Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь мы опишем эффективный метод изоляции, идентификации и очистки мыши тимуса эпителиальных клеток (ТИК). Протокол может быть использован для изучения функции тимуса для нормального развития Т-клеток тимуса, дисфункции и восстановления Т-клеток.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Тимус является жизненно важным органом для развития Т-лимфоцитов. Из тимуса стромальных клеток, тимуса эпителиальные клетки (ТИК) имеют особенно важное значение в нескольких этапах развития Т-клеток: Обязательство Т-клеток, положительно отбора и отрицательного отбора. Тем не менее, функция ТИК в тимусе остается полностью поняты. В статье, мы предлагаем способ, чтобы изолировать TEC подмножества из свежего тимуса мыши, используя комбинацию механического разрушения и ферментативного расщепления. Метод позволяет тимуса стромальных клеток и тимоцитов, чтобы быть эффективно выпущен из клетка-клетка и матричных соединений клеток с внеклеточным и образуют единую-клеточной суспензии. Использование изолированных клеток, цитометрии потока многопараметрических могут быть применены к идентификации и характеризации ТИК и дендритных клеток. Потому что ТИК являются редким клеточная популяция в тимусе, мы также описать эффективный способ обогатить и очистить ТИК истощая тимоцитов, самый распространенный тип клеток в тимусе. ФоллоКрыло обогащение, сортировки клеток время может быть уменьшено, так что потери жизнеспособности клеток может быть сведено к минимуму во время очистки ТЭМ. Очищенные клетки пригодны для различных последующих анализов, как Real Time-ПЦР, Вестерн-блоттинга и экспрессии генов профилирования. Протокол будет способствовать исследование функции TEC и, а также развитие в пробирке Т-клеток восстановления.

Introduction

В начале развития Т-клеток, костного мозга гемопоэтических стволовых клеток, полученных предшественники мультипотентные рекрутируются в коре тимуса, пройти приверженность T линии и стать Т-клеток предшественников 1. В коре, Т-клеток-предшественников CD4 и CD8 Double Negative (DN) тимоциты расширить и дифференцировать в незрелых CD4 и CD8 двойной положительный (DP) тимоцитов, образуя большой пул предшественников с сильно варьирует Т клеточных рецепторов 1. Только выберите MHC-ограничено подмножество DP клеток станет CD4 или CD8 сингл положительные (SP) тимоциты, мигрируют в костный мозг тимуса, и дифференцируются в функционально компетентных зрелых Т-клеток, мероприятие, известное, как позитивной селекции 2- 6. В отличие от этого, клоны аутореактивных тимоцитов пройти негативный отбор и удаляются с помощью апоптоза, преобразуется в регуляторных Т-клеток для аутотолерантности, или направлены в внутриэпителиальных лимфоцитов в целях, которые еще ​​не ясно, 3,7-10.

В тимусе, тимуса стромальных клеток образуют уникальный микросреду, обеспечивающую сигналы для этих различных судеб развития клеток Т 5,11,12. Стромальные клетки тимуса состоят из эпителиальных клеток тимуса (ТИК) - в том числе коры головного мозга (ТЭМ) и cTECs сердцевинных ТЭМ (mTECs), дендритные клетки, макрофаги, фибробласты, эндотелиальные клетки нервного гребня, полученных перицитов и других мезенхимальных клеток 13-15. Среди них, ТИК имеют решающее значение на разных этапах T развития клеток 1,2,16,17. Тем не менее, отсутствие надежной образом, чтобы изолировать ТИК препятствует полное понимание своих функций 16. В частности, cTECs, которые образуют трехмерную сетку, окружающую клетки-предшественники в коре головного мозга, имеют важное значение для позитивной селекции 13,18,19 по причинам, которые еще ​​не ясна. Более ранние исследования условии поможет понять, неоднородности и роли ТИК, в основном опираясь на морфологических и гистологических инструментов 13 12,20. Надежным и воспроизводимым способом изолировать ТИК является основополагающим для достижения объективную характеристику ТИК подмножеств, количественной и качественной оценки функций избирательных комиссий, и разъяснение механизмов, как cTECs поддерживает положительный выбор.

В связи с редкостью ТИК в тимусе и плотных взаимодействий они образуют в неповрежденной органа, изоляция ТИК был сложным. Протокол, описанный здесь, основаны на предыдущих открытий, имеющихся в настоящее время реагентов, методов и знания о структуре тимуса и стромы состава. Почти два десятилетия назад, было зарегистрировано несколько процедур разбить тимуса ткани 21-27, на которых были использованы различные ферменты в процессе пищеварения, в том числе трипсина, коллагеназы и диспаза. Серый и др. сравнил эти ферменты в их precedure 28, и сообщали об улучшении метамфетаминод с многошаговое переваривания ферментов коктейлей 29, которые стали широко использоваться 20,30. Тем не менее, этот метод включает в себя много времени на подготовку и сложные шаги пищеварения и приводит к переменной окончательное количество и долю ТИК клеток даже в том же мышиного когорты 29,30. Несколько лет назад, Liberase исследования сорт фермент, содержащий высокоочищенный коллагеназы и нейтральной протеазы начал использоваться в ткани вилочковой железы диссоциации 30. Здесь мы описываем Liberase пищеварение основе протокола, с оптимизированными процедурами механического разделения, который дает большое количество жизнеспособных ТИК от мыши тимуса тканей. .

Для обогащения диссоциированных стромальных клеток, предыдущие исследования использовались либо градиентов плотности или магнитной сепарации борта 21,29. Тем не менее, оба метода приводят к тяжелым потеряли некоторых популяций тимуса стромальных клеток, в частности населения cTECs 29. Цитотоксическая устранение и панорамирования методы 12,31. После сравнения этих методов, мы установили текущий протокол панорамирования для обогащения ТИК. Нежное состояние во время процедуры обогащения ведет к меньшему гибели клеток и беспристрастным и повышение уровня возмещения TEC.

Выделенный подвеска тимус клеток описано в разделе 3 могут быть непосредственно применены течь анализ цитометрический для идентификации и характеризации ТИК подмножеств и дендритных клеток. Раздел 4 описывает простой и удобный способ определения TEC подмножества, используя многопараметрическое проточного цитометра. Для экспериментов, которые стремятся получить очищенные cTECs или mTECs, обогащение TEC и сортировки клеток процедуры можно найти в разделе 5 и 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

В этом исследовании, взрослых - были использованы (6 8 недель) женщины C57Bl / 6 мышей. Мыши были приобретены у Национального института рака и поддерживается при определенных патогенов условиях. Университет Миннесоты институционального комитета уходу и использованию животных (IACUC) утвердил все экспериментов на животных.

1 Подготовка инструментов и буферов

  1. Готовят раствор фермента (RPMI1640 среды с 0,05% [вес / объем] из Liberase TH и 100 ед / мл ДНКазы I), альбумина, богатых буфера (1X PBS [Ca2 + / Mg 2 + -бесплатный] с 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА]), FACS буфера (1X PBS, [Ca2 + / Mg2 + -бесплатный], содержащий 1% фетальной бычьей сыворотки [ФБС] и 0,02% NaN 3), FACS буфера сортировки (1X PBS, [Ca 2 + / Mg 2 + -бесплатный], содержащий 2% FBS) и RP10 среды (RPMI-1640 поставляется с 10% FBS).
  2. Подготовьте 10 панорамирования пластины. Готовят раствор для покрытия 40 мл (0,01 мг / мл Gовса анти-IgG крысы в 0,1 М NaHCO 3 буфера), и добавить 4 мл раствора для нанесения покрытия в каждом 100 х 15 мм пластины, вихря и инкубируют при 4 ° CO / N. Выливают раствор антитела и промыть пластины с использованием 5 мл 1х PBS в течение 2 раза, вихревой энергично между полосканий. Хранить готовые пластины на 4 ° С.

2 Урожай ткани вилочковой железы

  1. Усыпить мышь в CO 2 камеры. Положите животное на спину на рассечение коврик, придавить ноги на коврик и влажный мех путем распыления с 70% этанола.
  2. Сделайте срединный разрез через кожу, начиная сверху отверстие мочеиспускательного канала прямо до нижней челюсти с помощью ножниц и продлить разрез вниз до колен с обеих сторон. Разрез выглядит как перевернутая "Y". Потяните дряблая кожа назад по бокам, и вывод его на рассечение мат.
  3. Прокол диафрагму от мечевидного, вырезать ребра с каждой стороны примерно до ключицы, затем поднимите ребра сщипцы и вывод его на рассечение мат. Тимус только под ребра, и выглядит как два тонких белых лепестков вышележащих сердце (рисунок 1). Отключите соединительной ткани, окружающей тимус, осторожно потяните и снимите пару тимуса долях с изогнутыми зубчатыми щипцами. Место тимуса доли в 6-луночного планшета, содержащего 5 мл RPMI-1640.

3 Получение тимуса стромальных клеток

  1. Обрезать любой окружающей жира и соединительной ткани и передавать тимуса долей на новую лунку 6-луночного планшета, содержащего 5 мл свежего энзимного раствора подготовки. Сделать небольшие разрезы в тимусе лепестков с тонких ножниц, и инкубируют планшет при 37 ° С в течение 20 мин.
  2. Аккуратно пипетки переваривания ткани вилочковой железы вверх и вниз 2 - 3 раза, используя 5 мл пипетки для ткани диссоциации. Собирают фракцию супернатанта в 50 мл пробирку, содержащую 10 мл холодного богатого альбумина буфер для нейтрализации ферментов. Держите пробирку на льду. Добавить 2,5мл раствора фермента к оставшейся ткани и инкубируют планшет при 37 ° С в течение 15 мин.
  3. Выполнение нежный механическое перемешивание с помощью шприца 3 мл и 18 G иглу, чтобы разбить агрегаты. Бассейн супернатант в пробирку. Добавить 2,5 мл раствора фермента к оставшейся ткани и инкубируют планшет при 37 ° С в течение 15 мин.
  4. Повторите нежный механическое перемешивание с помощью шприца 3 мл и 25 G иглы, и инкубировать пластины дополнительные 5 - 10 мин.
  5. После полного переваривания, бассейн супернатант в пробирку. Центрифуга коллекция трубка на 400 мкг, 4 ° С в течение 8 мин до сбора клеток. Аспирируйте жидкости и приостановить осажденные клетки в 10 мл альбумина богатых буфера и фильтруют через образец 100 мм меш. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Затем выполните потока cytometic анализ (раздел 4) или ТИК обогащение (раздел 5).

4 Идентификация ТИК цитометрическим

  • Подготовка клеток в конечной концентрации 4 × 10 6 клеток на 100 мкл в FACS буфере для окрашивания в 96 и круглым дном тестовой пластины и удерживать пластину на льду. Добавить 20 мкл раствора блок-Fc (анти-CD16 / CD32 антитело при 10 мкг / мл в FACS буфере) к клеткам и инкубировали клетки в течение 10 мин на льду. Вращайте пластину при 400 мкг, 4 ° С в течение 3 мин. Откажитесь жидкости из скважин, щелкая пластины лицом вниз в раковину.
  • Приостановить осажденные клетки в 100 мкл коктейля антител (анти-CD45, -EpCAM, -MHC класса II, и -Ly51 антитела, и UEA-1 лектин помечены различными флуорохромами на рекомендованные производителем или проверенные оптимальные концентрации каждого антитела в FACS буфере ), и инкубируют клетки на льду в течение 20 мин в темноте. Для компенсации, окрасить 1 х 10 6 клеток с каждой отдельной флуорохромом.
  • Добавить 100 мкл FACS буфера в каждую лунку и спин пластину при 400 мкг, 4 ° С в течение 3 мин. Повторите мыть Шаг первыйВремя, а затем ресуспендируют клетки в 100 мкл FACS буфера. Перенесите клетки к 12 х 15 мм с круглым дном FACS трубки, заполненной 300 мкл FACS буфера. Приобретать образцы на проточном цитометре и анализировать данные с помощью программного обеспечения FACS анализа. TEC стратегия стробирования показано на рисунке 2.
  • 5 Обогащение ТИК по Панорамирование

