise de dados FIONA nas imagens gravadas de Cy3-DNA.
    1. Determine o tamanho efetivo de pixels (ou seja, fator de conversão de pixels para nanômetros), dividindo o tamanho do pixel físico (leia-se a partir da folha de especificações da câmera EMCCD) pela ampliação total (a ampliação da objetiva do microscópio multiplicado por quaisquer aumentos extras).
    2. Determinar o fator de conversão de intensidades de pixel para fótons números dividindo sensibilidade CCD (ie, elétrons por contagem de A / D, lido a partir da folha de especificação da câmera CCD) pelo multiplicador de elétrons (EM) ganho utilizado na aquisição da imagem.
    3. Compilar e executar FIONA.pro para análise FIONA. Utilize este programa IDL para importar a imagem adquirida, para introduzir o tamanho do pixel eficaz (a partir do Passo 2.5.1) e do fator de conversão de intensidade ao número de fótons (a partir do Passo 2.5.2), e escolher os pontos para análise de FIONA.
      NOTA: No final, o prograsaída m vontade os resultados de montagem, com funções 2D de Gauss, bem como o número total de fótons e precisão de localização. Um resultado típico é mostrado na seção de resultados representativos e Figuras 4c-4d.
    4. Compilar e executar phcount.pro caracterizar contagem de fótons. Utilize este programa IDL para medir o número médio de fótons emitidos por um fluoróforo antes de fotodegradação, para importar a imagem adquirida e para introduzir o fator de conversão de intensidade ao número de fótons (a partir do Passo 2.5.2).
      NOTA: O programa irá então detectar pontos fluorescentes automaticamente (seleção manual é uma opção), calcular contagens de fótons em função do número de quadro e saída dos vestígios de contagens de fótons.
      1. Descarte traços ruins e especificar intervalos de quadros após a fotodegradação para correção de linha de base. No final, o programa irá exibir uma lista de números de fótons no total para todos os pontos não descartada. Em seguida, traçar a distribuição dos números de fótons e de ajustar a distrição com um decaimento exponencial para se obter o número médio de fotões. Um resultado típico é mostrado na seção de resultados representativos e Figuras 4e-4f.

3. FIONA aplicada para quantificação de Motor (por exemplo, a miosina na actina) Dynamics em nanômetro Scale

  1. Polimerizar a actina (por exemplo, preparar a F-actina) um dia antes da experiência fIONA.
    1. Reconstituir G-actina (monómero) e biotina G-actina (monómero) para 10 mg / ml com tampão de actina geral. Mexa para certificar-se de ambos são completamente dissolvido, e mantenha-os no gelo.
    2. Misturar 10 mL de G-actina (monómero) com 1,7 mL de biotina G-actina em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 100 ul de tampão de polimerização de gelo frio de actina.
    3. Deixar a mistura durante a noite a 4 ° C (F-actina formados) e, em seguida, adicionar ddH2O para um volume total de 1 ml.
    4. Armazenar os filamentos de actina (actina F) a 4 ° C para posterior utilização em experiências.
      NOTA: Filamentos irá desintegrar e diminuir ao longo do tempo, mas pode ser utilizado para, pelo menos, duas semanas.
  2. Prepare a amostra para a imagiologia.
    1. Faça uma câmara de amostra (conforme descrito no protocolo 2.1 e 2.2). Pipeta de 20 ul de BSA biotinilado a 1 mg / ml em ddH 2 O. Incubar durante 10 min. Lavar com 30 mL DDH 2 O.
      NOTA: Isto bloqueia a superfície do vidro e estabelece biotina para a ligação dos filamentos de actina. Biotinilado poli-L-lisina - polietileno glicol (PEG-PLL) pode ter a mesma função.
    2. Pipeta em 0,5 mg / ml neutravidina. Incuba-se durante 2 min e, em seguida, a câmara de lavagem com tampão 30 ul M5.
    3. Pipeta no preparado de F-actina diluído 25 vezes em tampão de actina geral, a concentração final de ~ 0,004 mg / ml. Aguarde 10 minutos, lave a câmara com 30 ul de tampão.
    4. Diluir miosina Va com etiquetas FLAG 30 vezes em tampão de M5 (20 mM de HEPES (pH 7,6), MgCl2 2 mM, KCl 25 mM, EGTA a 1 mM) a uma concentração final of 250 nM. Misture 1 ml miosina com 1 ml Anti-FLAG-Qdot705 (~ 1 PM, conjugado de anticorpos Anti-Flag e Qdot705 usando o Qdot705 Antibody Conjugação Kit de acordo com o manual de instruções do fabricante). Adicionar em 8 mL M5 para preencher a 10 ul. Pipeta cima e para baixo para misturar bem. Incubar durante 10 min em gelo.
      NOTA: Isso produz uma mistura de 1 motor a 4 pontos quânticos, em ~ 25 nM concentração miosina.
  3. Imagem da miosina andando em actina.
    1. Preparar tampão de imagem (100 ul) por mistura de 84 ul M5-BSA (tampão M5 com 1 mg / ml de BSA), 1 ul de ATP (50 uM em ddH2O), 2 ul de DTT (500 mM em ddH2O), 1 CK ul (500 U / ml), 5 ul de PB (200 mM), 1 ul de PCD, 4 ul APC, 1 ul da miosina-Qdot depois diluído outra de 10 vezes a concentração de 2,5 nM de miosina, e 1 ul de BME.
    2. Pipeta em tampão de imagem de 20 mL de amostra de câmara e incubar por 8-10 min.
    3. Imagem da amostra em TIRF microscópio a 30 mseg exposição. Adquirir pelo menos 1.000 quadros. Ajuste o volume da miosina-Qdot no Passo 3.3.1, se necessário.
  4. Realizar análise de dados e encontrar o tamanho do passo de miosina andar.
    1. Abra o arquivo de vídeo no ImageJ 17 e recortar o vídeo em torno de um ponto em movimento. Cortar uma área grande o suficiente para que o local nunca fica dentro de 20 pixels da borda, e certificar-se de que não há outros pontos no vídeo. Certifique-se de que este local está se movendo em um caminho linear.
    2. Acompanhe o local através do vídeo para gerar coordenadas X e Y ao longo do tempo, em pixels, através da aplicação de análise FIONA (Passo 2.5.3) para cada quadro do vídeo.
    3. Converta pixels de nanômetros, como descrito na seção anterior.
    4. Calcular deslocamento a partir da posição inicial, em função do tempo.
    5. Executar o teste t sobre o deslocamento para obter os passos de miosina curta.
      NOTA: O programa previsto t-teste (step_t_test.zip) é codificado em IDL e consiste de 14 sub-rotinas na pasta.
      1. Abra todas as sub-rotinas em IDL e compilar tudo duas vezes. Em seguida, execute mtltyanalysis_ttest.pro e escolher um arquivo de texto contendo apenas os dados de distância em uma única coluna. Um arquivo de saída Excel serão gerados, contendo os dados brutos, o ajuste eo tamanho do passo.
    6. Exclua todos os valores nulos da coluna passo-size. Traça-se a distribuição dos tamanhos de passo utilizando Origem ou MATLAB. Coloque um Gaussian para o histograma.
      NOTA: Passo tamanhos de valores de zero precisa ser suprimida por um passo de zero significa que nenhum passo é feita a partir do quadro anterior. O encaixe apresenta um pico de cerca de 36 nm (como mostrado na Figura 5).

