El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

Immunology and Infection

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Summary

Aquí se describe un método eficiente para el aislamiento, identificación y purificación de ratón las células epiteliales del timo (TEC). El protocolo puede ser utilizado para estudios de la función del timo para el desarrollo normal de células T, la disfunción del timo, y la reconstitución de células T.

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Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

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Abstract

El timo es un órgano vital para el desarrollo de linfocitos T. De las células del estroma tímico, células epiteliales del timo (TEC) son particularmente cruciales en múltiples etapas de desarrollo de células T: compromiso de las células T, la selección positiva y selección negativa. Sin embargo, la función de TEC en el timo sigue siendo incompleta entendido. En el artículo, se proporciona un método para aislar los subconjuntos TEC de timo de ratón fresco con una combinación de alteración mecánica y digestión enzimática. El método permite que las células del estroma tímico y timocitos a ser liberados de manera eficiente de célula-célula y célula-matriz conexiones extracelular y para formar una suspensión de una sola célula. Uso de las células aisladas, citometría de flujo multiparamétrica se puede aplicar a la identificación y caracterización de TEC y las células dendríticas. Debido TEC son una rara población de células en el timo, también se describe una forma eficaz para enriquecer y purificar TEC por el agotamiento de los timocitos, el tipo de célula más abundante en el timo. Folloala el enriquecimiento, el tiempo de clasificación de células se puede disminuir de modo que la pérdida de viabilidad celular puede reducirse al mínimo durante la purificación de TEC. Las células purificadas son adecuados para diversos análisis aguas abajo como el Real Time-PCR, Western blot y perfiles de expresión génica. El protocolo promoverá la investigación de la función de TEC y así como el desarrollo de la reconstitución in vitro de células T.

Introduction

Temprano en el desarrollo de células T, la médula ósea madre hematopoyéticas progenitoras multipotentes derivadas de células son reclutados a la corteza del timo, someterse compromiso de linaje T y se convierten en precursores de células T 1. En la corteza, precursores de células T CD4 y CD8 doble negativos (DN) timocitos se expanden y se diferencian en células CD8 doble positiva (DP) timocitos inmaduros CD4 y, formando un gran grupo de progenitores con receptores de células T altamente variable 1. Sólo un selecto subconjunto restringido por MHC de las células DP se convertirá en único positivos (SP) timocitos CD4 o CD8, migran a la médula del timo, y se diferencian en células T maduras funcionalmente competentes, un evento que se conoce como selección positiva 2 6. En contraste, los clones de los timocitos autorreactivos se someten a selección negativa y se eliminan a través de la apoptosis, convertido a las células T reguladoras para la auto-tolerancia, o desviado a los linfocitos intraepiteliales para los propósitos que aún no están claras 3,7-10.

En el timo, las células estromales tímicas forman un microambiente único que proporciona señales para estos diversos destinos de desarrollo de células T 5,11,12. Células del estroma tímico se componen de células epiteliales del timo (TEC) - incluyendo TEC corticales (CTEC) y TEC medulares (mTECs), células dendríticas, macrófagos, fibroblastos, células endoteliales, pericitos derivadas de la cresta neural y otras células mesenquimales 13-15. Entre estos, TEC son cruciales en las diversas etapas de desarrollo de células T 1,2,16,17. Sin embargo, la falta de una manera robusta para aislar TEC ha obstaculizado una comprensión global de sus funciones 16. En particular, CTEC, que forman una red tridimensional que rodea a los progenitores en la corteza, son esenciales para la selección positiva 13,18,19 por razones que aún no están claras. Estudios anteriores proporcionaron pistas sobre la heterogeneidad y el papel de los TEC, sobre todo contando con herramientas morfológicas e histológicas 13 12,20. Una manera robusta y reproducible para aislar TEC es fundamental para lograr la caracterización objetiva de subconjuntos TEC, la evaluación cuantitativa y cualitativa de las funciones TEC, y la aclaración de los mecanismos de cómo CTEC apoyan la selección positiva.

Debido a la rareza de TEC en el timo y las interacciones apretados forman en el órgano intacto, el aislamiento de TEC ha sido desafiante. El protocolo descrito aquí se basa en descubrimientos anteriores, actualmente reactivos disponibles, las técnicas y el conocimiento de la estructura y composición del estroma del timo. Hace casi dos décadas, se reportaron varios procedimientos para desagregar los tejidos del timo 21-27, en el que se utilizaron diferentes enzimas durante la digestión, incluyendo tripsina, colagenasa y dispasa. Gray et al. comparado esas enzimas en su precedure 28, e informó de una mejora de la metanfetaminaod con la digestión de múltiples pasos de cócteles enzimáticos 29 que se hicieron ampliamente utilizado 20,30. Sin embargo, este método implica un largo tiempo de preparación y los pasos y los resultados de digestión complejos en el número de células y proporciones de TEC última variable, incluso en la misma cohorte murino 29,30. Hace varios años, Liberase enzima grado de investigación, con adición altamente purificada de colagenasa y proteasa neutra se empezó a utilizar en la disociación del tejido del timo 30. A continuación, describimos un protocolo basado en la digestión-Liberase, con procedimientos de separación mecánica optimizados, que produce un alto número de TEC viables a partir de tejidos de timo de ratón. .

Para enriquecer las células del estroma disociadas, estudios previos han utilizado tanto los gradientes de densidad o la separación de cuentas magnéticas 21,29. Sin embargo, ambos métodos causan severa perdida de ciertas poblaciones de células del estroma del timo, en particular la población de CTEC 29. Eliminación citotóxica y técnicas de paneo 12,31. Después de la comparación de estas técnicas, hemos establecido el protocolo actual de panoramización para el enriquecimiento de TEC. La condición suave durante el procedimiento de enriquecimiento conduce a una menor muerte celular e imparcial y una mayor recuperación de TEC.

La suspensión de células aisladas del timo se describe en la Sección 3 se puede aplicar directamente a análisis citométrico de flujo para la identificación y caracterización de subconjuntos TEC y células dendríticas. Sección 4 describe una forma sencilla y útil para identificar subconjuntos TEC utilizando citómetro de flujo multiparamétrica. Para los experimentos que buscan obtener CTEC purificados o mTECs, enriquecimiento TEC y clasificación de células procedimientos se pueden encontrar en la sección 5 y 6.

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Protocol

En este estudio, los adultos - se utilizaron (6 8 semanas) hembra C57BL / 6 ratones. Los ratones se adquirieron en el Instituto Nacional del Cáncer y mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. La Universidad de Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Minnesota (IACUC) aprobó toda la experimentación animal.

1 Preparación de Instrumentos y búferes

  1. Preparar la solución de enzima (medio RPMI 1640 con 0,05% [w / v] de Liberase TH y 100 U / ml de DNasa I), tampón rico en albúmina (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + libre] con 0,5% de suero bovino mM de ácido etilendiaminotetraacético albúmina y 2 [EDTA]), tampón FACS (PBS 1X [Ca 2 + / Mg 2 + libre] que contiene suero bovino fetal al 1% [FBS] y 0,02% NaN 3), FACS clasificación tampón (PBS 1X [Ca 2 + / Mg 2 + libre] que contiene 2% de FBS), y medio RP10 (medio RPMI-1640 suministrado con FBS al 10%).
  2. Preparar 10 placas paneo. Preparar la solución de recubrimiento 40 ml (0,01 mg / ml de Gavena anti-IgG de rata en 0,1 M NaHCO3 Buffer), y añadir 4 ml de solución de revestimiento en cada placa de 100 mm x 15, remolino e incubar a 4 ° CO / N. Vierta la solución de anticuerpo y enjuagar la placa con 5 ml de 1x PBS durante 2 horas, agite vigorosamente entre enjuagues. Guarde las placas preparadas a 4 ° C.

2. Cosecha de Timo Tejido

  1. La eutanasia de ratón en una cámara de CO 2. Coloque el animal sobre su espalda sobre una estera de disección, fijar los pies en el felpudo y humedecer la piel mediante pulverización con etanol al 70%.
  2. Hacer una incisión en la línea media a través de la piel, a partir de por encima de la abertura de la uretra hacia arriba a la mandíbula inferior con una tijera y extender la incisión hacia abajo para las rodillas en ambos lados. La incisión se ve como un revés de "Y". Tire de la piel suelta de nuevo en los lados, y el pin a la lona disección.
  3. Perforar el diafragma del xifoides, cortar las costillas en cada lado hasta alrededor de la clavícula, luego levante las costillas confórceps y el pin a la lona disección. El timo es justo debajo de las costillas, y se ve como dos lóbulos blancas finas que recubren el corazón (Figura 1). Tejido conectivo que rodea Desconecte el timo, tirar y eliminar el par de lóbulos del timo con pinzas dentadas curvadas suavemente. Lóbulos del timo lugar en una placa de 6 pocillos que contenía 5 ml de medio RPMI-1640.

3. Preparación de las células del estroma tímico

  1. Recortar cualquier tejido graso y conectivo circundante y transferir los lóbulos del timo a un nuevo pocillo de la placa de 6 pocillos que contiene 5 ml de solución de enzima recién preparan. Hacer pequeñas incisiones en los lóbulos del timo con tijeras finas, y se incuba la placa a 37 ° C durante 20 min.
  2. Pipetear suavemente digerir tejido del timo arriba y abajo 2-3 veces usando la pipeta 5 ml para la disociación del tejido. Recoger la fracción de sobrenadante en un tubo de 50 ml que contiene 10 ml de tampón de albúmina rica en frío para neutralizar enzimas. Mantener el tubo de recogida en hielo. Añadir 2,5solución de enzima ml para el tejido restante y se incuba la placa a 37 ° C durante 15 min.
  3. Realizar agitación mecánica suave con una jeringa de 3 ml y 18 g de aguja para romper los agregados. Piscina sobrenadante en el tubo de recogida. Añadir 2,5 ml de solución de enzima para el tejido restante y se incuba la placa a 37 ° C durante 15 min.
  4. Repita la agitación mecánica suave con una jeringa de 3 ml y una aguja de 25 G, y se incuba la placa adicional de 5 - 10 min.
  5. Después de la digestión completa, piscina el sobrenadante en el tubo de recogida. Centrifugar el tubo de recogida a 400 xg, 4 ° C durante 8 min para recoger las células. Aspirar el líquido y suspender las células sedimentadas en 10 ml de tampón de albúmina-rica y filtrar la muestra a través de malla de 100 mm. Contar las células utilizando un hemocitómetro. A continuación, realice el análisis de flujo cytometic (Sección 4) o el enriquecimiento TEC (Sección 5).

4. Identificación del TEC por Citometría de Flujo

  • Preparar las células para una concentración final de 4 x 10 6 células por 100 l en tampón de FACS para la tinción en una placa de ensayo de pocillos de fondo redondo 96 y mantener la placa en hielo. Añadir 20 l solución de bloqueo Fc (-anticuerpo anti CD16 / CD32 a 10 mg / ml en tampón FACS) a las células e incubar las células durante 10 min en hielo. Haga girar la placa a 400 xg, 4 ° C durante 3 min. Deseche el líquido de los pozos con un movimiento rápido de la cara de la placa hacia abajo en un fregadero.
  • Suspender las células sedimentadas en 100 l cóctel de anticuerpos (anti-CD45, -EpCAM, clase MHC II, y -Ly51 anticuerpos, y la lectina UEA-1 marcado con diferentes fluorocromos en fabricante recomienda o probado concentraciones óptimas de cada anticuerpo en tampón FACS ), y se incuban las células en hielo durante 20 min en la oscuridad. Para la compensación, manchar 1 x 10 6 células con cada fluorocromo individual.
  • Añadir 100 l de tampón de FACS a cada pocillo y girar la placa a 400 xg, 4 ° C durante 3 min. Repita el paso de lavado setiempo y, a continuación, volver a suspender las células en tampón de FACS 100 l. Transferir las células a un tubo de FACS de fondo redondo de 12 x 15 mm lleno de 300 l de tampón FACS. Adquirir las muestras en el citómetro de flujo y análisis de datos utilizando el software de análisis FACS. Estrategia gating TEC se muestra en la Figura 2.
  • 5. Enriquecimiento del TEC por Toma panorámica

    1. Centrifugar las células del timo (que se formulan en la sección 3) a 400 xg, 4 ° C durante 5 min. Aspirar el líquido y suspender las células sedimentadas en tampón de clasificación de FACS en una concentración de 2 x 10 8 células por ml en un tubo cónico de 15 ml o 50 ml. Añadir anticuerpo anti-CD90.2 (Clon 30-H12) (o anti-CD45) a una concentración final de 2,5 mg / ml de suspensión celular y se incuban las células suavemente en un mezclador que gira a 4 ° C durante 30 min. Después de la incubación, lavar con un 5 - 10 veces el volumen de medio RP10 y se centrifuga el tubo a 400 xg, 4 ° C durante 5 min.
    2. Aspirar el líquido y resuspender las células sedimentadas enRP10 medio a una concentración de 1 x 10 7 por ml. Añadir 5 ml de suspensión celular a cada placa recubierta panning (preparado en la Etapa 1.3), remolino y se incuba durante 30 min a TA. Agitar vigorosamente; transferir los sobrenadantes en un tubo cónico. Enjuague la placa dos veces con medio RP10 y agrupar los sobrenadantes en el tubo de recogida.
    3. Centrifugar el tubo de recogida a 400 xg, 4 ° C durante 5 min. Aspirar el líquido y resuspender las células sedimentadas en medio RP10 5 ml. Añadir la suspensión celular a una nueva placa de paneo, agitar e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Recoger las células enjuagar la placa y piscina para ellos en un tubo cónico. Una vez TEC se enriquecen, de girar las células a 400 xg, 4 ° C durante 5 min y la suspensión de células en 5 ml de tampón FACS clasificación.

    6. Purificación del TEC por la clasificación de células

    1. Contar las células usando un hemocitómetro y preparar la suspensión de células a una concentración de 4 x 10 7 células en tampón de clasificación FACS. Añadir anticuerpos described en la Sección 4.4 en solución de células e incubar las células suavemente en un mezclador que gira a 4 ° C durante 30 min. Después de la tinción, lavar y suspender las células a una concentración de 10 x 10 6 células por ml de tampón de clasificación FACS.
    2. Ordenar subconjuntos TEC través de una boquilla 100 mM usando la clasificación de células activadas por fluorescencia. Ordenado de células se recogen en 30% (v / v) de FBS en medio RPMI-1640). Una vez que la clasificación de células se realiza, centrifugar las células a 400 xg, 4 ° C durante 5 min y se preparan para análisis de aguas abajo.

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    Representative Results

    Usando este protocolo, un órgano timo fue retirado de un ratón adulto (Sección 2) y una suspensión de células del timo se preparó como se describe en la Sección 3. La suspensión celular obtenida constaba de timocitos, células estromales hematopoyéticas derivadas de las células del estroma y no hematopoyéticas. CD45 es un marcador pan-hematopoyético expresó en ambos timocitos y células estromales hematopoyéticas tales como macrófagos y células dendríticas. En contraste, los TEC no son de origen hematopoyético y no expresan CD45 15. Tinción celular y el análisis de citometría de flujo se realizaron como se describe en la Sección 4.

    Dos tipos de subconjuntos TEC, CTEC y mTECs, se originan a partir de un precursor común TEC bi-potente 15. Ambos CTEC y mTECs expresan la molécula EpCAM en su superficie 28. Por lo tanto se puede TEC cerrada de acuerdo con EpCAM-positivo y negativo-CD45 por citometría de flujo (Figura 2A). CTEC y mTECs se pueden distinguir por dos reactivos: el Ly51anticuerpo que reconoce glutamil aminopeptidasa expresada por ctec, y la lectina Ulex europaeus aglutinina-1 (UEA-1) 28 que se une a MTEC (Figura 2B). Ambos mTECs y CTEC expresan MHC de clase II moléculas en su superficie (Figura 2C y 2D). mTECs se puede clasificar a su vez en MTEC baja y alta MTEC dependiendo del nivel de moléculas de MHC II (Figura 2D). El número medio de TEC por timo es de aproximadamente 9 x 10 5. En comparaciones directas, recuperamos aproximadamente 8 veces más TEC utilizando este protocolo basado Liberase enzima en comparación con un protocolo multi-etapa con colagenasa / dispasa 29 (Figura 3).

    Con el fin de disminuir el tiempo de clasificación y aumentar la viabilidad de las células estromales recuperados, hemos desarrollado un método de toma panorámica para agotar los timocitos porque la suspensión de células del timo se compone de más del 95% timocitos. Las células se incubaron con unti-CD90 de anticuerpos y capturado por las placas pre-revestidas. En comparación a la de las células de timo enteros preparados (pre-enriquecido), la proporción de TEC se aumentó de menos de 0,5% a más del 15% en las células post enriquecida (Figura 4A y 4B). Toma panorámica con anti-CD45 también se puede utilizar si, por ejemplo, uno no necesita para recuperar las células dendríticas también. En este caso, TEC de enriquecimiento aumenta a alrededor del 80% (datos no mostrados). Después del enriquecimiento de células estromales por panning, las proporciones de los subconjuntos TEC no se alteraron (Figura 4C y 4D), lo que sugiere que un subconjunto o el otro no se pierden selectivamente durante el panning. En comparación con la muestra de pre-enriquecimiento, la tasa de recuperación de TEC era aproximadamente el 85% (Figura 4E).

    Figura 1
    Figura 1 El timo del ratón during disección. El timo se encuentra por encima del corazón en el tórax anterior superior. Después de cortar y levantar las costillas, los dos lóbulos blancos del timo están expuestos. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2
    Figura 2. Identificación de ctec y MTEC con el análisis de datos de citometría de flujo. Muestras de células manchado timo se analizaron mediante citometría de flujo. Se muestran los perfiles de FACS representativos. Los números indican el porcentaje de cada población. (A) de las células vivas, una puerta de eventos CD45-negativo y EpCAM positivos representa células TEC. (B) Dentro de la puerta TEC, dos poblaciones están separadas por nivel de Ly51 y UEA- 1. CTEC tienen altaexpresión er de Ly51; mTECs tienen un mayor nivel de UEA-1. moléculas (C) MHC II son altamente expresado en CTEC. (D) mTECs consiste en sub-poblaciones de bajos y altos de MHC II de MHC II, que se denominan por separado como MTEC alto y bajo MTEC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 3
    Figura 3. un protocolo basado Liberase-permitió mayores rendimientos celulares de timo de utilizar un / dispasa protocolo multi-paso colagenasa. Células de timo se prepararon usando un multi-paso de colagenasa / dispasa protocolo previamente publicado o este protocolo basado en Liberase. Los dos grupos de muestras se analizaron por citometría de flujo. (A) </ Se muestran los perfiles strong> FACS representativos. Los números indican el porcentaje de células TEC en cada grupo. Número de células totales de TEC por el timo de ratón (B) se muestran en el gráfico de barras. Las barras de error indican la desviación estándar (n> 3). A dos colas, prueba T no pareado se realizó a través del prisma de software. P <0,0001. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 4
    Figura 4. Enriquecimiento del TEC por el método de desplazamiento lateral. Perfiles FACS de las células del estroma del timo pre y post enriquecido se muestran. Células de timo preparados se tiñeron con anticuerpo anti-CD90. Timocitos CD90-positivo componen más del 95% de las células del timo. Durante el procedimiento de enriquecimiento de TEC, timocitos son captured y agotado en la placa panorámica pre-revestido, por lo tanto, los TEC se enriquecen en el sobrenadante. (A) y (B), puertas TEC se muestran. Los números muestran que la proporción de TEC entre células vivas totales en la población de partida (Pre-enriquecimiento) o después de enriquecimiento (Post-enriquecimiento). (C) y (D), se muestran las células dentro de CTEC y Mtec puertas. Los números muestran los porcentajes de CTEC y MTEC en las poblaciones TEC de cada grupo. Números (E) de células de CTEC y mTECs por timo del ratón se muestra en el gráfico. Los datos son representativos de 5 experimentos. "Pre" se refiere a la muestra de pre-enriquecimiento; "Post" representa la muestra post-enriquecimiento; pequeñas líneas horizontales indican la media. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

    En el protocolo, los pasos críticos son la preparación de las células del estroma del timo (Sección 3) y el enriquecimiento de los TEC (Sección 4). Se recomienda firmemente que la solución de enzima fresca se prepara cada vez y el tejido se trata tan pronto como sea posible. Para timos agrupado, se requiere optimizar el volumen de solución de enzima en función del número de timos. Si cualquier residuo de tejido que queda después de la transformación, la adición de más solución de enzima y la extensión del tiempo de incubación podría aumentar el rendimiento celular. Durante el enriquecimiento de TEC, completando la colección de sobrenadante y repetir el aclarado placa descrito en la Sección 5.3 se reducirá la pérdida de células.

    En 1980, Wekerle et al. primero reportado un tipo de TEC - "enfermera células del timo" (ETN) 33, que son grandes células epiteliales corticales que envuelven por completo muchas células linfoides viables dentro de vesículas intracelulares. En 1982, Kyewski y Kaplan describen varios cond aislamientoexposi- que influyen en el rendimiento de las empresas transnacionales 34. Recientemente, Takahama y sus colegas revisaron el aislamiento y las características de las empresas transnacionales. Se identificaron estas células sobre la base de la tinción para CD45 preferencial sólo después de permeabilización de la membrana 35. También describieron "roto" TNC en su preparación, que consistía en un CTEC y múltiples timocitos consolidados. Tal TNC rota fueron positivas para CD45 extracelular y para el marcador β5t ctec y comprendía 70% de CTEC totales en su preparación. De hecho, también se observó una población celular similar, que era CD45 alta EpCAM + y + Ly51 en nuestra suspensión de células del timo preparado, aunque compuesta de menos de 40% de total de CTEC con nuestro procedimiento de aislamiento. Estos roto TNC se eliminan de los protocolos de enriquecimiento TEC, como la nuestra, que utilizan el agotamiento, ya sea con CD90 o CD45. Por lo tanto, un desafío futuro será reducir al mínimo la pérdida de esta población.

    Comparadopara el procedimiento de digestión multi-paso existente 29, el protocolo de digestión Liberase permite un rendimiento significativamente mayor de células de TEC (Figura 3). Otros grupos también han informado de sus nuevos métodos para el aislamiento de células del estroma tímico modificando el método de Gray 30,36, aunque el rendimiento de células no aumentó significativamente. Recientemente, Chidgey y sus colegas informaron de forma independiente un protocolo TEC utilizando digestión Liberase y también obtuvieron la liberación efectiva de los TEC 37. Sin embargo, la primera etapa de liberación de timocitos de su protocolo tiene el potencial para descartar aproximadamente 1,6 x 10 4 TEC de cada 29 timo, la mayoría de los cuales son CTEC. Debido al enriquecimiento en gradiente de densidad causando la pérdida de células del estroma más pequeños, un agotamiento de CD45-microperlas a base de AutoMACS se utiliza popularmente para el enriquecimiento de TEC antes de la purificación FACS 29,36,37. En comparación con el enriquecimiento basado en AutoMACS utilizando protocolos de agotamiento de microperlas CD45-29, lospaneo enriquecimiento obtenidos mayores tasas de recuperación de los TEC. En general, el protocolo presentado aquí agregados de un número de ventajas descritas anteriormente. Subconjuntos TEC purificadas con este protocolo (Sección 6) se han utilizado con éxito para su posterior análisis, como el Real Time-PCR y Western blot 12.

    Este protocolo también es adecuado para el aislamiento y estudio de otras células del estroma tímico, tales como células dendríticas. Creemos que el aislamiento sólido de las células del estroma del timo, particularmente TEC, se acelerará la comprensión de cómo funciona el timo para el desarrollo de las células T y lograr in vitro T constitución celular. Además, la caracterización de estas células tiene un gran valor práctico para la comunidad médica, ya que un problema común con la recuperación de terapias (tales como los usados ​​en el trasplante y tratamiento del cáncer) es pobre la reconstitución de las células epiteliales en el timo conduce a la inmunodeficiencia.

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    Disclosures

    Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

    Acknowledgments

    Esta labor fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01 AI088209 (a KAH). También agradecemos a la Universidad de Minnesota Flujo de Recursos Citometría.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

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