単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ここでは、単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞(のTEC)を精製するための効率的な方法を記載する。プロトコルは、通常のT細胞の発生、胸腺機能不全、およびT細胞再構成のための胸腺機能の研究のために利用することができる。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

胸腺は、Tリンパ球の開発のための重要な器官である。 T細胞のコミットメント、正の選択および負の選択:胸腺ストローマ細胞、胸腺上皮細胞(TECは)は、T細胞発生の複数の段階において特に重要である。しかし、胸腺内のTECの機能は完全には理解されたままになります。記事では、機械的破壊及び酵素消化の組み合わせを使用して、新鮮なマウスの胸腺からTECサブセットを単離するための方法を提供する。方法は、胸腺間質細胞および胸腺細胞を効率的に細胞 - 細胞および細胞 - 細胞外マトリックス接続から解放されると、単一細胞懸濁液を形成することを可能にする。単離された細胞を使用して、マルチパラメータフローサイトメトリーのTECおよび樹状細胞の同定および特徴付けにも適用することができる。のTECは、胸腺では珍しいな細胞集団であるため、私たちも豊かにし、胸腺細胞、胸腺で最も豊富な細胞型を枯渇させることによりTECのを浄化する効果的な方法について説明します。 Folloの細胞生存率の損失はTECの精製の間に最小限に抑えることができるように、翼濃縮を、時間を選別細胞を減少させることができる。精製された細胞は、リアルタイム-PCR、ウェスタンブロット及び遺伝子発現プロファイリングなど、さまざまな下流の分析に適している。プロトコルは、TEC機能の研究と同様にin vitroでのT細胞再構成の開発を推進していきます。

Introduction

初期のT細胞の開発で、骨髄の造血幹細胞由来の多能性前駆細胞が胸腺の皮質に補充される、T細胞系列へのコミットメントを受け、T細胞前駆体1になる。非常に変化したT細胞受容体1と前駆細胞の大きなプールを形成し、皮質では、T細胞前駆体のCD4とCD8ダブルネガティブ(DN)胸腺細胞が膨張し、未成熟CD4およびCD8ダブルポジティブ(DP)胸腺細胞に分化する。 DP細胞の選択MHC拘束性サブセットは、CD4またはCD8シングルポジティブ(SP)胸腺細胞になる胸腺の髄質に移行し、機能的に有能な成熟T細胞へのような正の選択2-と呼ばれるイベントを差別化するだけ6。これとは対照的に、自己反応性胸腺細胞のクローンは、負の選択を受け、自己寛容のための制御性T細胞に変換するか、まだ明らかでない目的のために上皮内リンパ球に転用、アポトーシスによって取り除かれる3,7-10。

胸腺は、胸腺間質細胞は、これらの多様なT細胞の発生運命5,11,12のための信号を提供するユニークな微小環境を形成している。皮質のTEC(cTECs)および髄質のTEC(mTECs)、樹状細胞、マクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞、神経堤由来の周皮細胞および他の間葉系細胞を13〜15を含む-胸腺間質細胞は、胸腺上皮細胞(TECの)から構成されている。これらの中でも、TECは、T細胞の発達1,2,16,17のさまざまな段階で重要である。しかし、TECのを隔離するための確実な方法がないことは、それらの機能16の包括的な理解を妨げている。特に、皮質の前駆細胞を囲む三次元網目構造を形成cTECsは、まだ明らかでない理由のために正の選択13,18,19のために必須である。初期の研究は、主に形態学的および組織学的ツール13に頼ること、のTECの不均一性や役割などの手掛かりを提供12,20における遺伝的アプローチによって対処された。 TECのを単離するための堅牢で再現性のある方法がcTECsが正の選択をサポートする方法のTECサブセットの公正な特性評価、TEC機能の定量的および定性的評価、およびメカニズムの解明を達成することが基本である。

ため、彼らは無傷の器官において形成胸腺内のTECの希少性とタイトな相互作用のために、TECはの単離は困難なされています。ここで説明するプロトコルは、以前の発見、現在利用可能な試薬、技術、および胸腺構造および間質組成物の知識に基づいている。ほぼ20年前に、いくつかの手順は、トリプシン、コラゲナーゼとディスパーゼを含むさまざまな酵素が消化中に使用された胸腺組織21-27を 、脱凝集することが報告された。 Gray 。彼らprecedure 28のものの酵素を比較し、改善されたメタを報告した広く使用されている20,30になった酵素カクテル29の多段消化し ​​たOD。しかし、この方法は、長い準備時間と同じでもマウスのコホート29,30でのTECの可変の最終細胞数および割合で複雑 ​​な消化工程および結果を含む。数年前、リベラーゼ研究グレード酵素、高度にコラゲナーゼを精製し、中性プロテアーゼは、胸腺組織解離30で使用され始め含有する。ここでは、マウスの胸腺組織からの生のTECの高い数を出し最適化された機械的分離手順リベ消化ベースのプロトコルを記載している。 。

解離した間質細胞を濃縮するために、以前の研究では、密度勾配または磁気ビーズ分離21,29のいずれかを使用している。しかし、両方の方法は、胸腺ストローマ細胞、cTECs 29の特に人口の特定の集団から失わ厳しい引き起こす。細胞傷害性除去とパニング技術12,31に枯渇またはリンパ球を分離するために使用されている。これらの技術の比較後、私たちはTECのを濃縮するための現在のパン·プロトコルを確立した。濃縮手順の間に緩やかな条件が少ない細胞死および公正な増加TECの回復につながる。

セクション3に記載される単離され胸腺細胞懸濁液を直接TECサブセット及び樹状細胞の同定および特徴付けのためにフローサイトメトリー分析に適用することができる。第4節では、サイトメーター多パラメーターフローを使用して、TECのサブセットを識別するための簡単​​で便利な方法を説明しています。精製されたcTECsまたはmTECs、TEC濃縮と手順をセルソーティングを得ようとした実験については、セクション5と6に記載されています。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

本研究では、成人(6 - 8週)の雌のC57Bl / 6マウスを用いた。マウスは、国立癌研究所から購入し、特定の病原体フリーの条件下で維持した。ミネソタ大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)は、すべての動物実験を承認した。

楽器とバッファの調製

  1. 酵素液の準備、アルブミンが豊富なバッファー(1×PBSの[Ca 2 + / Mgの2+を含まない]と0.5%ウシ血清(0.05%RPMI1640培地をリベラーゼTH及びDNアーゼIの100単位/ mlの[w / vの])アルブミン及び2mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA])、FACS緩衝液(1×PBSの[Ca 2 + / Mgの2 +を含まない]を含む1%ウシ胎児血清[FBS]、0.02%のNaN 3)、FACSバッファソーティング(1X PBS 10%FBSが供給された[Ca 2 + / Mgが2 +を含まない]、2%FBS)を含有する、およびRP10培地(RPMI-1640培地)。
  2. 10パニングプレートを準備します。 (0.01 mg / mlのGを40ml塗布液を調製しオート麦は、0.1MのNaHCO 3緩衝液中の抗ラットIgG)を、それぞれ100×15ミリメートルプレート、スワールに塗布液の4ミリリットルを追加し、4℃、CO / Nインキュベートする。抗体溶液を捨て2回1×5mlのPBSを用いてプレートをすすぎ、リンスの間で活発に渦巻く。 4℃で準備されたプレートを保管してください。

胸腺組織の2収穫

  1. CO 2チャンバー内でマウスを安楽死させる。 、解剖マットの上に仰向けに動物を入れてマットの上に足をピンと70%エタノールを噴霧して毛皮を濡らす。
  2. まっすぐにハサミで下顎への尿道口の上から出発して、皮膚を​​介して正中切開を行い、両側の膝に下向きに切開を延長。切開は「Y」逆さまのように見えます。両側のたるんだ皮膚を後ろに引き、そして解剖マットにそれをピン。
  3. 次いで、肋骨を持ち上げ、鎖骨付近までそれぞれの側にリブをカット、剣状突起から横隔膜を穿刺鉗子は解剖マットにそれをピンと。胸腺はちょうど肋骨の下にあり、心の上にある二つの薄い白のローブ( 図1)のように見えます。胸腺の周囲の結合組織を外し、緩やかに湾曲鋸歯状の鉗子で胸腺ローブのペアを引っ張って外します。 5ミリリットルのRPMI-1640を含む6ウェルプレートに胸腺葉を置きます。

胸腺間質細胞の調製

  1. 周囲の脂肪と結合組織をトリミングし、新たに酵素液を調製5ミリリットルを含む6ウェルプレートの新しいウェルに胸腺葉を移す。細かいハサミで胸腺葉に小さな切開を行い、20分間、37℃でプレートをインキュベートする。
  2. 組織解離のための5ミリリットルピペットを用いて3回 - 静かにピペットを上下に2を胸腺組織を消化。 10ミリリットルの酵素を中和するコールドアルブミンが豊富な緩衝液を含む50mlチューブに上清画分を収集する。氷上でコレクションチューブを保管してください。 2.5を追加します。残りの組織への溶解酵素溶液と15分間37℃でプレートをインキュベートする。
  3. 凝集体を破壊するために3ミリリットルの注射器と、18G針で穏やかな機械的撹拌を実行します。コレクションチューブにプール上清。残りの組織に2.5ミリリットルの酵素溶液を加え、15分間、37℃でプレートをインキュベートする。
  4. 3ミリリットルの注射器と25 Gの針で穏やかな機械的撹拌を繰り返し、プレートをさらに5インキュベート - 10分。
  5. 完全消化した後、コレクションチューブに上清をプールする。遠心分離した細胞を収集するために8分間400×gで、4℃でコレクションチューブ。液体を吸引し、10mlのアルブミンが豊富なバッファ内のペレット化した細胞を中断し、100mmのメッシュを通してサンプルをフィルタリングする。血球計数器を用いて細胞を数える。その後、フローサイトメトリー分析(第4節)、またはTECの濃縮(第5節)を行う。

フローサイトメトリーによるのTECの4の同定

  • 96ウェル丸底試験板に染色FACS緩衝液中に100μlあたり4×10 6細胞の最終濃度に細胞を調製し、氷上にプレートを保つ。細胞に(FACS緩衝液中10μg/ mlの抗CD16 / CD32抗体)を20μlのFcブロック溶液を加え、氷上で10分間細胞をインキュベートします。 400×gで、3分間、4℃でプレートをスピン。流しにダウン板面をフリックでウェルから液体を捨ててください。
  • 100μlの抗体カクテル(抗CD45、-EpCAM、-MHCクラスII、および-Ly51抗体におけるペレット化した細胞を一時停止し、メーカーで異なる蛍光色素で標識したUEA-1レクチンは、FACSバッファ内の各抗体の最適な濃度をお勧めしますまたはテスト)し、暗所で20分間氷上で細胞をインキュベートする。補償のために、各個別の蛍光色素で1×10 6個の細胞を染色する。
  • 各ウェルにFACS緩衝液100μlを加え、400×gで、3分間、4℃でプレートをスピン。洗浄ステップ1を繰り返します時間、その後100μlのFACS緩衝液中で細胞を再懸濁。 300μlのFACS緩衝液で満たされた12×15mmの丸底FACSチューブに細胞を移す。フローサイトメーターでサンプルを取得し、FACS分析ソフトウェアを用いてデータを分析する。 TECゲーティング戦略は、 図2に示されている。
  • パンニングによるTECの5。エンリッチメント

    1. 5分間400×gで、4℃で(セクション3で調製した)胸腺細胞をスピンダウン。吸引した液体と15ミリリットルまたは50 mlコニカルチューブ中の1ml当たり2×10 8細胞の濃度でFACSソーティングバッファ内のペレット化した細胞を一時停止する。細胞懸濁液を2.5μg/ mlの最終濃度で抗CD90.2抗体(クローン30-H12)(または抗CD45)を追加し、30分間4℃で回転ミキサー上で穏やかに細胞をインキュベートする。インキュベーションに続いて、5で洗浄 - RP10培地の10倍の体積と400×gで、5分間、4℃でチューブを遠心する。
    2. 吸引した液体とでペレット化した細胞を再懸濁1mlあたり1×10 7の濃度でRP10培地。各コーティングされたパン(ステップ1.3で調製)プレート、スワール5ミリリットルの細胞懸濁液を加え、室温で30分間インキュベートする。精力的に渦巻く;コニカルチューブに上清を移す。プレートをRP10培地を用いて2回すすぎ、収集チューブに上清をプールする。
    3. 400×gで、5分間、4℃でコレクションチューブを遠心。吸引した液体と5ミリリットルのRP10培地中でペレット化した細胞を懸濁します。 、新しいパンプレートに細胞懸濁液を追加旋回し、室温で30分間インキュベートする。細胞がプレートをすすぎ、コニカルチューブにそれらをプール収集します。 TECのが濃縮されると、5分間、4℃、400×gで細胞をスピンダウンし、バッファをソートする5ミリリットルのFACSで細胞を一時停止。

    細胞選別によるのTECの6。精製

    1. 血球計数器を用いて細胞を数え、FACSソーティングバッファ内の4×10 7細胞の濃度で細胞懸濁液を準備します。抗体デスを追加細胞溶液に4.4節でのcribed、30分間、4℃で回転ミキサー上で穏やかに細胞を培養する。染色の後、洗浄し、FACSソーティングバッファの1mlあたり10×10 6細胞の濃度に細胞を懸濁する。
    2. 蛍光活性化セルソーティングを使用して、100μMのノズルを通してソートテックサブセット。ソートされた細胞は、RPMI-1640中30%(v / v)のFBS)に集められる。細胞選別は、5分間、400×gで、4℃で遠心分離を行って細胞および下流の分析のために準備される一度。

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    このプロトコルを使用して、胸腺器官成体マウス(セクション2)から除去し、得られた細胞懸濁液を3章で概説されるように胸腺細胞懸濁液を調製した胸腺細胞、造血由来間質細胞および非造血間質細胞から成っていた。 CD45は胸腺細胞とマクロファージや樹状細胞などの造血間質細胞の両方で発現し、造血汎マーカーである。対照的に、TECは、造血起源のものではなく、CD45 15を発現しない。セクション4に概説されるように細胞染色およびフローサイトメトリー分析を行った。

    TECサブセット、cTECsとmTECsの2種類が、一般的なバイ強力TEC前駆体15に由 ​​来する。 cTECsとmTECsの両方が、それらの表面28上のEpCAM分子を発現する。このためのTECは、EpCAMの陽性およびCD45陰性フローサイトメトリーによる( 図2A)に応じてゲート制御することができます。 Ly51:cTECsとmTECsは、2つの試薬によって区別す​​ることができるCTECで表さグルタミルアミノペプチダーゼを特異的に認識する抗体、およびMTEC( 図2B)に特異的に結合するレクチンハリエニシダEuropaeusアグルチニン-1(UEA-1)28。 mTECsとcTECsの両方は、それらの表面上のII分子( 図2Cおよび2D)MHCクラスを発現する。 mTECsはさらに、MHC II分子( 図2D)のレベルに応じて、MTEC MTEC に分類することができる。胸腺あたりのTECの平均数は約9×10 5である。直接比較では、コラゲナーゼによる多段階プロトコルと比較してこのリベラーゼ酵素ベースのプロトコルを使用して約8倍のTEC回収/ 29( 図3)ディスパーゼ。

    胸腺細胞懸濁液は、95%以上の胸腺細胞で構成されているため、ソート時間を減少させ、回収したストローマ細胞の生存率を増加させるためには、胸腺細胞を枯渇させるパニング法を開発した。細胞を、培養したTI-CD90抗体とプレコーティングしたプレートによって捕獲。全体準備胸腺細胞(プレ富化)におけるものと比較して、TECの割合は、後の濃縮された細胞( 図4Aおよび4B)において、15%を超えて0.5%未満まで増加した。抗CD45によるパニングはまた、例えば、一つは同様に樹状細胞を回収する必要がない場合などに使用することができる。この場合、約80%TECの濃縮が増加する(データは示さず)。パンニングによる間質細胞濃縮した後、TECサブセットの割合は、一つのサブセットまたはその他を選択的にパンニング中に失われていないことを示唆している( 図4Cおよび4D)変化しなかった。予備濃縮試料と比較して、TECの回収率は約85%( 図4E)であった。

    図1
    図1マウス胸腺ドゥリングラム解剖。胸腺は、前上胸部心臓の上に位置しています。切断および肋骨を持ち上げた後、胸腺の2白いローブが公開されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図2
    フローサイトメトリーデータ分析とCTECとMTECの図2同定。ステンド胸腺細胞サンプルをフローサイトメトリーを用いて分析した。代表的なFACSプロファイルを示す。数字はそれぞれの人口の割合を示している。(A)生きた細胞のう ​​ち、CD45陰性およびEpCAMの陽性事象のゲートは、TECの細胞を表す。TECゲート内(B)を 、2集団はLy51とUEA-のレベルによって分離されている1。 cTECsが高い持っているLy51のER発現; mTECsはUEA-1のより高いレベルを持っている。(C)MHC II分子が高度にcTECs上に発現する。(D)mTECsは、別途、低 MTEC 高いとMTECと呼ばれているMHC II およびMHC II サブ集団で構成されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図3
    図3は、リベラーゼベースのプロトコルは、マルチステップのコラゲナーゼ/ディスパーゼプロトコルを使用するよりも胸腺からのより高い細胞収量を可能にした。胸腺細胞を、以前に公開された多段階のコラゲナーゼ/ディスパーゼプロトコルまたはこのリベラーゼベースのプロトコルを使用して調製した。サンプルの2つのグループは、フローサイトメトリーによって分析した。(A)</ strong>の代表的なFACSプロファイルが表示されます。数値は、(B)は、マウス胸腺あたりTECの総細胞数、各グループ内のTEC細胞のパーセンテージを示す棒グラフで示されている。エラーバーは標準偏差(nは> 3)を示す。両側、対応のないT検定は、ソフトウェアPrismを用いて行った。 P <0.0001。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図4
    パニング法によるのTECの図4の濃縮。前後富化胸腺間質細胞のFACSプロファイルを示す。調製した胸腺細胞を抗CD90抗体で染色した。 CD90陽性の胸腺細胞は、胸腺細胞の95%以上を構成している。 TECの濃縮手順の間に、胸腺細胞はCAPTURです編およびプレコーティングパンプレートに枯渇は、このようにTECは上清中に濃縮される。(A)及び(B)は 、TECゲートが示されている。数字は、出発集団(前増)や濃縮(ポスト濃縮)後の総生細胞の中でのTECの割合を示している。(C)(D)は 、CTECとMTECゲート内の細胞が示されている。数値は、各群からのTEC集団においてCTECとMTECのパーセンテージを表示する。cTECsマウス胸腺あたりmTECsの(E)細胞数をグラフに示す。データは5回の実験の代表である。 「前は「前濃縮サンプルを表し、 "ポスト"ポスト濃縮サンプルを表し、小さ ​​な水平線は平均値を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    プロトコルでは、重要なステップは、胸腺間質細胞(第3節)とのTECの濃縮(第4節)の製造である。ことを強く新鮮な酵素溶液を毎回用意し、組織をできるだけ早く扱われることをお勧めします。プールされた胸腺、酵素溶液の容量を最適化する胸腺の数に応じて必要とされる。任意の組織残留物は、処理後に残っている場合、より多くの酵素溶液及びインキュベーション時間の延長を添加して細胞収量を増加させることができる。のTECの濃縮中に、上清の収集を完了し、5.3節で概説プレートリンスを繰り返してセル損失が減少します。

    1980年、Wekerle 。完全に細胞内小胞の中、多くの実行可能なリンパ系細胞を包み込む大皮質上皮細胞である「胸腺ナース細胞」(多国籍企業)33、 -最初のTECの種類を報告した。 1982年、Kyewskiとカプランは、さまざまな分離指揮を説明した多国籍企業34の歩留まりに影響を与えるitions。最近では、高浜らは、多国籍企業の単離および特性を再訪。彼らは膜透過35の後にCD45の優先的染色に基づいて、そのような細胞を同定した。彼らはまた、CTECと複数のバウンド胸腺細胞で構成され、それらの製造、の "壊れた" TNCを記述した。このような壊れたTNCは、細胞外CD45およびCTECマーカーβ5tについて陽性であったし、その準備の総cTECsの70%を占めた。確かに、私たちはまた、当社の単離操作を合計cTECsの40%未満を占めているが、私たちの準備胸腺細胞懸濁液中のCD45 のEpCAM +とLy51 +だった類似の細胞集団を、観察した。これらの壊れたTNCは、CD90またはCD45のいずれかで枯渇を活用私たちのようなTEC濃縮プロトコル、、から削除されます。したがって、今後の課題は、この集団の損失を最小限にするであろう。

    比較すると既存の多段階消化手順29に、リベラーゼ消化プロトコルは、TECは、有意に高い細胞収量( 図3)ことができる。細胞収率が顕著に増加しなかったが、他のグループも、グレイの方法30,36を変更することにより、胸腺間質細胞を単離するための新しい方法を報告している。最近では、Chidgeyらは独立してリベラーゼ消化を用いて、TECプロトコルを報告し、彼らはまた、TECの37の効果的な放出を取得しました。しかしながら、それらのプロトコルの最初の胸腺細胞の放出ステップがcTECsそのほとんどが各胸腺29から約1.6×10 4のTECを廃棄する可能性を秘めています。が小さいため間質細胞の喪失を引き起こす密度勾配濃縮し、AUTOMACSベースCD45-マイクロビーズ枯渇は、一般にFACS精製29,36,37の前のTECの濃縮のために使用される。 、CD45-マイクロビーズの枯渇プロトコル29を使用してAUTOMACSベースのリッチ化と比較するとパンニング濃縮は、TECの高い回収率を得た。全体的に、ここで紹介するプロトコルは、以前に報告され、多くの利点を集約します。このプロトコル(第6節)で精製TECサブセットが正常にこのようなリアルタイム-PCRおよびウェスタンブロット分析12として、さらなる分析のために使用されてきた。

    このプロトコルは、樹状細胞のような他の胸腺間質細胞の単離および研究のためにも好適である。私たちは、胸腺間質細胞の強固な分離、特にTECのは、T細胞の開発のための方法胸腺の機能の理解を促進し、in vitroで T細胞の構成では達成することになると信じています。 (例えば、移植および癌治療に使用されるような)療法からの回復に共通の問題は、免疫不全に至る胸腺上皮細胞の不十分な再構成であるため、また、これらの細胞の特性決定は、医学界にとって大きな実用的価値を有している。

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

    Acknowledgments

    この作品は、(KAH)は健康グラントR01 AI088209の国立研究所によってサポートされていました。また、ミネソタフローサイトメトリーのリソースの大学に感謝します。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
    2. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
    3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
    4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
    5. Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
    6. Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
    7. Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
    8. Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
    9. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
    10. Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
    11. Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
    12. Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
    13. Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
    14. Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
    15. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
    16. Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
    17. Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
    18. Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
    19. Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
    20. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
    21. Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
    22. Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
    23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
    24. Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
    25. Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
    26. Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
    27. Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
    28. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
    29. Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
    30. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
    31. Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7, (Unit 7.3), (2001).
    32. Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3, (Unit 3.5), (1991).
    33. Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
    34. Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
    35. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
    36. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
    37. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).

    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics