从小鼠胰腺RNA提取:核糖核酸酶丰富的组织

1Pharmaceutics & Pharmaceutical Chemistry, The Ohio State University
Published 8/02/2014
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Biology

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Summary

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Azevedo-Pouly, A. C., Elgamal, O. A., Schmittgen, T. D. RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue. J. Vis. Exp. (90), e51779, doi:10.3791/51779 (2014).

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Abstract

Introduction

需要常规的分子生物学实验,如Northern印迹9,定量RT-PCR检测1或基因表达谱5与诚信度高的RNA分离。大多数现代的RNA分离方法,是根据对硫氰酸胍协议2,修改3。硫氰酸胍是一种强的蛋白质变性剂,并有效地破坏大多数条件下核糖核酸酶的活性。 Chomczynski和Sacchi 3的流行的方法结合到苯酚的硫氰酸胍裂解溶液,减少了隔离时间约4小时。许多市售的RNA提取试剂基于Chomczynski和Sacchi方法3。

核糖核酸酶丰富的组织如人类或小鼠胰腺呈现为分离RNA一个额外的挑战。小鼠胰腺可含有高达75毫克核糖核酸酶6的其中一些将被释放超级碗造成组织自溶胰腺组织克中断。的异硫氰酸胍协议的修改已经被成功地用于分离RNA从胰腺具有高完整性2,4,7,10,输液RNA稳定剂与高完整性4,7,10的RNA小鼠胰腺促进隔离的,但是输注解决方案集成到胰腺需要很高的技巧,可能需要专门的工具,如解剖显微镜和手术过程中破坏的组织架构,可能会导致细胞裂解。组织灌注与RNA的稳定剂可能干扰其他应用,包括蛋白分离和组织学染色。此外,这种技术不适合于从人胰腺中分离RNA。其他协议需要由研究者2编制具体的解决方案。

我们报告一个协议来分离RNA从小鼠胰腺诚信度高。钍Ë协议使用先前公布的方法要素,并在很大程度上基于标准的酚/异硫氰酸胍基裂解试剂的协议。它不需要专门的解决方案的准备,也不需要输液剂进入胰腺。对于成功的RNA分离的关键步骤包括一个高酚/胍基裂解试剂对组织的比例,除去相分离和包容核糖核酸酶抑制剂到所得到的RNA溶液先未消化的组织。使用这些和其它的修改,我们通常分离RNA与RIN大于7被用于常规的基因表达分析。

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Protocol

1。准备

以下做法坚持以该机构的动物护理和使用委员会(IACUC)设置的策略。

  1. 建议在隔离不超过6小鼠胰腺中任何一天。让所有的手术器械清洁和灭菌,每只动物一组。
  2. 标记所有离心管。 4个2 ml离心管每只动物。
  3. 放置8毫升裂解试剂在冰上的50ml离心管中。注意:当纯化试剂盒自带的硫氰酸胍酚试剂,适合于胰腺分离,裂解试剂使用,因为大量是每个隔离必要的。
  4. 免除约10毫升以下解决方案集成到15ml离心管清洗均质机的叶片。乙醇,70%(2管),HPLC级水(1管)和HPLC级水约含200μLRNA酶的客场或同等核糖核酸酶灭活。
  5. 2,外科,胰腺解剖和同质化

    1. 将1-2毫升的异氟醚为含棉纱布或纸巾罐。将小鼠放置于阻止他们到达异氟醚的源的平台。加入新鲜的异氟醚的麻醉罐每只小鼠前。
    2. 轻轻将鼠标放到含有异氟醚的罐子。盖上瓶子并通过轻轻地转动瓶子来回监测麻醉的效果。动物被麻醉,一旦它在无法站立在它自己的。
    3. 为了确认麻醉,从罐子里取出的动物和应用坚定的脚趾捏。如果鼠标没有反应到脚趾捏,继续执行步骤2.5。
    4. 如果鼠标反应到脚趾捏,然后重复步骤2.2至2.3。
    5. 将动物麻醉的台式俯卧位。紧紧把左手放在鼠标的子宫颈脱臼鼠标的子宫颈。我们ing的右手抓住老鼠的尾巴,快速地向上拉以大约45°角脱臼子宫颈。
    6. 通过使用25号皮下注射针头的每个动物的四只爪子的刺入平坦面固定到胎体的表面(一个电平片发泡胶覆盖纸巾)。
    7. 用无菌手术器械,切断小鼠的中部开,并迅速从小鼠取出胰腺。使用镊子举行胰腺和使用弹簧剪刀从脾脏和小肠切开它。要小心,不要从鼠标的拆卸过程中拉伸胰腺。组织破坏可能释放核糖核酸酶。注意:它需要从鼠标移除胰脏的时间是至关重要的。本领域技术人员应该能够解剖胰腺在约1分钟或更少。
    8. 将整个胰腺入50毫升的试管装有8毫升冰冷的裂解试剂。盖上管,并简要摇沉浸在TISSUE到试剂和进行无延迟的下一个步骤。裂解试剂来组织的比例是至关重要的。看到结果的RNA的完整性使用不同体积的裂解试剂中分离出来的比较部分。
    9. 匀化,持续5秒。它以按均质叶片的离心管的底部,以允许组织被拉到到叶片效率均匀化是重要的。

    3,去除未消化的组织的

    注意:以下均质化,组织的小的位将保持在裂解试剂。它快速裂解组织留下一些未消化的组织,而不是通过均质化和RNA的降解风险是比较重要的。

    1. 转让2毫升裂解试剂的含有溶解的胰腺2ml微量离心管中。收集每隔离匀浆两个离心管。倒掉剩余的匀浆或储存在-80°C为今后的研究。
    2. 一分钱rifuge在4℃,12000×g离心5分钟以沉淀未消化的组织。这是一个重要的步骤,因为未消化的组织的残留成RNA的后续的解决方案可能会污染样品与核糖核酸(步骤5.13)。
    3. 转让将1ml上清液到2ml微量离心管中。与隔离,立即进行和复制管储存于-80℃以备将来使用。放置装有匀浆于湿冰,而继续进行下一个步骤的所有管道。
    4. 出售剩余裂解试剂到合适的化学废物容器。

    在均质机叶片4。清洁

    1. 前继续下一隔离,通过将它们放置在10毫升的70%乙醇清洗匀浆器叶片。激活有关的均化器进行20秒以除去组织可能被捕获在叶片任何块。
    2. 用200μl的枪头移除留在均质机叶片的任何碎片。 水,一般核糖核酸酶失活和70%乙醇重复步骤4.1。用干净的金均质轴擦拭。
    3. 对于其余的动物的胰腺隔离重复步骤2.1中,从每个动物单独的,而不是集中在RNA分离饲养的RNA。

    5,RNA分离

    下面的部分是相同的纯化试剂盒协议。纯化试剂盒的优点是,它会分离,包括小RNA的总RNA。

    1. 如果使用冷冻组织匀浆液,解冻湿冰上,静置在室温下5分钟。
    2. 加入200μl氯仿,帽管,并用手用力摇动15秒。让所述管支架在室温下2-3分钟。
    3. 离心15分钟,12,000×g离心,4°C。
    4. 传送上层的水层到微量离心管中。加1.5倍体积的异丙醇,并通过上下吹打数次调匀。
    5. 转让最多700微升的样品放入一个旋转柱是放置在2 ml收集管。盖上盖子,离心机在8000×g离心15秒在室温。
    6. 弃去流过。
    7. 重复步骤5.5-5.6,使用该样品的其余部分。
    8. 加入700μlBuffer RWT到离心柱。离心15秒,8,000×g的。弃去流过。
    9. 移液管将500μl缓冲液RPE到离心柱。离心15秒,8,000×g离心洗柱。弃去流过。
    10. 加入500μl缓冲液RPE到离心柱。离心2分钟在8000 XG干柱。
    11. 离心柱转移到1.5 ml离心管。吸取80微升核糖核酸酶的水直接喷在旋转柱膜。离心1分钟,在8000×g离心来洗脱RNA。
    12. 加入1μlRNA酶抑制剂的RNA溶液。储存在-80°C或进行至5.13。
    13. 为了验证RNA的完整性,首先计算RNA的conce使用分光光度计ntration和二百八十分之二百六十比。
    14. 稀释的RNA溶液的一部分以约500纳克/微升用分子生物学级别水。
    15. 确定RNA的完整性( RIN)利用毛细管电泳分析。约5微升RNA溶液是足够的分析。
    16. 分装的RNA溶液(参见图2),并存储于-80℃。

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Representative Results

从1毫升裂解匀浆的总RNA得率是20〜40微克。外径260/280的比例通常约为2.0和RIN比7.0更加一致。如果RIN是≤6,隔离将需要被重复。有时,RIN,比8.0更高的实现。

去除之前的胰腺实施安乐死的小鼠的两种最常用的方法是CO 2窒息或吸入异氟醚。后跟颈椎脱位两种技术。因为它是可能的化学剂和/或程序时,可能会影响RNA的完整性,用这两种方法进行了比较分离小鼠胰腺核糖核酸的RIN。小鼠用CO 2窒息或吸入异氟醚麻醉;这两种技术,随后进行颈椎脱位。前颈脱位麻醉动物的时间为约1至2分钟时间的CO 2窒息相比isoflurane。以下隔离吸入异氟醚的RNA产生7.5±0.31 RIN则为2.2±0.3 RIN(P <10-4,平均值±标准差,一式三份隔离)的CO 2窒息。安乐死的方法,对RNA的完整性产生重大影响和异氟醚吸入的技术最好CO 2窒息。

从匀浆中2,4和8毫升溶胞试剂,小鼠胰腺中分离RNA的完整性进行比较。我们推测,增加裂解试剂的体积将导致更大程度的核糖核酸酶的失活。除了裂解试剂的体积,在所有条件的那些相同的协议列出。有一个在均质和RNA完整性( 图1)所用裂解试剂的体积之间有直接的关系。 RNA的RIN使用2,4和8毫升裂解试剂为4.2,6.5和7.4,分别(平均一式三份是孤立olations)。因此8毫升裂解试剂应在本协议中使用。

对于一些实验中,可能有必要收集RNA和蛋白来自相同胰腺。例如,RNA可用于定量RT-PCR和蛋白质可以通过使用免疫组化进行可视化。如果是这种情况,建议从头部切成两半胰腺尾部。这一点很重要,因为胰腺解剖不同,从头部到尾部。为了演示,如果从胰腺的任一半分离的RNA之间是否存在于RNA的完整性的任何差异,进行了以下实验完成。 RNA从第一胰腺半隔离。的RIN从该RNA测定,比较该分离自胰腺的第二半后它的初始一半的后处理过程中坐在在室温进行约30秒的RNA。 RIN的胰腺的初始上半年为7.4±0.20相比,6.9±0.55为以后的半RIN。同时,减少胰腺中这样就不会出现释放核糖核酸酶和RNA的消化,如果胰脏被剖开,建议使用第一个一半用于RNA分析和第二半的蛋白质。

裂解试剂破坏蛋白质的结构,因此降低了核糖核酸酶的活性。由于大量的核糖核酸酶是存在于胰腺,它可能是某些活性的核糖核酸酶保持在裂解匀浆和这个核糖核酸酶将平衡到水相中。剩下的最后一个RNA溶液任何核糖核酸酶就会阻碍完整性。为了克服这一点,我们添加了核糖核酸酶抑制剂对RNA的水溶液。 RNA的完整性由含有核糖核酸酶抑制剂,以一个没有的RNA溶液进行比较。经1冻融时,RIN与抑制剂RNA的溶液为7.3±0.15相比,2.9±0.65( 图2,P <0.001,平均值±标准差,一式三份地隔离)的溶液不含有抑制剂。另一个问题是,反复冻融会变性核糖核酸酶抑制因子使之失效的可能性。为了检验这种可能性,含有RNA的核糖核酸酶抑制剂的溶液反复冻融。冷冻和解冻的高达5倍的RNA溶液仍在生产的7或更高的RIN而被冻结和解冻的6倍或更高,这些解决方案产生了RIN低于7( 图2)。这是推荐分装在冷冻之前将RNA溶液,并限制冻融循环的次数。

以证明该方法的有效性,进行了定量RT-PCR法对分离的RNA。平均RIN一式三份的RNA隔离为7.4±0.20(平均值±标准差)。为原料合成的RNA的随机引物的cDNA和3个管家基因的表达,使用标准技术通过qPCR测量。在图3中所示的验证数据我们成功地使用鼠标胰核糖核酸在一个标准的分子生物学技术的能力。

图1
图1:高裂解试剂来组织比例提高了RNA的完整性。的RNA从匀浆2(A,D)小鼠的胰腺中分离的完整性, 如图4(B,E)8(C,F)毫升裂解试剂是相比较。除了裂解试剂的体积,所有条件相同的那些中的协议描述。裂解试剂中的均质化和RNA完整性所用的量之间存在直接的关联。(G)的平均值±SD,一式三份地隔离。 P <0.05,** P <0.001。 请点击此处查看大图这个数字。

图2
图2。核糖核酸最终降解后,反复冻融。从小鼠胰腺中分离RNA的重复冷冻和解冻,在核糖核酸酶抑制剂(RNA酶I)的存在或不存在。平均值±标准差,** P <0.001。

图3
图3。小鼠胰腺RNA定量RT-PCR RNA从三个鼠标胰腺使用优化的协议隔离。 18S rRNA基因,β-2微球蛋白和snoRNA251的表达用实时定量RT-PCR(平均值±SD)来确定。

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Discussion

从被核糖核酸酶丰富的组织中分离RNA代表了分子生物学实验的一大挑战。各种试剂和试剂盒是市售的主要依据RNA提取的酚异硫氰酸胍法。硫氰酸胍变性蛋白,从而减少核糖核酸酶的活性。然而,核糖核酸酶在胰腺的庞大规模需要额外的修改,RNA分离标准协议。协议是在这里报道,基于标准的异硫氰酸胍法还包含几个关键的改进,以及提示RNA的核糖核酸酶丰富的组织如胰腺成功分离。

用于分离RNA标准指引是要注意的。这些技术的RNA分离成功的关键,甚至从标本较少核糖核酸富比胰腺。一些例子包括利用分子生物学级娃之三,核糖核酸酶无耗材和一次性塑料餐具,而不是玻璃。建议在更换手套在每个隔离间。对于有人谁是缺乏经验与分离RNA,建议他们获得与分离RNA核糖核酸酶从贫样品,如肝或细胞培养着手进行的工作,需要从胰腺中分离RNA之前的经验。优良的协议存在,提供了多种点的成功与合作的RNA 8。

被隔离的RNA从小鼠胰腺诚信度高的几个重要因素在这里报道。这些均质化过程中使用的裂解试剂的体积和夹杂物核糖核酸酶抑制剂的RNA溶液。包括核糖核酸酶抑制剂的方法效果很好,但反复冻融最终会降低RIN,可能是由于变性核糖核酸酶抑制剂。应当指出,所有的RNA解ÚSED在这项研究中通过一个冻融前RIN决定去了。减少因冻融降解的另一种方法是在-20℃下储存的RNA溶液中沉淀的形式2。这提供了一些不便,即除去乙醇,并使用RNA前重新溶解沉淀。相比于苯酚/异硫氰酸胍试剂协议2,该协议的优点报道这里是用裂解试剂和纯化试剂盒,不需要准备专用的解决方案和缓冲器的工作的简单性。还应当指出,这一协议已被成功地用于分离从小鼠胰腺小RNA。

其他提示包括胰腺解剖的速度和麻醉前安乐死(异氟醚吸入,优选为CO 2窒息)的方法。多次尝试在实践胰腺手术预期高QUALI之前建议TY的RNA。此协议核糖核酸酶丰富的组织如脾和肺的适应应该是容易实现的。

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Acknowledgements

我们感谢建华岭,雷蒙德·麦克唐纳,高尔文斯威夫特,米歇尔·格里芬,保罗格里波和Satyanarayana Rachagani了他们的宝贵意见,建议和分享他们的协议。这项工作是由授出U01CA111294从俄亥俄州立大学院内研究计划的理念发展奖的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Power Gen 500  Fisher Scientific 14-261-03  Homogenizer
5424R Eppendorf Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent Invitrogen 15596018 Lysis reagent
Student Vannas spring scissors Fisher 91500-09  Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch Fisher 08-951-20 Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps Fisher 1381239 Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP Abbott Labs 4/8/5210 Anesthetic
Rnase out (40 U/µl) Invitrogen 10777-019 Rnase inhbitor
Rnase Away Ambion 10328-011 General Rnase inactivator
HPLC grade water Fisher W5-4 For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water Hyclone SH30538.03 Elution of RNA
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free USA Scientific Plastics 1620-2700
15 ml centrifuge tubes Falcon 352099
70% ethanol Fisher
100% ethanol Fisher
200 µl pipet tips Rainin GPL200F For cleaning homogenizer blades
Chloroform Fisher BP1145-1
Nanodrop Thermo ND-1000 Spectrophotometer
Bioanalyzer Agilent Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater Ambion RNA Stabilization Reagent 
RNeasy spin columns  Qiagen Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice Chales River Strain C57BL/6 Their age ranged from 4 to 12 months.  
Mice  Jackson Lab strain 129 Their age ranged from 4 to 12 months.  

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References

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