4. Grosso Preparação de Amostras para FIONA

  1. Prepare quantum dots encapsulados em sol-gel.
    1. Misturar 4,5 ml de TMOS, 1 ml de ddH 2 O e 100 mL de HCl (120 mM). Sonicar a mistura em gelo durante 30 min no banho de ultra-sons specified na Lista de Materiais (frequência = 40 kHz, aquecedor = off). Misture a solução cada 10 minutos.
    2. Diluir 1,5 mL Qdot605 em 1,5 ml de HEPES (50 mM, pH 7,2). Misturar a solução com 1,5 ml de TMOS da etapa anterior.
    3. Despeje a mistura em um prato fundo de vidro. Selar o prato fundo de vidro com Parafilm e armazenar a 4 ° C durante 1 5 horas.
    4. Adicionar 2 ml de 1% de BME em PBS para o prato de amostra e incubar à temperatura ambiente durante 30 min antes da imagiologia.
  2. Prepare amostra córnea manchada com pontos quânticos.
    NOTA: Coelho-olhos foram presentes de Dr. Marina Marjanovic.
    1. Separe a córnea dos olhos e corte-o em 3 mm por 3 mm peças.
    2. Dilui-se 1 ml de estreptavidina-Qdot 605 em 1 ml de PBS. Incubar o tecido da córnea com uma solução a 4 nM Qdots C durante 1 hora. Lavar o tecido com PBS.
    3. Dê uma lâmina de vidro limpa e uma lamela # 1.5. Coloque 4 camadas de fita dupla face na lâmina ao longo do lado mais longo, umnd colocar mais de 4 camadas de fita de dupla face paralela à fita anterior e deixa um canal de cerca de 1 cm de entre. Colocar o tecido a partir da etapa anterior, no meio do canal, e cobri-lo com uma lamela.
    4. Pressione suavemente sobre os lados da lamela para fazer colar as fitas. Molhe o canal com 50 mL PBS antes de imagem.
  3. Quantum dots imagem em sol-gel e na córnea.
    1. Para imagens FIONA em amostras espessas, use uma objectiva 60X de imersão em água com distância de trabalho de 0,27 mm, ou um objetivo 60X de imersão em água com distância de trabalho de 0,28 mm.
    2. Monte a amostra no microscópio. Ajustar a lente TIRF tal que atinge o modo de epi-fluorescência (isto é, o feixe de laser de sai da objectiva com um ângulo contra a lamela). Coloque uma lente de ampliação adicional (3.3X ou 4.0X).
    3. Mova o plano focal da objectiva para a posição z desejado (por exemplo,> 200 mm). Grava imagens de imóvelpontos quânticos na amostra.
  4. Realizar análise FIONA como descrito na seção 2.5 do presente protocolo.

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Representative Results

A configuração típica TIRFM tipo objetivo é mostrado na Figura 3. Primeiro, amostra Cy3-DNA imobilizado na superfície foi fotografada. Uma imagem típica é mostrada na Figura 4a. A imagem foi feita com tempo de exposição de 0,5 seg, com ganho EM = 50 e sensibilidade CCD = 12,13 para a câmera. A função de espalhamento-ponto (PSF) de uma única molécula de DNA com Cy3 é mostrado na Figura 4b (a partir do local indicado pela seta da Figura 4-A), onde a barra de cor mostra a escala de intensidade de pixel. As contagens de fótons reais podem ser calculadas multiplicando-se as intensidades de pixel por um fator de conversão, a sensibilidade α = CCD / ganho EM. Este local contém aproximadamente 14.000 fótons (após correção para o fundo).

O PSF é então equipado com uma função bidimensional de Gauss, f (x, y) = z 0 + A · exp (- (x-x μ) 2 / (2s x 2) - (y - & #181, y) 2 / (2s y 2)), como mostrado na Figura 4c (com resíduos de montagem mostrados na Figura 4d). A precisão da localização é então calculada pela Equação 2 , Onde i = x ou y, s i é o desvio padrão da instalação, que N é o número total de fotões, um é o tamanho do pixel, e b é o desvio padrão do fundo. Neste exemplo específico, N = 14.528, a = 106,67 nm, s x = 115,5 nm, s y = 109,4 nm, b = 18,9, resultando em precisão de localização de σ x = 1,3 nm e σ y = 1,2 nm. A precisão de localização de um fluoróforo é aproximadamente proporcional a 1 / √n, ou seja, mais fótons são, a localização mais precisa é. No entanto, em aplicações reais de fIONA, duração de observação experimental é outra consideração. Portanto, umadeve, em geral, realizar a troca entre precisão a localização ea duração da observação e planejar com antecedência. Em tais situações, é geralmente útil para determinar o número de fotões no total um fluoróforo é capaz de emitir antes fotobranqueamento. Um traço típico de contagem de fotões versus estrutura é mostrado na Figura 4e. Um ajuste exponencial dá que o número médio de fotões ~ 1,4 x 10 6 (Figura 4f).

O processo de análise de dados de medição de miosina tamanho do passo é mostrado na Figura 5. Em primeiro lugar, um ficheiro de vídeo com uma boa relação sinal-ruído de um único miosina enquanto anda ao longo de um filamento de actina é capturado. Figura 5a mostra três quadros de um vídeo feita a 100 mseg de exposição com objectiva de imersão em óleo de 100X. O PSF em movimento é, então, acompanhados por meio do arquivo de vídeo recortada usando um código personalizado escrito em IDL para extrair distância versus tempo de informação, que é colocado através de um teste tpor etapas. figura 5b shows com a distância em relação ao tempo (vermelho) e passo-finder saída (branco). Erros de localização em cada quadro obscurece a forma de escada de rastreio, de modo que é essencial para alcançar uma contagem de fotões, em cada armação que corresponde a um erro de localização inferior a metade do tamanho teórico passo que se deseja ver. Figura 5c mostra as etapas de várias traços combinados em um histograma que é Gaussian distribuída sobre o tamanho verdadeiro passo miosina. Um ajuste de Gauss para as barras do histograma produz uma medida de tamanho de etapa final de 35,8 ± 0,4 nm.

Porque amostras sol-gel e córnea são transparentes, lasers de excitação podem penetrar profundamente as amostras sem ser espalhada demais. Além disso, a auto-fluorescência da amostra é minimizada. Quando marcado com baixa concentração de pontos quânticos, é possível coletar a fluorescência de Qdots profundo na amostra com alta relação sinal-ruído. Autilização de objectivo água dá-nos a distância de trabalho de 270 ou de 280 um, o que significa que é possível concentrar tanto quanto 280 uM longe da lamela. Isso nos permite realizar análises FIONA em pontos quânticos em amostras de espessura. Para os pontos quânticos em uma amostra de sol-gel, precisão de localização das 1-2 nm perto da lamela e 2-3 nm a 280 mM profundamente na amostra (Figuras 6a-6b) é alcançada. Para quantum dots em uma amostra biológica (parte de uma córnea de um olho de coelho, Figura 6e), precisão de localização de 1-2 nm perto da lamela e 2-3 nm a ~ 223 pM profundamente na amostra (Figuras 6c-6d) seja alcançado. Note-se que a precisão de localização é melhorada usando a lente de ampliação adicional, sem que uma precisão de localização de 6-7 nm foi obtido. Isto é consistente com estudos anteriores que mostraram que numéricos precisão de localização pode ser melhorado, alterando o tamanho efectivo de pixels a partir de 200 ~nm para ~ 50 nm, mesmo que o número total de fótons coletados pode ser menor devido às reflexões adicionais / refrações 18.

Figura 3
Figura 3 configuração óptica. A configuração óptica da microscopia de fluorescência total de reflexão interna (TIRF) a.) É uma imagem quando a laser é em TIRF condição e b) é a forma do feixe de laser no teto quando a laser é na epi-iluminação.

Figura 4
Figura 4 A localização de ADN imobilizada Cy3. Uma imagem) CCD (256 x 256 pixels) de Cy3-ADN. B) imagem CCD de uma única molécula de DNA com Cy3, indicados pelo yelbaixo seta em uma). c) Ajustar a função de ponto de difusão da molécula Cy3-DNA único com uma função gaussiana bidimensional. d) resíduos de montagem de c). e) contar Photon vs. número do quadro. f) Distribuição da número de fótons emitidos pela molécula Cy3 antes de fotodegradação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5 Myosin andar observado por Fiona. a) quadros de arquivo de dados de exemplo correspondente at = 0 segundos, 30 segundos e 60 segundos. A construção da miosina-Qdot está se movendo em um caminho reto e tem uma boa contagem de fótons (> 5.000) em cada quadro. B) Aplicação de FIONA a cada yie quadrolds um traço distância em relação ao tempo que é representada em vermelho. Um algoritmo de busca passo baseado no t-teste é utilizada para, em seguida, extrair passos individuais, e a saída é sobreposta em branco. Tamanhos de passo são rotulados em branco em unidades de nanômetros. C) Passos de vários traços são combinados em um histograma. Os tamanhos dos passos medidos são Gaussian distribuídos cerca de 35,8 ± 0,4 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6 Análise em fIONA quantum dots profundas em amostras de espessura. Uma) imagem fluorescente de QD 605 em sol-gel para Z = 280 um, com 90X de ampliação. B) A função de contagem de pontos do QD marcado em a). σ x = 2.6 nm, σ y = 2,3 nm. Cada unidade no eixo X e Y representa 266,7 nm. C) imagem fluorescente de QD 655 no tecido da córnea de coelho no Z = 223 um, com ampliação de 360X. D) O PSF do QD marcado em c). σ x = 2,2 nm, σ y = 3,6 nm. Cada unidade no eixo X e Y representa 44,4 nm. E) Fotos do tecido da córnea montado em uma lamela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Fiona é uma técnica para localizar a posição de um emissor fluorescente (fluoróforo orgânico ou quantum dot) com precisão nanométrica e resolução temporal de até 1 ms 4 a 8. Quando os fótons suficientes são coletados, esta técnica permite determinar a posição de um emissor fluorescente com muito mais precisão do que o limite de difração (~ 200 nm) e, portanto, esta técnica abre uma maneira de observar o que não tem sido visto com microscopia óptica convencional / tradicional 4 - 8. Desde sua invenção, Fiona tem sido aplicado com sucesso para observar caminhada de muitos motores moleculares, como myosins e kinesins. Mais recentemente, ele, juntamente com outros trabalhos 3,19, contribuiu para o processo de localização de certas técnicas emergentes super-resolução, tais como tempestades e PALM 13 e 16.

O passo fundamental para alcançar FIONA reside no número de fótons coletados, que é afetada por vários fatores. Por exemplo, a configuração de TIRFM utilizada para experiências de FIONA deve ser bem alinhados de tal modo que uma boa PSF (isto é, não esticada, não-estigma, etc) é conseguida e uma razão sinal-ruído para-razoável é obtido. Além disso, um objetivo com um alto valor de NA devem ser usados ​​a fim de recolher o maior número possível de fótons.

Para coletar mais fótons e, portanto, para aumentar a precisão de localização, diferentes métodos de catadores de oxigênio e reagentes têm sido exploradas para suprimir a fotodegradação e piscando 20 a 22. Dois métodos diferentes de remoção de oxigénio foram usados ​​no nosso laboratório. Um deles é "gloxy" solução (glicose oxidase e catalase) 20. O outro é o PCA / PCD descrito acima de 22. Os trabalhos anteriores imediatamente após a mistura, mas o pH da solução muda ao longo do tempo. Esta última continua a solução quimicamente inalterada, mas é necessário um tempo de incubação de 8 a 10 min.

As mostradas aqui, é também possível alargar fIONA para amostras de espessura, utilizando uma objectiva de imersão em água 60X com NA = 1.2. Este objectivo tem uma distância de trabalho mais longo (0,27 mm) do que o usado anteriormente objetiva de imersão em óleo de 100X (0,17 mm). Para trabalhar em amostras de espessura, microscopia de epi-fluorescência precisa ser usado. Embora a vantagem de baixo fundo de TIRFM é sacrificado, precisão nanométrica localização ainda é alcançável durante a utilização brilhantes pontos quânticos. Esta extensão irá ser útil na geração de imagens de tecido grosso e aplicações médicas.

A aplicação de fIONA é limitada em alguns aspectos. Em primeiro lugar, como a localização de precisão depende do número total de fotões recolhidos, a resolução temporal de fIONA é comprometido. Em segundo lugar, sozinho fIONA só pode ser aplicado a amostras escassamente rotulados. Em outras palavras, FIONA falhará se vários fluoróforos estão perto o suficiente como os PSFs sobrepõem. Além disso, o espalhamento de luz de emissão limita o application de FIONA em espessura do tecido-imaging.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo NIH Grants 068.625, Subsídios NSF 1063188 e Centro de Física de células vivas 0822613. agradecimentos especiais vão para o Dr. Marina Marjanovic no Instituto Beckman para Ciência Avançada e Tecnologia para o dom de olhos de coelhos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double-sided tape 3M ~75 µm thick
EMCCD camera Andor Technology DU-897E-CS0-#BV
Ultrasonic cleaner Branson 2510
Fluorescence filter set Chroma 49016
Actin polymerization buffer  Cytoskeleton  BSA02
Biotin G-actin Cytoskeleton  AB07
G-actin  Cytoskeleton  AKL95
General actin buffer  Cytoskeleton  BSA01
Laser shutter (with driver) Electro-Optical Products Corp.  SH-10-MP
IDL Exelis Visual Information Solutions
Neutravidin  Fisher Scientific PI-31000
Coverslip Fisherbrand  22X30-1.5 0.16-0.19 mm thick
Microscope slide Gold Seal Microslides  30103X1 0.93-1.05 mm thick
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Glass bottom dish  In Vitro Scientific D35-20-1.5-N
Cy3-DNA oligos Integrated DNA Technologies 5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Fluorescent beads  Invitrogen T-7280
Qdot 605-streptavidin  Invitrogen Q10101MP
Qdot605  Invitrogen Q21301MP
Qdot705 Invitrogen Q22021MP 
Qdot705 Antibody Conjugation Kit Invitrogen Q22061MP
MATLAB MathWorks
Optical table Newport Corp RS4000 Series
60X Objective Nikon Plan Apo VC 60x WI
100X Objective Olympus PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17
60X Objective Olympus UPlanApo 60X/1.20W
Inverted microscope Olympus IX71/IX70/IX81
Origin OriginLab
Anti-FLAG antibody Sigma Aldrich F7425-.2MG
ATP Sigma Aldrich A7699
BME  Sigma Aldrich 63689-25ML-F
BSA Sigma Aldrich A7906
BSA-biotin Sigma Aldrich A8549-10MG
CK Sigma Aldrich C3755 Creatine Phosphokinase from rabbit muscle
CP Sigma Aldrich P1937 Phosphocreatine di(tris) salt
DTT Sigma Aldrich 43815 DL-Dithiothreitol
EGTA Sigma Aldrich E3889 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid
HCl  Sigma Aldrich 93363-500G
HEPES  Sigma Aldrich H0887
KCl Sigma Aldrich P9333
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S7653
PCA Sigma Aldrich 03930590 Protocatechuic acid 
PCD Sigma Aldrich P8279 Protocatechuate-3,4-dioxygenase 
TMOS Sigma Aldrich 341436-25G Tetramethyl orthosilicate
Tris-HCl  Sigma Aldrich 93363
Trolox Sigma Aldrich 238813 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts Thorlabs  BB1-E02, KM100 Quantity: 2
½” diameter posts Thorlabs  TR4 Quantity ≥ 6
10X beam expander Thorlabs  BE10M-A
2” diameter f = 300 mm lens with mount Thorlabs  LA1256-A, LMR2 TIR lens
Fluorescent alignment target  Thorlabs  VRC2SM1
Laser safety goggles Thorlabs  LG3
ND filter(s) Thorlabs  FW1AND
Optical beam profiler Thorlabs  BP209-VIS
Post-mounted iris diaphragm Thorlabs  ID25 Quantity: 2
Shearing interferometer Thorlabs  SI100
XYZ translation stage, ½” travel  Thorlabs  T12XYZ
Laser World Star Technologies  TECGL-30 532 nm, 30 mW

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References

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