    1. Спином вниз клетки тимуса (полученного в разделе 3) при 400 мкг, 4 ° С в течение 5 мин. Аспирируйте жидкости и приостановить осажденные клетки в FACS буфере сортировки при концентрации 2 х 10 8 клеток на мл в 15 мл или 50 мл коническую пробирку. Добавить анти-CD90.2-антителом (клон 30-H12) (или анти-CD45) в конечной концентрации 2,5 мкг / мл клеточной суспензии и инкубируют клетки осторожно на вращающемся смесителе при температуре 4 ° С в течение 30 мин. После инкубации промыть с 5 - 10-кратным объемом RP10 среды и центрифугировать пробирку при 400 мкг, 4 ° С в течение 5 мин.
    2. Аспирируйте жидкости и ресуспендирования клеток осаждали вRP10 среде при концентрации 1 × 10 7 на мл. Добавить суспензии 5 мл клеток в каждой покрытой пластине (панорамирования, полученного в стадии 1,3), вихря, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Вихревой энергично; передавать супернатантов в коническую пробирку. Промыть пластины в два раза, используя RP10 среды и объединить супернатантами в пробирку.
    3. Центрифуга пробирку при 400 мкг, 4 ° С в течение 5 мин. Аспирируйте жидкости и ресуспендируйте осажденные клетки в 5 мл RP10 среды. Добавить клеточной суспензии на новый панорамирования пластины, вихревой и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Собирают клетки промыть пластины и объединить их в конической трубе. После того, как ТЭМ обогащены, спин вниз клетки при 400 мкг, 4 ° С в течение 5 мин и приостановить клеток в 5 мл FACS буфера сортировки.

    6 Очистка ТИК по сортировки клеток

    1. Количество клеток с использованием гемоцитометра и подготовить суспензии клеток в концентрации 4 х 10 7 клеток в FACS буфере сортировки. Добавить антитела дезcribed в разделе 4.4 в раствор клеток и инкубируют клетки осторожно на вращающемся смесителе при температуре 4 ° С в течение 30 мин. После окрашивания, мыть и приостановить клеток до концентрации 10 × 10 6 клеток на мл FACS буфера сортировки.
    2. Сортировать TEC подмножества через 100 мкМ сопло с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток. Сортировка клеток собирают в 30% (объем / объем) FBS в RPMI-1640). После сортировки клеток делается, центрифуги клетки при 400 мкг, 4 ° С в течение 5 мин и подготовки к последующей анализа.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Используя этот протокол, тимус орган был удален из взрослой мыши (раздел 2) и вилочковой суспензии клеток получали, как описано в разделе 3 получены суспензии клеток состояла из тимоцитов, кроветворных стромальных клеток и некроветворных стромальных клеток. CD45 представляет собой гемопоэтические пан-маркер экспрессируется на обоих тимоцитов и гемопоэтических стромальных клеток, таких как макрофаги и дендритные клетки. В отличие от этого, ТИК не кроветворной происхождения и не выражают CD45 15. Окрашивание клеток и анализ проточной цитометрии проводили, как описано в разделе 4.

    Два типа TEC подмножеств, cTECs и mTECs, исходят из общей би-мощным TEC предшественника 15. Оба cTECs и mTECs экспрессируются молекулы EpCAM на своей поверхности 28. Таким образом ТЭМ могут быть закрытого типа в соответствии с EpCAM-положительных и CD45-отрицательными с помощью проточной цитометрии (фиг.2А). cTECs и mTECs можно отличить по двум реагентов: Ly51антитело, которое распознает глутамилтранспептидазы аминопептидаза выраженную CTEC, и лектин Улекс Europaeus агглютинин-1 (UEA-1) 28, который связывается с Mtec (Рисунок 2B). Оба mTECs и cTECs выразить молекул МНС класса II на своей поверхности (Рисунок 2C и 2D). mTECs могут быть разделены на Mtec с низкой и Mtec максимума в зависимости от уровня молекул МНС II (2D) Рис. Среднее число TEC на тимуса составляет около 9 х 10 5. В прямых сравнений, мы восстановился примерно в 8 раз больше ТИК с помощью этого Liberase протокол, основанный фермента по сравнению с многоступенчатой ​​протокола с коллагеназы / диспаза 29 (рисунок 3).

    Для того чтобы уменьшить время сортировки и повышения жизнеспособности выделенных стромальных клеток, мы разработали панорамирования метод способностью разрушать тимоцитов потому тимус суспензию клеток состоит из более чем 95% тимоцитов. Клетки инкубировали сти-CD90 антитела и захвачен вклеивания пластин. По сравнению с этим в целом подготовленных клеток тимуса (предварительно обогащенный), доля ТЭМ была увеличена с менее чем 0,5% до более чем 15% в почтовых обогащенный клеток (фиг.4А и 4В). Панорамирование с анти-CD45 также может быть использован, если, например, один не нужно восстановить дендритные клетки, а также. В этом случае TEC возрастает по обогащению до примерно 80% (данные не показаны). После обогащения стромальных клеток путем панорамирования, пропорции TEC подмножеств не были изменены (фиг.4С и 4D), предполагая, что одно подмножество или другой не выборочно теряется при панорамировании. По сравнению с образцом предварительно обогащения, скорость восстановления ТЭМ была около 85% (Рисунок 4E).

    Рисунок 1
    Рис.1 тимуса мыши Durinг рассечение. Тимус расположен выше сердца в передней верхней грудной клетки. После резки и подъема ребра, два белых лепестков тимуса подвергаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 2
    Рисунок 2 Идентификация CTEC и Mtec с анализа проточной цитометрии данных. Образцы Витражи тимуса клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. Представительства профили FACS показаны. Цифры указывают на процент каждой популяции. () Живых клеток, ворота CD45-негативных и EpCAM-позитивных событий представляет TEC клетки. (B) в рамках TEC ворот, две популяции разделены уровне Ly51 и UEA- 1. cTECs имеют высокийэ выражение Ly51; mTECs имеют более высокий уровень УЭА-1. молекулы (С) МНС II высоко экспрессирован на cTECs. (D) mTECs состоит из высоких и низких МНС II субпопуляций МНС II, которые по отдельности именуемых Mtec высокого и низкого Mtec. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 3
    Рисунок 3 протокола Liberase основе позволило более высокие выходы клеток из тимуса, чем при использовании многоступенчатой ​​коллагеназы / диспаза протокол с. Тимуса клетки были получены с использованием ранее опубликованной многоступенчатый коллагеназы / протокол диспаза или этот протокол Liberase основе. Эти две группы образцов были проанализированы с помощью проточной цитометрии. (А) </ STRONG> Представительства FACS профилей показаны. Цифры указывают проценты ТИК клеток в каждой группе. (B) Всего количество клеток из ТИК на мышь тимуса показаны на гистограмме. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение (N> 3). Двусторонними, непарный тест T проводили с использованием программного обеспечения Prism. Р <0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 4
    Рисунок 4 Обогащение ТИК методом панорамирования. FACS профили до и после обогащенный тимуса стромальных клеток показаны. Готовые тимуса клетки окрашивали анти-CD90 антитела. CD90-положительная тимоциты сочинять более 95% клеток тимуса. Во время процедуры обогащения TEC, тимоциты являются Capturред и обедненного на предварительно покрытых панорамирования пластины, таким образом, ТЭМ обогащены в надосадочной жидкости. (А) и (В), TEC ворота показаны. Цифры показывают долю ТИК среди общего живых клеток в стартовом населения (Pre-обогащения) или после обогащения (после обогащения). (C) и (D), клетки в CTEC и Mtec ворот показаны. Цифры отображения процент CTEC и Mtec в популяциях TEC из каждой группы. Номера (R) клетка cTECs и mTECs на мышь тимуса показаны на графике. Данные репрезентативны из 5 экспериментов. "Pre" расшифровывается образца предварительно обогащения; "Сообщение" означает образца после обогащения; маленькие горизонтальные линии указывают среднее. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    В протоколе, критические шаги являются подготовка тимуса стромальных клеток (раздел 3) и обогащение ТИК (раздел 4). Настоятельно рекомендуется, что свежий фермент раствор готовят каждый раз и ткань обрабатывают как можно скорее. Для объединенной Thymi, оптимизируя объем раствора фермента необходим в зависимости от количества Thymi. Если любая ткань остаток оставил после обработки, добавляя больше раствора фермента и расширение времени инкубации может увеличить урожайность клеток. При обогащении ТИК, комплектующих коллекцию супернатанта и повторяя пластины полоскание, описанной в разделе 5.3 будет уменьшаться потерю клеток.

    В 1980 году Wekerle др. первым сообщил тип ТИК - "тимуса трофоцитов" (ТНК) 33, которые крупные корковых клеток эпителия, что полностью окружать много жизнеспособных лимфоидных клеток в внутриклеточных везикул. В 1982 году Kyewski и Каплан описано различные изоляции услitions, влияющие на доходность ТНК 34. Недавно Takahama и коллеги вновь выделение и характеристики ТНК. Они идентифицировали такие клетки на основе льготного окрашивания для CD45 только после мембранной проницаемости 35. Они также описали "сломанной" ТНК в их подготовке, который состоял из CTEC и нескольких связанных тимоцитов. Такое сломанной TNC были положительными для внеклеточной CD45 и для маркера β5t CTEC и составил 70% от общего объема cTECs в их подготовке. В самом деле, мы также наблюдали подобную клеточной популяции, которая была CD45 высокой EpCAM + и Ly51 + в нашей подготовленной суспензией тимус клеток, хотя составляли менее 40% от общего объема cTECs с нашей процедуры выделения. Эти сломанной TNC удаляются из протоколов по обогащению TEC, как наша, которые используют истощение либо CD90 или CD45. Таким образом, будущая задача будет заключаться в минимизации потерь этой популяции.

    По сравнениюв установленном порядке пищеварения многоступенчатой ​​29, протокол пищеварение Liberase позволяет значительно более высокую доходность клеток ТИК (Рисунок 3). Другие группы также представили свои новые методы выделения тимуса стромальных клеток, изменяя метод Грея 30,36, хотя выход клеток не была значительно увеличена. Недавно Chidgey и коллеги независимо сообщили протокол TEC используя Liberase пищеварение, и они также получают эффективного высвобождения из ТИК 37. Тем не менее, первый шаг тимоцит выхода их протокола имеет потенциал, чтобы отбросить около 1,6 х 10 4 ТИК от каждой тимуса 29, большинство из которых являются cTECs. В связи с градиентной обогащения плотности, вызывающего потерю небольших стромальных клеток, истощение CD45-Microbead AutoMACS основе широко используется для обогащения ТИК перед очисткой FACS 29,36,37. По сравнению с AutoMACS основе обогащения с помощью истощения CD45-Microbead протоколы 29, впанорамирование обогащения полученные повышение коэффициентов извлечения из ТИК. В общем, протокол, представленные здесь агрегатов ряд преимуществ сообщалось ранее. TEC подмножества очищенные с этим протоколом (раздел 6), были успешно использованы для дальнейшего анализа, таких как Real Time-ПЦР и вестерн-блоттинга 12.

    Этот протокол также подходит для выделения и изучения других стромальных клеток тимуса, такие как дендритные клетки. Мы считаем, что надежная изоляция тимуса стромальных клеток, в частности ТИК, ускорит понимание того, как тимуса функций для развития Т-клеток и достижения в пробирке Т-клеток конституции. Кроме того, характеристика этих клеток имеет большое практическое значение для медицинской общественности, так как это общая проблема с восстановлением от лечения (например, те, которые используются в трансплантации и лечения рака) является плохое восстановление эпителиальных клеток в тимусе, ведущей к иммунодефицита.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

    Acknowledgments

    Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения Грант R01 AI088209 (к KAH). Мы также благодарим Университет штата Миннесота проточной цитометрии ресурса.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
    2. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
    3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
    4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
    5. Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
    6. Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
    7. Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
    8. Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
    9. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
    10. Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
    11. Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
    12. Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
    13. Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
    14. Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
    15. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
    16. Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
    17. Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
    18. Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
    19. Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
    20. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
    21. Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
    22. Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
    23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
    24. Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
    25. Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
    26. Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
    27. Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
    28. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
    29. Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
    30. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
    31. Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7, (Unit 7.3), (2001).
    32. Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3, (Unit 3.5), (1991).
    33. Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
    34. Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
    35. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
    36. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
    37. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).

    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics