Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku

1Pharmaceutics & Pharmaceutical Chemistry, The Ohio State University
Published 8/02/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Azevedo-Pouly, A. C., Elgamal, O. A., Schmittgen, T. D. RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue. J. Vis. Exp. (90), e51779, doi:10.3791/51779 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Yüksek bütünlük RNA izolasyonu örneğin kuzey blot 9, qRT-PCR 1 ve 5 gen ekspresyonu gibi rutin moleküler biyoloji deneyleri için gereklidir. RNA izolasyonu çoğu modern yöntemler, guanidin tiyosiyanat protokolleri 2, modifikasyonları dayanmaktadır 3. Guanidin tiyosiyanat güçlü protein denatüran ve etkili bir çoğu durumda ribonükleaz aktivitesini bozacak. Chomczynski ve Sacchi 3'ün yaygın kullanılan yöntem, yaklaşık 4 saat için izolasyon süresini azaltmak, guanidin tiyosiyanat lizis çözeltisine fenol birleştirildi. Pek çok ticari olarak temin edilebilen RNA ekstraksiyon reaktifleri Chomczynski ve Sacchi yöntem 3 üzerine dayanır.

Bu tür insan veya fare gibi pankreas Ribonuclease zengin dokuların RNA'nın izole edilmesi için ek bir zorluktur. Fare pankreas bazıları Durin çıkacak ribonükleaz 6 kadar olan 75 mg içerebilirg doku otoliz sonuçlanan pankreas dokusunun bozulması. Guanidin tiyosiyanat protokollerin modifikasyonları başarılı bir şekilde yüksek bütünlüğü 2, 4, 7, 10, yüksek bütünlüğü 4, 7, 10, RNA fare pankreası kolaylaştırılmış izolasyon içine RNA stabilizasyonu reajanı. Infusion Ancak infüzyon of ile pankreasından RNA'yı izole etmek için kullanılmıştır pankreas içine çözümler, büyük bir beceri gerektirir böyle bir mikroskop ve işlem sırasında doku mimarisini bozan hücre parçalama neden olabilir gibi özel araçlar gerekebilir. RNA stabilizasyon reaktif ile dokuyu perfüze protein izolasyonu ve histolojik boyama gibi diğer uygulamaları ile etkileyebilir. Ayrıca, bu teknik, insan pankreasından RNA'nın izole edilmesi için uygun değildir. Diğer protokoller 2 araştırmacı tarafından özel çözümler hazırlanmasını gerektirir.

Biz fare pankreas yüksek bütünlük RNA izole etmek için bir protokol rapor. The protokolü daha önce yayınlanmış yöntemlerden elemanları içeren ve büyük ölçüde standart fenol / guanidin tiyosiyanat tabanlı liziz reaktif protokoller üzerine dayanır. Bu, özel bir çözeltilerin hazırlanmasını gerekli değildir, ne de pankreas içine reaktiflerin infüzyon gerektirir. Başarılı bir RNA izolasyonu için kritik adım doku oranı, elde edilen RNA çözeltiye ayırma ve bir ribonükleaz inhibitörü dahil faz önce sindirilmemiş doku çıkarılması için yüksek bir fenol / guanidin bazlı liziz reaktif içerir. Bu ve diğer değişiklikler kullanarak, tipik olarak daha büyük 7 rutin gen ekspresyon analizi için kullanılacak RIN ile RNA izole eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Hazırlık

Aşağıdaki uygulamalar Kurum'un Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen politikalara bağlı.

  1. Bu, herhangi bir gün içinde en fazla 6 fare pankreasları izole edilmesi tavsiye edilir. Temiz ve otoklav tüm cerrahi aletler, hayvan başına bir set var.
  2. Tüm Mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin. Hayvan başına dört 2 ml tüpler.
  3. Buz üzerinde bir 50 ml santrifüj tüplerine reaktifi ile 8 ml yerleştirin. Not: Saflaştırma kiti pankreas izolasyonu için uygun olan bir guanidin tiyosiyanat fenol maddesi ile birlikte olsa da, liziz reaktif nedeniyle izolasyon başına gerekli olan büyük hacimlerde kullanılır.
  4. Homojenleştirici ait bıçaklar temizlenmesi için bir 15 ml santrifüj tüplerine aşağıdaki çözümlerden yaklaşık 10 ml dağıtın. Etanol,% 70 (2 tüpler), HPLC dereceli su (1 tüp) yaklaşık 200 RNaz'ın ul Dışarıda veya eşdeğer ribonükleez inaktivatör içeren HPLC dereceli su.
  5. 2.. Cerrahi, Pankreas Diseksiyon ve Homojenleşmesi

    1. Pamuklu gazlı bez veya kağıt havlu içeren bir kavanoza izofluran 1-2 ml yerleştirin. Fareler izofluran kaynağını ulaşmasını engelleyen bir platform üzerine yerleştirilir. Öncesinde her fare anestezi için kavanoza taze isofluranın ekle.
    2. Yavaşça izofluran içeren kavanozun içine fare yerleştirin. Kavanoz kapağı ve yavaşça ileri ve geri kavanoz çevirerek anestezi etkilerini izlemek. Onun kendi durmak mümkün olduğunu bir kez hayvan anestezi.
    3. Anestezi teyidi için, kavanozdan hayvan kaldırmak ve sağlam bir ayak tutam uygulayın. Fare ayak tutam tepki vermezse, 2.5 adıma geçin.
    4. Fare ayak tutam tepki, o adımları 2,2-2,3 tekrarlayın.
    5. Yüzüstü pozisyonda tezgah üzerine anestezi hayvan yerleştirin. Sıkıca fare serviks üzerinde sol el koyarak mouse serviksini yerinden. Bizesağ fare kuyruğu kavramak ve hızlı bir şekilde rahim dağıtacağına yaklaşık yukarı bir 45 ° açı çekin ing.
    6. 25 gauge derialtı iğneler kullanarak düz bir yüzeyin içine hayvanın dört pençeleri her delici bir yüzeye (kağıt havlu ile kaplı strafor bir seviye parça) için karkas sabitleyin.
    7. Açık fare midsection kesti ve hızlı fare pankreas kaldırmak, steril cerrahi aletler kullanarak. Pankreas tutun ve yaylı makas kullanılarak dalak ve ince bağırsaktan kesmek için forseps kullanabilir. Fare çıkarılması sırasında pankreas germek için dikkatli olun. Doku bozulması Ribonuclease serbest olabilir. Not: Bu fare pankreas kaldırmak için gereken zamanı önemlidir. Yetenekli bir kişi, yaklaşık 1 dakika veya daha kısa bir pankreas incelemek gerekir.
    8. Soğuk lisiz tepkin maddesinin 8 ml içeren 50 ml'lik bir tüp içine tüm pankreas yerleştirin. Tüp kap ve kısaca ti öğrenmek sallamakayıraç içine ssue ve gecikmeden bir sonraki adıma geçin. Dokuya reaktifi oranı önemlidir. Liziz reaktifi farklı hacimleri kullanılarak izole RNA bütünlüğü bir karşılaştırma için sonuçlar bölümüne bakın.
    9. 5 sn için homojenize edilmiştir. Bu doku etkili homojenizasyon için bıçakların içine çekilmesine izin vermek için, santrifüj tüpünün dibine homojenleştirici bıçakları basın önemlidir.

    Sindirilmemiş Doku 3. Kaldırma

    Not: Homojenizasyondan sonra doku küçük bit reaktifi kalacaktır. Bu hızlı homojenleştirici ve RNA risk bozulması üzerine yerine sindirilmemiş bazı doku bırakarak dokuyu parçalamak için daha önemlidir.

    1. Transfer 2 ml mikrosantrifüj tüpüne lize pankreas ihtiva eden liziz reaktifi 2 ml. Izolasyon başına homojenat iki mikrosantrifüj tüpleri toplayın. Gelecekteki çalışmalar için -80 ° C'de kalan homojenatın veya mağaza atın.
    2. Sent4 ° C, sindirilmemiş doku pellet haline getirmek için 5 dakika için 12,000 x g'da rifuge. Bu büyük olasılıkla ribonüleaz (adım 5.13) ile numuneyi kontamine RNA sonraki çözümleri içine sindirilmemiş doku taşınmadan kaynaklanan gibi kritik bir adımdır.
    3. 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpü içine aktarın süpernatan 1 ml. Hemen izolasyonu ile devam edin ve gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de suret tüp saklayın. Bir sonraki aşamaya geçmeden ıslak buz üzerinde Homojenat içeren tüm tüpler yerleştirin.
    4. Uygun bir kimyasal atık yuvasına kalan reaktifi atınız.

    Homojenizetör Blades 4. Temizleme

    1. Bir sonraki izolasyon geçmeden önce,% 70 etanol, 10 ml yerleştirerek homojenleştirici bıçakları temizleyin. Bıçakları yakalanmış olabilir dokusunun herhangi parçalarını kaldırmak için 20 saniye boyunca yaklaşık için homojenizer etkinleştirin.
    2. Homogenizer bıçakları kalan herhangi parçaları kaldırmak için bir 200 ul pipet ucu kullanın. Suyu, genel Rnase inaktivatör ve% 70 etanol adımı tekrarlayın 4.1. Temiz Kim ile homojenleştirici şaft silin kurulayın.
    3. Kalan hayvanların pankreas izolasyonu için yineleyin 2.1, yerine RNA havuzu daha her hayvan ayrı izole tutmak RNA.

    5. RNA İzolasyon

    Aşağıdaki bölüm, saflaştırma kiti protokol ile aynıdır. Saflaştırma kiti avantajı küçük RNA'ların de dahil olmak üzere, toplam RNA izole olmasıdır.

    1. Dondurulmuş homojenat çözeltisi kullanılarak ise, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında beklemeye ıslak buz üzerinde ve çözülme sağlar.
    2. Kloroform 200 ul ekleyin, tüp kap ve 15 saniye boyunca elle kuvvetlice sallayın. Tüp, 2-3 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
    3. 12,000 xg, 4 ° C'de 15 dakika boyunca santrifüj
    4. Bir mikro santrifüj tüpüne üst Sulu tabakayı aktarın. Izopropanolün 1.5 sayılarını ve yukarı ve aşağı pipetleme birkaç kez iyice karıştırın.
    5. 70 kadar transfer2 ml'lik bir toplama tüpü içine yerleştirilen bir sıkma kolona numunenin 0 ul. Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 8000 x g'de santrifüj kapağı ve kapatın.
    6. Flow-through atın.
    7. Tekrar, numunenin geri kalanı ile, 5,5-5,6 adımları.
    8. Döndürme kolonuna 700 ul Tampon RWT ekleyin. 8,000 x g de 15 saniye boyunca santrifüjleyin. Flow-through atın.
    9. Spin kolon içine pipet 500 ul Tampon RPE. Sütunu yıkamak için 8.000 xg 15 saniye santrifüj. Flow-through atın.
    10. Döndürme kolonuna 500 ul Tampon RPE ekleyin. Sütunu kuru 8000 x g'de 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
    11. Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne spin kolon aktarın. Doğrudan spin kolon zar üzerine Pipet 80 ul ribonükleaz içermeyen su. RNA elüt edilmesi için 8000 x g 'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin.
    12. RNA çözeltisine, 1 ul Rnaz inhibitörü ekleyin. -80 ° C'de saklayın veya 5,13 geçin.
    13. RNA bütünlüğünü doğrulamak için, ilk olarak RNA conce hesaplamakBir spektrofotometre kullanılarak ntration ve 260/280 oranı.
    14. Moleküler biyoloji dereceli su ile yaklaşık olarak 500 ng / ul RNA çözeltinin bir bölümünün seyreltin.
    15. Kapiller elektroforez analizi kullanılarak RNA Dürüstlük (yani, Rin) belirleyin. RNA çözelti yaklaşık 5 ul analiz için yeterlidir.
    16. -80 ° C'de RNA çözeltisi (bkz. Şekil 2) ve mağaza alikotu

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Liziz Homojenat 1 ml toplam RNA verimi 20-40 ug'dır. OD 260/280 oranı tipik olarak yaklaşık 2.0 'dir ve RIN, 7.0' dan, daha geniş bir bulunmaktadır. RIN 6 ≤ ise, izolasyon tekrar edilmesi gerekecektir. Bazen, 8.0 'dan daha yüksek olan bir RIN elde edilir.

Önce pankreas kaldırılması için fareler ötenazi iki en yaygın olarak kullanılan yöntemler, CO 2 asfiksi ya da izofluran teneffüs bulunmaktadır. Her iki teknik, servikal dislokasyon ile takip edilmektedir. Bu kimyasal madde ve / veya işlem zaman RNA bütünlüğünü, her iki teknik karşılaştırılmıştır kullanılarak izole fare pankreas RNA RIN etkileyebilecek mümkündür beri. Fareler CO 2 boğulma veya izofluran inhalasyon kullanmaya anestezi uygulandı; Her iki teknik, servikal dislokasyon ile takip edildi. Öncesi servikal dislokasyon için, hayvanlara anastezi zamanı isofl göre CO2 ile boğularak için yaklaşık olarak 1-2 dakika daha uzunduURANE. Izofluran teneffüs aşağıdaki izole RNA CO 2 boğulma için 2.2 ± 0.3 RIN (p <10 -4, izolasyonların üç kopyalı, ortalama ± SD) göre 7.5 ± 0.31 bir RIN üretti. Ötenazi yöntemi RNA bütünlüğü üzerinde dramatik bir etkisi vardır ve izofluran inhalasyon tekniği 2 boğulma CO tercih edilir.

Liziz reaktifi 2, 4 ve 8 ml homojenize edildi fare pankreaslarından izole edilen RNA'nın bütünlüğü karşılaştırıldı. Biz, liziz reaktif hacmi artan ribonükleaz etkisizleştirme daha büyük bir dereceye kadar yol açacaktır varsayıldı. Reaktifi ile hacminin dışında, tüm şartlar protokolde listelenenlerle aynıdır. RNA bütünlüğü ve homojenleştirme (Şekil 1) kullanılan liziz reaktifi hacmi arasında doğrudan bir ilişki vardır. RNA RIN reaktifi ile 2, 4 ve 8 ml, sırasıyla 4.2, 6.5 ve 7.4, (ortalama olarak, üç kopya halindeki kullanıldığı izoleolations). Bu nedenle liziz reaktifi 8 mi Bu protokolde kullanılmalıdır.

Bazı deneyler için, aynı pankreasından RNA ve proteinin her ikisi de toplamak için gerekli olabilir. Örneğin, RNA qRT-PCR için kullanılabilir ve protein immünohistokimya kullanılarak görüntülenebilir. Bu durumda ise, baş-kuyruk yarısında pankreas kesmek için tavsiye edilir. Pankreas baş kuyruk anatomik farklılık bu önemlidir. RNA bütünlüğü olarak anlamlı bir farklılık pankreas yarısı ya da izole edilen RNA arasında bulunan göstermek için aşağıdaki deney yapılmıştır. RNA pankreas ilk yarısında izole edilmiştir. RIN bu RNA'dan belirlenen bu ilk yarısının hazırlaması sırasında yaklaşık 30 saniye boyunca oda sıcaklığında sonra, doymuş pankreas ikinci yarısında izole edilmiş RNA ile karşılaştırıldı. Pankreas ilk yarısı için RIN sonraki yarısı için 6.9 ± 0.55 bir RIN kıyasla 7.4 ± 0.20 idi. In pankreas kesme daBu şekilde pankreas sectioned ise, bu RNA analizi ve protein ikinci yarısında ilk yarısını kullanmak için tavsiye edilir, ribonükleaz ve RNA'nın sindirim serbest görünmüyor.

Lysis reaktif protein yapısını bozar ve bu nedenle ribonükleaz etkinliğini azaltır. Nedeniyle pankreasın mevcut ribonükleaz büyük miktarda, bazı aktif ribonükleaz liziz homojenat kalır ve bu ribonükleaz sulu faza dengeye olanaklıdır. Son RNA çözelti içinde kalan ribonükleaz bütünlüğü engel olacaktır. Bunun üstesinden gelmek için, RNA, sulu çözeltiye, bir ribonükleaz inhibitörü ilave edildi. RNA bütünlüğü vermedi birine ribonükleaz inhibitörü içeren bir RNA çözeltisi ile karşılaştırılmıştır. Bir donma çözülme üzerine inhibitörü ile RNA çözümü için RIN için (Şekil 2, p <0.001, izolasyonların üç kopyalı, ortalama ± SD) 2.9 ± 0.65 ile karşılaştırıldığında 7.3 ± 0.15 idiönleyicisi içermeyen çözelti. Başka bir sorun donma çözülme etkisiz hale getirerek inhibitörü ribonükleez denatüre edecek tekrarlanan ihtimalidir. Bu olasılığı incelemek için, RNA içeren ribonükleaz inhibitörü içeren bir çözelti, art arda dondurulup eritildi. Dondurulmuş ve 6 kez ya da daha yüksek olan çözülmüş, bu çözümler, 7'nin altında bir RIN (Şekil 2) ise üretilen dondurulmuş ve 5 kata kadar eritildi RNA çözümleri de 7 ya da daha yüksek bir RIN üretti. Bu dondurulmadan önce RNA çözeltisi eş-payı ve dondurma-eritme döngüsü sayısını sınırlamak için tavsiye edilir.

Bu yöntemin yararını göstermek için, izole edilmiş RNA üzerinde QRT-PCR uygulandı. Üçlü RNA izolasyonları gelen ortalama RIN 7.4 ± 0.20 idi (ortalama ± SD). Rastgele prime edilmiş cDNA RNA'dan sentezlendi ve üç temizlik genlerin ekspresyonu standart teknikler kullanılarak qPCR ile ölçülmüştür. Şekil 3, doğrular gösterilen verilerbaşarılı bir standart moleküler biyoloji tekniği fare pankreas RNA kullanmak için yeteneği.

Şekil 1
Doku oranı Şekil 1. Yüksek liziz reaktifi RNA bütünlüğünü arttırır. 2 (A, D) içinde homojenize edildi fare pankreaslarından izole edilen RNA bütünlüğü, 4 (B, E) ya da liziz reaktifi 8 (C, F) ml'dir karşılaştırılmıştır. Reaktifi ile hacminin dışında, tüm durumlar bu buluşun protokolde tarif olanlara özdeşti. Doğrudan bir korelasyon homojenleştirme ve RNA bütünlüğü kullanılan parçalama reaktifi ile hacim arasında bulunmaktadır. (G) ortalama ± SD, üç kopya halindeki izolasyon. p <0.05, ** p <0.001. görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız daha büyük bir versiyonuBu rakamın.

Şekil 2,
Şekil 2,. RNA sonunda tekrarlanan donma çözülme üzerine düşer. Fare pankreasında izole edilmiş RNA tekrar tekrar dondurulup ribonükleaz inhibitörü (RNaz I) 'in varlığında ya da yokluğunda eritildi. ± SEM, ** p <0.001 idi.

Şekil 3,
Şekil 3,. Fare pankreatik RNA QRT-PCR. RNA optimize protokol kullanılarak üç fare pankreaslarından izole edilmiştir. 18S rRNA, β-2 mikroglobulin ve snoRNA251 salgılama QRT-PCR (ortalama ± SD) kullanılarak belirlendi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zengin ribonükleaza olan dokulardan RNA izole moleküler biyoloji deneyleri için büyük bir sorun teşkil etmektedir. Çeşitli belirteçler, ve kitler öncelikle RNA ekstraksiyon fenol guanidin tiyosiyanat yöntemine bağlı ticari olarak temin dayanır ki. Guanidin tiyosiyanat protein denatüre ve böylece ribonükleaz etkinliğini azaltır. Ancak, pankreas ribonükleaz çokluğu bir RNA izolasyonu standart protokollere ek değişiklikler gerektirir. Standart bir protokol guanidin tiyosiyanat yöntemine göre olduğu bildirilmektedir henüz böyle pankreas gibi ribonükleaz zengin dokulardan RNA izolasyonu için başarılı bir çok önemli değişiklikler yanı sıra, ipucu içerir.

RNA'nın izole edilmesi için standart kurallar dikkat edilmelidir. Bu teknikler, daha az ribonükleaz zengin pankreas göre olan örneklerden, RNA başarılı bir izolasyon için kritik öneme sahiptir. Bazı örnekler moleküler biyoloji sınıf wa kullanmayı içerirter, ribonuclease-free sarf ve yerine cam daha atılabilir plastik eşya. Her izolasyon arasında eldiven değiştirmek için tavsiye edilir. RNA izole deneyimsiz birisi için, onlar önce pankreas RNA izole gerektirir çalışmalarına başlamadan karaciğer gibi ribonükleez-fakir örneklerinden veya hücre kültürlerinden RNA izole deneyim kazanmak önerilir. Mükemmel protokolleri başarılı RNA 8 ile çalışmak için puan çeşitli teklif var.

Fare pankreas yüksek bütünlüğü ile RNA izole etmek için bazı önemli faktörleri burada raporlanır. Bunlar, homojenleştirme sırasında kullanılan parçalama reaktifi ile hacmi ve RNA çözeltiye bir ribonükleaz inhibitörünün dahil bulunmaktadır. Ribonükleaz inhibitörü içeren bir yöntem iyi çalışır, bununla birlikte tekrarlanan donma çözülme çevrimi sonunda nedeniyle ribonükleaz inhibitörü denatüre olasılığı, RIN azaltacaktır. Belirtilmelidir ki, tüm RNA çözümler used Bu çalışmada önce RIN belirlenmesi için bir donma çözülme geçti. Donma çözülme üzerine bozulmasını azaltmak için bir başka yöntem bir çökelmiş biçimde 2 -20 ° C'de RNA çözeltisi depolamaktır. Bu, yani etanol kaldırılması ve önce RNA kullanarak pelet yeniden çözündürülmesi bir sakıncaya sahiptir. Fenol / guanidin tiyosiyanat reaktif protokolleri 2 ile karşılaştırıldığında, protokol avantajları, burada rapor parçalama maddesi ve özel bir çözüm ve tamponların hazırlık gerektirmeyen saflaştırma kiti ile çalışma basitliğidir. Ayrıca, bu protokol, başarılı bir şekilde fare pankreasında küçük RNA'ların izole etmek için kullanılabilir olduğunu belirtmek gerekir.

Ek ipuçları pankreas diseksiyon hızını ve önceki ötanazi (izofluran teneffüs 2 boğulma CO tercih edilir) anestezi yöntemi içerir. Pankreas ameliyatı uygulayan çeşitli girişimleri yüksek nitelikli bekliyorlar yapılması tavsiye edilirty RNA. Böyle dalak veya akciğer gibi ribonükleez zengin dokulara bu protokolün İntibak kolayca ulaşılabilir olmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Biz onların yararlı yorum, öneri ve protokol paylaşımı için Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul GRIPPO ve Satyanarayana Rachagani teşekkür ederim. Bu çalışma hibe U01CA111294 ve Ohio State Üniversitesi İntramural Araştırma Programı'ndan bir Fikir Geliştirme Ödülü ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Power Gen 500  Fisher Scientific 14-261-03  Homogenizer
5424R Eppendorf Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent Invitrogen 15596018 Lysis reagent
Student Vannas spring scissors Fisher 91500-09  Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch Fisher 08-951-20 Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps Fisher 1381239 Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP Abbott Labs 4/8/5210 Anesthetic
Rnase out (40 U/µl) Invitrogen 10777-019 Rnase inhbitor
Rnase Away Ambion 10328-011 General Rnase inactivator
HPLC grade water Fisher W5-4 For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water Hyclone SH30538.03 Elution of RNA
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free USA Scientific Plastics 1620-2700
15 ml centrifuge tubes Falcon 352099
70% ethanol Fisher
100% ethanol Fisher
200 µl pipet tips Rainin GPL200F For cleaning homogenizer blades
Chloroform Fisher BP1145-1
Nanodrop Thermo ND-1000 Spectrophotometer
Bioanalyzer Agilent Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater Ambion RNA Stabilization Reagent 
RNeasy spin columns  Qiagen Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice Chales River Strain C57BL/6 Their age ranged from 4 to 12 months.  
Mice  Jackson Lab strain 129 Their age ranged from 4 to 12 months.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  2. Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
  3. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  4. Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
  5. Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
  6. Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
  7. Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
  8. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).
  9. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
  10. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats