العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نحن هنا وصف وسيلة فعالة لعزل، وتحديد، وتنقية الخلايا الظهارية الماوس الغدة الصعترية (TECS). ويمكن استخدام بروتوكول للدراسات وظيفة الغدة الصعترية التطور الطبيعي للخلايا T، خلل الغدة الصعترية، وإعادة الخلايا التائية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الغدة الصعترية هي جهاز حيوي لتنمية الخلايا اللمفاوية T. خلايا انسجة الغدة الصعترية، الغدة الصعترية الخلايا الظهارية (TECS) هي الحاسمة ولا سيما في مراحل متعددة من تطوير خلايا T: التزام الخلايا T، واختيار الإيجابية والسلبية الاختيار. ومع ذلك، يبقى فهم وظيفة TECS في الغدة الصعترية غير كامل. في المقالة، ونحن نقدم طريقة لعزل مجموعات فرعية من المجلس التنفيذي الانتقالي الغدة الصعترية الماوس جديدة باستخدام مزيج من اضطراب الميكانيكية والهضم الأنزيمي. طريقة تمكن خلايا انسجة الغدة الصعترية وthymocytes أن أفرجت كفاءة من خلية خلية والاتصالات مصفوفة خارج الخلية وخلايا لتشكيل تعليق خلية واحدة. باستخدام الخلايا المعزولة، multiparameter التدفق الخلوي يمكن تطبيقها على تحديد وتوصيف TECS والخلايا الجذعية. لأن TECS هي السكان الخلية نادر في الغدة الصعترية، ونحن أيضا وصف وسيلة فعالة لإثراء وتنقية TECS بواسطة المستنفدة thymocytes، نوع من الخلايا الأكثر وفرة في الغدة الصعترية. فولوجناح التخصيب خلية فرز الوقت يمكن انخفضت حتى يمكن التقليل من تلك الخسارة من بقاء الخلية خلال تنقية TECS. تنقية الخلايا هي مناسبة لمختلف التحليلات المصب مثل الوقت الحقيقي-PCR، لطخة غربية والتنميط التعبير الجيني. سوف بروتوكول تعزيز البحوث المتعلقة بالوظيفة TEC وكذلك تطوير في المختبر إعادة الخلايا التائية.

Introduction

في تطور الخلايا T في وقت مبكر، يتم تجنيد نخاع العظام الجذعية المكونة للدم المشتقة من خلية الأسلاف متعدد القدرات لقشرة الغدة الصعترية، والخضوع الالتزام T النسب وتصبح الخلايا التائية السلائف 1. في القشرة، T خلايا CD4 و CD8 السلائف النفي المزدوج (DN) thymocytes توسيع وتفرق في غير ناضج CD4 و CD8 إيجابية المزدوج (DP) thymocytes، وتشكيل مجموعة كبيرة من الأسلاف مع T متغير بدرجة كبيرة مستقبلات الخلايا 1. فقط اختر فرعية MHC المقيدة الخلايا موانئ دبي ستصبح CD4 أو CD8 إيجابية احد (SP) thymocytes، الهجرة إلى النخاع من الغدة الصعترية، وتفرق في الخلايا T الناضجة المختصة وظيفيا، وهو الحدث الذي يشار إليه اختيار إيجابية 2- 6. في المقابل، استنساخ thymocytes لصناعة السيارات في رد الفعل السلبية والخضوع الاختيار تتم إزالة عن طريق موت الخلايا المبرمج، وتحويلها إلى خلايا T التنظيمية للتسامح الذاتي، أو تحويلها إلى الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري لأغراض غير واضحة بعد 3،7-10.

في الغدة الصعترية، خلايا انسجة الغدة الصعترية تشكل المكروية فريدة توفير إشارات لهذه مصائر مختلف T تطوير خلية 5،11،12. وتتكون خلايا انسجة الغدة الصعترية من الخلايا الظهارية الغدة الصعترية (TECS) - بما في ذلك TECS القشرية (cTECs) وTECS النخاع (mTECs)، والخلايا الجذعية، الضامة، الخلايا الليفية، الخلايا البطانية، pericytes المستمدة قمة العصبية والخلايا الوسيطة الأخرى 13-15. من بين هؤلاء، TECS حاسمة في مراحل مختلفة من تطوير خلايا T 1،2،16،17. ومع ذلك، عدم وجود وسيلة قوية لعزل TECS أعاق فهم شامل لمهامهم 16. على وجه الخصوص، cTECs، والتي تشكل شبكة ثلاثية الأبعاد المحيطة بها الأسلاف في القشرة، ضرورية لاختيار إيجابية 13،18،19 لأسباب غير واضحة حتى الان. قدمت دراسات سابقة أدلة إلى عدم التجانس ودور TECS، وتعتمد في الغالب على الأدوات الشكلية والنسيجية 13 12،20. وهناك طريقة قوية وقابلة للتكرار لعزل TECS أمر أساسي لتحقيق توصيف غير متحيز من مجموعات فرعية TEC، التقييم الكمي والنوعي للوظائف TEC، وتوضيح آليات دعم cTECs كيفية اختيار إيجابية.

نظرا لندرة TECS في الغدة الصعترية والتفاعلات ضيقة أنها تشكل في الجهاز سليمة، وقد تم عزل TECS تحديا. ويستند بروتوكول الموصوفة هنا على الاكتشافات السابقة، الكواشف المتاحة حاليا، والتقنيات، ومعرفة هيكل وتكوين انسجة الغدة الصعترية. منذ ما يقرب من عقدين من الزمن، تم الإبلاغ عن عدة إجراءات لتفصيل أنسجة الغدة الصعترية 21-27، والتي كانت تستخدم أنزيمات مختلفة أثناء عملية الهضم، بما في ذلك التربسين، كولاجيناز وDispase. الرمادي وآخرون. مقارنة تلك الانزيمات في precedure من 28 عاما، وذكرت تحسن المنهجياتالتطوير التنظيمي مع الهضم متعددة الخطوات من الكوكتيلات انزيم 29 التي أصبحت تستخدم على نطاق واسع 20،30. ومع ذلك، هذا الأسلوب ينطوي على الوقت اللازم لإعداد طويل وخطوات عملية الهضم المعقدة والنتائج في أعداد الخلايا ونسب TECS متغير نهائي حتى في نفس الفوج الفئران 29،30. قبل عدة سنوات، Liberase انزيم الصف البحوث، والتي تحتوي على تنقية عالية كولاجيناز والتي البروتيني محايد لاستخدامها في أنسجة الغدة الصعترية التفكك 30. هنا، نحن تصف القائمة على بروتوكول الهضم Liberase، مع إجراءات الفصل الميكانيكي الأمثل، ويمكن أن ينتج عددا كبيرا من TECS قابلة للحياة من الأنسجة الماوس الغدة الصعترية. .

لإثراء خلايا انسجة فصلها، استخدمت الدراسات السابقة إما التدرجات كثافة المغناطيسي أو حبة فصل 21،29. ومع ذلك، كل الطرق تؤدي شديدة فقدت السكان معين من خلايا انسجة الغدة الصعترية، وخاصة سكان cTECs 29. القضاء السامة للخلايا والتقنيات بالغسل 12،31. بعد المقارنة بين هذه التقنيات، أنشأنا بروتوكول بالغسل الحالي للتخصيب TECS. الشرط طيف أثناء إجراء تخصيب يؤدي إلى موت الخلايا أقل وغير متحيزة وزيادة الانتعاش TEC.

تعليق خلية الغدة الصعترية معزولة وصفها في القسم 3 يمكن تطبيقها مباشرة في التدفق تحليل cytometric لتحديد وتوصيف فرعية TEC والخلايا الجذعية. يصف القسم 4 طريقة بسيطة ومفيدة لتحديد مجموعات فرعية المجلس التنفيذي الانتقالي باستخدام تدفق عداد الكريات multiparameter. يمكن للتجارب التي تسعى للحصول على cTECs تنقيته أو mTECs، والإثراء TEC وخلية فرز الإجراءات يمكن العثور عليها في القسم 5 و 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

في هذه الدراسة، والكبار - استخدمت (6 8 أسابيع) أنثى C57BL / 6 الفئران. تم شراء الفئران من المعهد الوطني للسرطان والحفاظ عليها في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض. وافقت جامعة جنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي مينيسوتا (IACUC) جميع التجارب على الحيوانات.

1. إعداد أدوات والمخازن

  1. تحضير محلول أنزيم (RPMI1640 المتوسطة مع 0.05٪ [ث / ت] من Liberase TH و 100 U / مل من الدناز I)، عازلة الألبومين الغني (1X PBS [كا 2+ / المغنيسيوم 2+ خالية] مع 0.5٪ المصل البقري الزلال و 2 ملي حمض الإيثيلنديامين Tetraacetic [EDTA])، FACS العازلة (1X PBS [كا 2+ / المغنيسيوم 2+ خالية] يحتوي على 1٪ مصل بقري جنيني [FBS] و 0.02٪ نان 3)، FACS فرز عازلة (1X PBS [كا 2+ / المغنيسيوم 2+ خالية] تحتوي على 2٪ FBS)، وRP10 المتوسطة (متوسطة RPMI-1640 توفيره مع 10٪ FBS).
  2. إعداد لوحات 10 بالغسل. تحضير 40 مل من محلول طلاء (0.01 ملغ / مل Gالشوفان مكافحة فأر مفتش في 0.1 M NaHCO 3 العازلة)، وإضافة 4 مل من محلول طلاء في كل 100 × 15 مم لوحة، دوامة واحتضان عند 4 درجات CO / N. تخلصي حل الأجسام المضادة وشطف لوحة باستخدام 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X لمدة 2 مرات، دوامة بقوة بين يشطف. تخزين مستعدة لوحات في 4 درجة مئوية.

2. حصاد الأنسجة الغدة الصعترية

  1. الموت ببطء الماوس في غرفة CO 2. وضع الحيوان على ظهره على حصيرة تشريح، دبوس القدمين على حصيرة والرطب الفراء عن طريق الرش مع الايثانول 70٪.
  2. جعل شق خط الوسط من خلال الجلد، بدءا من فوق فتح مجرى البول مباشرة الى الفك السفلي مع مقص وتوسيع شق أسفل إلى الركبتين على كلا الجانبين. شق يشبه رأسا على عقب "Y". سحب الجلد فضفاضة مرة أخرى على الجانبين، ويعلقون عليه إلى حصيرة تشريح.
  3. ثقب الحجاب الحاجز من الخنجري، وقطع أضلاعه على كل جانب تصل إلى نحو الترقوة، ثم رفع الأضلاع معملقط ويعلقون عليه إلى حصيرة تشريح. الغدة الصعترية هي فقط تحت الأضلاع، وتبدو مثل اثنين من فصوص بيضاء رقيقة تغمر القلب (الشكل 1). النسيج الضام المحيطة بفصل الغدة الصعترية، وسحب بلطف وإزالة زوج من فصوص الغدة الصعترية مع ملقط مسنن منحنية. مكان فصوص الغدة الصعترية في لوحة 6 جيدا تحتوي على 5 مل RPMI-1640.

3. إعداد خلايا التوتة اللحمية

  1. تقليم أي الأنسجة الدهنية والضامة المحيطة ونقل فصوص الغدة الصعترية لبئر جديد للوحة 6 جيدا تحتوي على 5 مل يعد حديثا حل الانزيم. جعل شقوق صغيرة في الفص الصعترية مع مقص غرامة، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. ماصة بلطف هضم الغدة الصعترية تصل الأنسجة وهبوطا 2 - 3 مرات باستخدام 5 مل ماصة للتفكك الأنسجة. جمع جزء طاف في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل الباردة العازلة الزلال الغنية لتحييد الانزيمات. الحفاظ على أنبوب جمع على الجليد. إضافة 2.5مل من محلول الإنزيم إلى الأنسجة المتبقية واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. أداء الانفعالات الميكانيكية لطيف مع حقنة 3 مل و 18 إبرة G لتفريق المجاميع. تجمع طاف في أنبوب جمع. إضافة 2.5 مل حل انزيم إلى الأنسجة المتبقية واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. تكرار الإثارة الميكانيكية لطيف مع حقنة 3 مل و 25 إبرة G، واحتضان لوحة إضافي من 5 - 10 دقيقة.
  5. بعد الهضم الكامل، بركة طاف في أنبوب جمع. الطرد المركزي أنبوب جمع في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق لجمع الخلايا. نضح السائل وتعليق الخلايا مكعبات في 10 مل الألبومين الغنية العازلة وتصفية العينة 100 مم من خلال شبكة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. ثم نفذ تحليل تدفق cytometic (القسم 4) أو TECS تخصيب (القسم 5).

4. تحديد TECS بواسطة التدفق الخلوي

  • إعداد الخلايا لتركيز النهائي من 4 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر في المخزن FACS لتلطيخ في 96 ذهابا وأسفل جيدا لوحة الاختبار والحفاظ على لوحة على الجليد. إضافة 20 ميكرولتر التيسير حل كتلة (مكافحة CD16 / CD32 الأجسام المضادة في 10 ميكروغرام / مل في المخزن FACS) إلى الخلايا واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة على الجليد. تدور لوحة في 400 x ج، 4 ° C لمدة 3 دقائق. تجاهل السائل من الآبار بواسطة عبها لوحة جهه لأسفل في الحوض.
  • تعليق الخلايا مكعبات في 100 ميكرولتر كوكتيل الأجسام المضادة (مكافحة CD45، -EpCAM، -MHC الدرجة الثانية، و-Ly51 الأجسام المضادة، وكتين UEA-1 المسمى مع fluorochromes مختلفة في الشركة المصنعة أوصى أو اختبار تركيزات المثلى من كل الأجسام المضادة في المخزن FACS )، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 20 دقيقة في الظلام. للتعويض، وصمة عار 1 × 10 6 خلايا تألقي مع كل فرد.
  • إضافة 100 ميكرولتر من العازلة FACS إلى كل بئر وتدور لوحة في 400 x ج، 4 ° C لمدة 3 دقائق. كرر الخطوة غسل واحدالوقت، وresuspend ثم الخلايا في 100 ميكرولتر FACS العازلة. نقل الخلايا إلى 12 × 15 مم الجولة القاع أنبوب FACS مليئة 300 ميكرولتر FACS العازلة. الحصول على العينات على تدفق عداد الكريات وتحليل البيانات باستخدام برامج التحليل FACS. يظهر استراتيجية النابضة المجلس التنفيذي الانتقالي في الشكل 2.
  • 5. إثراء TECS بواسطة بالغسل

    1. تدور باستمرار خلايا الغدة الصعترية (المعد في القسم 3) في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح السائل وتعليق الخلايا مكعبات في FACS عازلة فرز بتركيز 2 × 10 8 خلايا لكل مل في 15 مل أو 50 مل أنبوب مخروطي. إضافة الأضداد المضادة للCD90.2 (استنساخ 30-H12) (أو مكافحة CD45) في تركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل من تعليق خلية واحتضان خلايا بلطف على خلاط الدورية في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، ويغسل مع 5 - حجم 10X من RP10 المتوسط ​​وأنبوب الطرد المركزي في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. نضح السائل وresuspend الخلايا مكعبات فيRP10 المتوسطة بتركيز 1 × 10 7 لكل مل. إضافة 5 مل تعليق خلية إلى كل لوحة المغلفة بالغسل (المعد في الخطوة 1.3)، دوامة واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. دوامة بقوة. نقل supernatants في أنبوب مخروطي. شطف لوحة مرتين باستخدام RP10 المتوسطة وتجميع supernatants في أنبوب جمع.
    3. أجهزة الطرد المركزي أنبوب جمع في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح السائل وresuspend الخلايا مكعبات في 5 مل RP10 المتوسطة. إضافة تعليق الخلية إلى لوحة بالغسل جديدة، دوامة واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. جمع الخلايا شطف لوحة وبركة لهم في أنبوب مخروطي. مرة واحدة يتم إثراء TECS، وتدور أسفل الخلايا في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتعليق الخلايا في 5 مل FACS فرز العازلة.

    6. تنقية TECS بواسطة الفرز الخلية

    1. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وإعداد تعليق الخلية بتركيز 4 × 10 7 الخلايا في عازلة FACS الفرز. إضافة الأجسام المضادة ديcribed في القسم 4.4 إلى حل الخلية واحتضان خلايا بلطف على خلاط الدورية في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد تلطيخ، وغسل وتعليق الخلايا إلى تركيز 10 × 10 6 خلايا لكل مل من FACS العازلة الفرز.
    2. ترتيب مجموعات فرعية المجلس التنفيذي الانتقالي من خلال فوهة 100 ميكرومتر باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز. يتم جمع الخلايا مرتبة في 30٪ (V / V) FBS في RPMI-1640). مرة واحدة يتم فرز الخلايا، والخلايا الطرد المركزي في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والتحضير لتحليل المصب.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    باستخدام هذا البروتوكول، تمت إزالة جهاز الغدة الصعترية من الماوس الكبار (القسم 2) وتعليق خلية الغدة الصعترية تم إعداده على النحو المبين في القسم 3. تألف تعليق الخلية التي تم الحصول عليها من thymocytes، وخلايا انسجة المكونة للدم والمشتقة من خلايا انسجة غير المكونة للدم. يتم التعبير عن CD45 المكونة للدم عموم علامة على كلا thymocytes وخلايا انسجة المكونة للدم مثل الضامة والخلايا الجذعية. في المقابل، TECS ليست من أصل للدم ولا تعبر عن CD45 15. أجريت تلطيخ الخلايا وتحليل تدفق cytometric على النحو المبين في المادة 4.

    نوعين من مجموعات فرعية TEC، cTECs وmTECs، تنبع من المشترك ثنائية قوية TEC السلائف 15. كلا cTECs وmTECs تعبير عن جزيء EpCAM على سطحها 28. وبالتالي يمكن TECS بوابات وفقا ل-EpCAM الإيجابي والسلبي CD45 بواسطة التدفق الخلوي (الشكل 2A). cTECs وmTECs يمكن تمييزها من قبل اثنين من الكواشف: وLy51الأجسام المضادة التي تعترف غلوتاميل أمينوببتيداز التي أعربت عنها CTEC، وكتين الجولق الأوروبي راصة-1 (UEA-1) 28 التي تربط لMTEC (الشكل 2B). كلا mTECs وcTECs تعبير عن الطبقة MHC II جزيئات على سطحها (الشكل 2C و 2D). mTECs يمكن تصنيفها الى مزيد من MTEC إلى أعلى أدنى MTEC وهذا يتوقف على مستوى جزيئات MHC II (الشكل 2D). متوسط ​​عدد TEC في الغدة الصعترية هو حوالي 9 × 10 5. في المقارنات المباشرة، فإننا تعافى حوالي 8 مرات أكثر TECS باستخدام هذا البروتوكول انزيم Liberase أساس مقارنة بروتوكول متعددة الخطوات مع كولاجيناز / dispase 29 (الشكل 3).

    من أجل تقليل وقت الفرز وزيادة حيوية الخلايا اللحمية استردادها، قمنا بتطوير طريقة بالغسل في استنزاف thymocytes بسبب تعليق خلية الغدة الصعترية يتكون من أكثر من 95٪ thymocytes. وحضنت الخلايا معTI-CD90 الأجسام المضادة واستولت عليها لوحات المكسوة مسبقا والمحمولة. مقارنة بما كان عليه في خلايا الغدة الصعترية مستعدة كاملة (التخصيب مسبقا)، فقد ارتفعت نسبة TECS من أقل من 0.5٪ إلى أكثر من 15٪ في الخلايا بعد التخصيب (الشكل 4A و 4B). بالغسل مع مكافحة CD45 يمكن أيضا أن تستخدم إذا، على سبيل المثال، لا يحتاج المرء لاستعادة الخلايا الجذعية أيضا. في هذه الحالة، وزيادة تخصيب TEC إلى حوالي 80٪ (لا تظهر البيانات). بعد تخصيب الخلايا اللحمية التي كتبها بالغسل، ونسب فرعية TEC لم تغير (الشكل 4C و 4D)، مما يوحي بأن مجموعة فرعية واحدة أو أخرى لا تضيع انتقائي خلال بالغسل. مقارنة مع العينة قبل التخصيب، كان معدل استرداد TECS حوالي 85٪ (الشكل 4E).

    الشكل 1
    الشكل 1. الغدة الصعترية الماوس الزيتوز تشريح. تقع الغدة الصعترية فوق القلب في الصدر العلوية الأمامية. بعد خفض ورفع الأضلاع، ويتعرض اثنين من الفصوص البيضاء الغدة الصعترية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 2
    الشكل 2. تحديد CTEC وMTEC مع تحليل البيانات تدفق cytometric. تم تحليل عينات الخلايا الملون الغدة الصعترية باستخدام التدفق الخلوي. وتظهر ملامح نظام مراقبة الأصول الميدانية التمثيلية. تشير الأرقام إلى النسبة المئوية لكل السكان. (A) من الخلايا الحية، بوابة الأحداث CD45 سلبية وإيجابية EpCAM تمثل خلايا التكنلوجيا. (B) ضمن بوابة TEC، يتم فصل اثنين من السكان حسب مستوى Ly51 وUEA- 1. cTECs ديك عاليةإيه التعبير عن Ly51. mTECs ديهم مستوى أعلى من UEA-1. يتم التعبير عن جزيئات (C) MHC II كبير على cTECs. يتكون (D) mTECs من MHC II منخفض المجموعات الفرعية من السكان عالية وMHC II، والتي يشار إليها باسم منفصل MTEC عالية وMTEC منخفضة. الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 3
    الرقم 3. يسمح بروتوكول استنادا liberase غلات أعلى خلية من الغدة الصعترية من استخدام متعددة الخطوات كولاجيناز / dispase بروتوكول. تم إعداد خلايا الغدة الصعترية باستخدام متعددة الخطوات كولاجيناز / dispase بروتوكول نشرت سابقا أو هذا البروتوكول القائم على liberase. وقد تم تحليل مجموعتين من عينات التدفق الخلوي. (A) </ تظهر قوية> FACS التمثيلية الشخصية. الأرقام تشير النسب المئوية للخلايا TEC في كل مجموعة (B) مجموع أرقام خلية من TEC في الماوس الغدة الصعترية ترد في الرسم البياني بار. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري (ن> 3). وأجريت ثنائي الطرف، أونبايريد اختبار T باستخدام برنامج بريزم. P <0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 4
    ويبين الشكل 4. إثراء TECS بواسطة طريقة بالغسل. ملامح نظام مراقبة الأصول الميدانية للخلايا انسجة الغدة الصعترية قبل وبعد التخصيب. كانت ملطخة خلايا الغدة الصعترية أعدت مع الأجسام المضادة لمكافحة CD90. thymocytes-CD90 إيجابي يؤلف أكثر من 95٪ من خلايا الغدة الصعترية. أثناء إجراء تخصيب TEC، thymocytes هي capturإد والمنضب على مغلفة مسبقا لوحة بالغسل، وبالتالي إثراء TECS في طاف. (A) و (B)، وترد بوابات TEC. تظهر الأرقام أن نسبة TECS بين مجموع الخلايا الحية في البدء السكان (ما قبل التخصيب) أو بعد التخصيب (بعد التخصيب). (C) و (D)، وتظهر خلايا داخل CTEC وMTEC البوابات. عرض الأرقام والنسب المئوية للCTEC وMTEC في السكان TEC من كل مجموعة. أرقام (E) خلية من cTECs وmTECs في الماوس الغدة الصعترية وترد في الرسم البياني. يصار من 5 التجارب. "ما قبل" لتقف على عينة ما قبل التخصيب. "بوست" تقف على عينة بعد التخصيب؛ خطوط أفقية صغيرة تشير المتوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    في البروتوكول، الخطوات الحاسمة هي إعداد خلايا انسجة الغدة الصعترية (القسم 3) وإثراء TECS (القسم 4). ويوصى بشدة أن يتم تحضير محلول أنزيم جديد في كل مرة ويتم التعامل مع الأنسجة في أقرب وقت ممكن. لالتوتة المجمعة، وتحسين حجم محلول أنزيم مطلوب تبعا لعدد من التوتة. إذا تم ترك أي بقايا الأنسجة بعد المعالجة، وإضافة المزيد من حل الانزيم وتمديد فترة حضانة يمكن زيادة الغلة الخلية. خلال إثراء TECS، واستكمال جمع من طاف وتكرار شطف وحة المبينة في القسم 5.3 سيقلل فقدان الخلية.

    في عام 1980، Wekerle وآخرون. لاول مرة نوع من TECS - "خلايا ممرضة الغدة الصعترية" (عبر الوطنية) 33، وهي الخلايا الظهارية القشرية الكبيرة التي تغلف تماما العديد من الخلايا اللمفاوية قابلة للحياة ضمن حويصلات داخل الخلايا. في عام 1982، وصفت وKyewski كابلان مختلف العزلة كوندitions التي تؤثر على إنتاجية الشركات عبر الوطنية 34. مؤخرا، النظر تاكاهاما وزملاؤه العزلة وخصائص الشركات عبر الوطنية. حددوا هذه الخلايا على أساس تفضيلي لتلطيخ CD45 إلا بعد الغشاء permeabilization 35. كما وصفوه "كسر" الشركات عبر الوطنية في إعدادها، والتي تتألف من CTEC وthymocytes المربوطة متعددة. كانت تلك المكسورة TNC إيجابية للخارج الخلية CD45 وللعلامة β5t CTEC وتتألف من 70٪ من إجمالي cTECs في إعدادها. في الواقع، ونحن أيضا احظ السكان الخلية مماثل، الذي كان CD45 EpCAM عالية + + في وLy51 لدينا استعداد تعليق خلية الغدة الصعترية، على الرغم من أن تضم أقل من 40٪ من إجمالي cTECs مع إجراء العزل لدينا. تتم إزالة هذه الشركات عبر الوطنية من كسر بروتوكولات التخصيب TEC، مثل بلدنا، التي تستخدم إما مع نضوب أو CD90 CD45. وبالتالي، فإن التحدي يكمن مستقبلا في تقليل الخسائر من هذه الفئة من السكان.

    مقارنةإلى إجراءات متعددة الخطوات الهضم القائمة 29، البروتوكول Liberase الهضم يسمح العائد الخلية أعلى بكثير من TECS (الشكل 3). وذكرت جماعات أخرى أيضا أساليب جديدة من أجل انسجة الغدة الصعترية العزلة خلية عن طريق تعديل طريقة غراي 30،36، على الرغم من العائد الخلية كانت لا زيادة كبيرة. مؤخرا، Chidgey وزملاؤه ذكرت مستقل بروتوكول TEC باستخدام Liberase الهضم وحصلوا أيضا الإفراج الفعلي من TECS 37. ومع ذلك، فإن أول خطوة الافراج عن خلية توتية من بروتوكول الخاصة بهم لديها القدرة على تجاهل حوالي 1.6 × 10 4 TECS من كل الغدة الصعترية 29، معظمها cTECs. نظرا لكثافة تخصيب الانحدار تسبب فقدان الخلايا اللحمية الصغيرة، يتم استخدام نضوب CD45-microbead استنادا AutoMACS-شعبيا لإثراء TECS قبل FACS تنقية 29،36،37. مقارنة تخصيب مقرها AutoMACS باستخدام بروتوكولات استنزاف CD45-microbead 29، وبالغسل تخصيب الحصول على معدلات الشفاء أعلى من TECS. وعموما، فإن بروتوكول المقدمة هنا المجاميع عددا من المزايا عنها سابقا. مجموعات فرعية TEC تنقيته مع هذا البروتوكول (القسم 6) وقد استخدمت بنجاح لمزيد من التحليل، مثل الوقت الحقيقي-PCR وتحليل لطخة غربية 12.

    هذا البروتوكول هو أيضا مناسبة لعزل ودراسة خلايا انسجة الغدة الصعترية أخرى مثل الخلايا الجذعية. ونحن نعتقد أن العزلة قوية من خلايا انسجة الغدة الصعترية، وخاصة TECS، سيسرع فهم كيفية عمل الغدة الصعترية للتنمية الخلايا T وتحقيق في المختبر T الدستور الخلية. وعلاوة على ذلك، وتوصيف هذه الخلايا له قيمة عملية كبيرة للمجتمع الطبي، لأن مشكلة مشتركة مع التعافي من العلاجات (مثل تلك المستخدمة في زرع وعلاج السرطان) رديئة إعادة تشكيل الخلايا الظهارية في الغدة الصعترية مما يؤدي إلى نقص المناعة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

    Acknowledgments

    وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 AI088209 (إلى KAH). كما نشكر جامعة مينيسوتا التدفق الخلوي الموارد.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
    2. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
    3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
    4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
    5. Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
    6. Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
    7. Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
    8. Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
    9. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
    10. Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
    11. Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
    12. Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
    13. Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
    14. Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
    15. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
    16. Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
    17. Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
    18. Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
    19. Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
    20. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
    21. Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
    22. Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
    23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
    24. Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
    25. Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
    26. Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
    27. Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
    28. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
    29. Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
    30. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
    31. Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7, (Unit 7.3), (2001).
    32. Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3, (Unit 3.5), (1991).
    33. Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
    34. Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
    35. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
    36. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
    37. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).

    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics