Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De thymus is een vitaal orgaan voor T-lymfocyten ontwikkeling. Van thymus stromale cellen, thymus epitheelcellen (TEC) zijn vooral belangrijk bij meerdere stadia van de T-cel ontwikkeling: T-cel betrokkenheid, positieve selectie en negatieve selectie. Toch blijft de functie van TEC in de thymus onvolledig begrepen. In het artikel geven we een methode om TEC subsets van verse muis thymus met behulp van een combinatie van mechanische verstoring en enzymatische afbraak te isoleren. De werkwijze maakt thymus stromale cellen en thymocyten efficiënt vrijkomen van cel-cel en cel-extracellulaire matrix verbindingen en een eencellige suspensie. De geïsoleerde cellen kunnen multiparameter flowcytometrie worden toegepast op de identificatie en karakterisering van TECs en dendritische cellen. Omdat TEC een zeldzame celpopulatie in de thymus, ook een effectieve manier te verrijken en zuiveren TEC door afbreken thymocyten, het meest voorkomende celtype in de thymus te beschrijven. Follovleugel verrijking, celsortering tijd worden verminderd zodat het verlies van cellevensvatbaarheid tijdens zuivering van TEC's worden geminimaliseerd. Gezuiverde cellen zijn geschikt voor verschillende stroomafwaartse analyses zoals Real Time-PCR, Western blot en genexpressie. Het protocol onderzoek TEC functie en evenals de ontwikkeling van in vitro T-cel reconstitutie promoten.

Introduction

Vroeg in T-cel ontwikkeling, zijn beenmerg hematopoietische stamcellen afgeleide multipotente voorlopercellen aangeworven om de cortex van de thymus, ondergaan inzet voor T afstamming en word T cel precursoren 1. In de cortex, T-cel voorloper CD4-en CD8 dubbele ontkenning (DN) thymocytes uitbreiden en differentiëren in onvolwassen CD4 en CD8 dubbel positieve (DP) thymocytes, de vorming van een grote pool van voorouders met zeer variabele T-cel-receptoren 1. Slechts een select MHC-beperkte subset van DP cellen CD4 en CD8 enkele positieve (SP) thymocyten worden, migreren naar de medulla van de thymus en differentiëren tot functioneel bevoegde rijpe T-cellen, een gebeurtenis die wordt aangeduid als positieve selectie 2- 6. In tegenstelling, klonen van auto-reactieve thymocytes ondergaan negatieve selectie en verwijderd via apoptose, omgerekend naar regulatoire T-cellen voor zelf-tolerantie, of omgeleid naar intra-epitheliale lymfocyten voor doeleinden die nog niet duidelijk 3,7-10.

In de thymus, thymus stromale cellen vormen een unieke micro-omgeving verschaffen signalen voor deze verschillende T cel ontwikkeling lot 5,11,12. Thymus stromale cellen zijn samengesteld uit de thymus epitheelcellen (TEC) - waaronder corticale TEC's (cTECs) en medullaire TEC (mTECs), dendritische cellen, macrofagen, fibroblasten, endotheelcellen, neurale-kuif afgeleid pericytes en andere mesenchymale cellen 13-15. Onder deze, TEC's zijn cruciaal in de verschillende stadia van de T-cel ontwikkeling 1,2,16,17. Echter, het ontbreken van een robuuste manier om TEC te isoleren een uitgebreide kennis van hun functies 16 belemmerd. Vooral cTECs, die een driedimensionaal netwerk rond voorlopers in de cortex vormen, zijn essentieel voor positieve selectie 13,18,19 om redenen die nog niet duidelijk. Eerdere studies die aanwijzingen in verband met de heterogeniteit en de rol van de TEC, meestal een beroep op morfologische en histologische gereedschap 13 12,20. Een robuuste en reproduceerbare manier om TEC te isoleren is fundamenteel voor onpartijdige karakterisering van TEC subsets, kwantitatieve en kwalitatieve evaluatie van de TEC-functies, en verduidelijking van de mechanismen te realiseren hoe cTECs ondersteunen positieve selectie.

Vanwege de zeldzaamheid van TEC in de thymus en de strakke interacties vormen ze in de intacte orgaan is de isolatie van TEC uitdagend. De hier beschreven protocol gebaseerd op de eerdere ontdekkingen momenteel verkrijgbare middelen, technieken en kennis van structuur en thymus stromale samenstelling. Bijna twee decennia geleden, werden verschillende procedures gemeld aan thymus weefsels 21-27, waarbij verschillende enzymen werden gebruikt tijdens de spijsvertering, waaronder trypsine, collagenase en Dispase disaggregeren. Gray et al. tegenover deze enzymen in hun precedure 28 en meldde een verbeterde method met een multiple-stap spijsvertering enzym cocktails 29 dat werd op grote schaal gebruikt 20,30. Deze werkwijze is een lange voorbereidingstijd en complexe digestie stappen en resulteert in variabele uiteindelijke cel aantallen en percentages TEC zelfs in dezelfde muizen cohort 29,30. Enkele jaren geleden, Liberase onderzoek leerjaar enzym, met daarin sterk gezuiverd Collagenase en neutraal protease begon te worden gebruikt in de thymus weefsel dissociatie 30. We beschrijven hier een Liberase spijsvertering-gebaseerd protocol, met geoptimaliseerde mechanische scheiding procedures, dat een groot aantal levensvatbare TEC levert vanaf muis thymus weefsels. .

Om gedissocieerde stromale cellen te verrijken, hebben eerdere studies ofwel gradiënten dichtheid of magnetische kraal scheiding 21,29 gebruikt. Beide methoden leiden tot ernstige verlies van bepaalde populaties van thymus stromale cellen, met name de populatie van cTECs 29. Cytotoxische eliminatie en panning technieken 12,31. Na vergelijking van deze technieken hebben we de huidige panning protocol voor verrijking van TEC. De zachte conditie tijdens de verrijking procedure leidt tot minder celdood en onpartijdige en verhoogde TEC herstel.

De geïsoleerde thymus celsuspensie in punt 3 beschreven kunnen direct worden aangebracht op cytometrische analyse stroom voor identificatie en karakterisatie van TEC subsets en dendritische cellen. Hoofdstuk 4 beschrijft een eenvoudige en handige manier om TEC subsets met multiparameter doorstroomcytometer identificeren. Voor experimenten die streven naar gezuiverd cTECs of mTECs, TEC verrijking en celsortering procedures te verkrijgen zijn te vinden in hoofdstuk 5 en 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

In deze studie, volwassen - werden (6 8 weken) vrouwelijke C57BL / 6 muizen gebruikt. Muizen werden gekocht bij het National Cancer Institute en onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden. De Universiteit van Minnesota Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) keurden alle dierproeven.

1 Voorbereiding van instrumenten en Buffers

  1. Bereid enzymoplossing (RPMI1640 medium met 0,05% [w / v] van Liberase TH en 100 U / ml DNase I), albumine-rijke buffer (1X PBS [Ca2 + / Mg2 + -vrij] met 0,5% runderserumalbumine albumine en 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA]), FACS buffer (1X PBS [Ca2 + / Mg2 + -vrij] dat 1% foetaal runderserum [FBS] en 0,02% NaN3), FACS sortering buffer (1X PBS [Ca2 + / Mg2 + -vrij] dat 2% FBS) en RP 10 medium (RPMI-1640 medium geleverd met 10% FBS).
  2. Bereid 10 panning platen. Bereid 40 ml bekledingsoplossing (0,01 mg / ml Ghaver anti-rat IgG in 0,1 M NaHCO3 Buffer), en voeg 4 ml coating oplossing in elk 100 x 15 mm plaat, swirl en incuberen bij 4 ° CO / N. Giet antilichaam oplossing en spoel de plaat met behulp van 5 ml 1x PBS voor 2 keer, zwenk krachtig tussen spoelingen. Bewaar de bereide platen bij 4 ° C.

2 Oogst van Thymus Tissue

  1. Euthanaseren muis in een CO 2 kamer. Leg het dier op zijn rug op een dissectie mat, speld de voeten op de mat en nat de vacht door te besproeien met 70% ethanol.
  2. Voeg een middellijn incisie door de huid, vanaf boven de urethrale opening direct naar de onderkaak met een schaar en neerwaartse uitbreiding van de incisie op de knieën op beide zijden. De incisie ziet eruit als een omgekeerde "Y". Trek de losse huid terug op de zijkanten, en speld het aan de dissectie mat.
  3. Prik het middenrif van de zwaardvormig, snij de ribben aan elke kant tot ongeveer het sleutelbeen, til de ribben metpincet en speld het aan de dissectie mat. De thymus is net onder de ribben, en ziet eruit als twee dunne witte lobben bovenop het hart (figuur 1). Koppel bindweefsel rondom de thymus, trek en verwijder het paar thymus lobben met gebogen gekartelde tang. Plaats thymus lobben in een plaat met 6 putjes met 5 ml RPMI-1640.

3 Bereiding van thymus stromacellen

  1. Snijd elke omgeving vet en bindweefsel en breng de thymus lobben in nieuw putje van de plaat met 6 putjes met 5 ml verse enzymoplossing te bereiden. Voeg kleine incisies in de thymus lobben met fijne schaar, en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
  2. Voorzichtig pipet verteren thymus weefsel op en neer 2 - 3 keer met 5 ml pipet voor weefsel dissociatie. Verzamel supernatant fractie in een 50 ml buis met 10 ml koud albumine-rijke buffer enzymen neutraliseren. Houd de collectie buis op ijs. Voeg 2,5ml enzymoplossing het restmateriaal en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
  3. Voeren zachte mechanisch roeren met een 3 ml spuit en 18 G-naald te breken aggregaten. Pool supernatant in de collectie buis. Voeg 2,5 ml enzymoplossing het restmateriaal en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
  4. Herhaal zacht mechanisch roeren met een 3 ml spuit en een 25 G naald, en incubeer de plaat extra 5 - 10 minuten.
  5. Na volledige spijsvertering, bundelen de bovenstaande vloeistof in de collectie buis. Centrifugeer de verzamelbuis bij 400 xg, 4 ° C gedurende 8 minuten om de cellen te verzamelen. Zuig de vloeistof op te schorten en de pellet cellen in 10 ml albumine-rijke buffer en filteren het monster door 100 mm maaswijdte. Tellen cellen met een hemocytometer. Presteren dan stroom cytometrische analyse (hoofdstuk 4) of TEC verrijking (hoofdstuk 5).

4 Identificatie van TEC door flowcytometrie

  • Bereid cellen om een eindconcentratie van 4 x 10 6 cellen per 100 ui in FACS buffer kleuring in een 96 putjes met ronde bodem testplaat en houdt de plaat op ijs. Voeg 20 ul Fc blokkeeroplossing (anti-CD16 / CD32 antilichaam bij 10 ug / ml in FACS-buffer) aan de cellen en incubeer de cellen gedurende 10 min op ijs. Draai de plaat bij 400 xg, 4 ° C gedurende 3 minuten. Gooi vloeistof uit putten door flicking de plaat gezicht naar beneden in een gootsteen.
  • Hang de pellet cellen in 100 pi antilichaam cocktail (anti-CD45, -EpCAM, -MHC klasse II, en -Ly51 antilichamen, en de UEA-1 lectine gelabeld met verschillende fluorchromen bij de fabrikant aanbevolen of getest optimale concentraties van elk antilichaam in FACS-buffer ) en incubeer de cellen op ijs gedurende 20 min in het donker. Tot schadevergoeding, vlekken 1 x 10 6 cellen met elk individu fluorchroom.
  • Voeg 100 ui FACS buffer aan elk putje en draaien de plaat bij 400 xg, 4 ° C gedurende 3 minuten. Herhaal de wasstap eentijd, en resuspendeer cellen in 100 ui FACS-buffer. Breng de cellen om een ​​12 x 15 mm ronde bodem FACS buis gevuld met 300 ul FACS-buffer. Verwerven monsters op flowcytometer en analyseren middels FACS-analyse software. TEC gating strategie wordt getoond in figuur 2.
  • 5 Verrijking van TEC door Pannen

    1. Spin down de thymus cellen (opgesteld in hoofdstuk 3) bij 400 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten. Zuig de vloeistof en schorsen gepelleteerde cellen in FACS sortering buffer bij een concentratie van 2 x 10 8 cellen per ml in een 15 ml of 50 ml conische buis. Add anti-CD90.2 antilichaam (kloon 30-H12) (of anti-CD45) bij een eindconcentratie van 2,5 ug / ml celsuspensie en incubeer cellen zachtjes op een roterende menger bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Na de incubatie, wassen met een 5 - 10x volume RP 10 medium en centrifugeer de buis bij 400 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten.
    2. Zuig de vloeistof en resuspendeer de gepelleteerde cellen inRP 10 medium bij een concentratie van 1 x 10 7 per ml. Voeg 5 ml celsuspensie elke panning beklede plaat (bereid in stap 1.3), werveling en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Wervelen krachtig; breng de supernatanten in een conische buis. Spoel de plaat twee keer met RP10 medium en de supernatants in de collectie buis.
    3. Centrifugeer de verzamelbuis bij 400 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten. Zuig de vloeistof en resuspendeer de gepelleteerde cellen in 5 ml RP10 medium. Voeg de celsuspensie in nieuw panning plaat wervelen en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel de cellen spoel de plaat en samen te in een conische buis. Zodra TEC verrijkt, spin down de cellen op 400 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten en suspendeer de cellen in 5 ml FACS sortering buffer.

    6 Zuivering van TEC door Cell Sorting

    1. Tellen cellen met een hemocytometer en bereiden celsuspensie bij een concentratie van 4 x 10 7 cellen in FACS sortering buffer. Antilichamen des toevoegencribed in paragraaf 4.4 in cel-oplossing en incubeer cellen zachtjes op een roterende mixer bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Na kleuring, wassen en cellen opschorten tot een concentratie van 10 x 10 6 cellen per ml van FACS sortering buffer.
    2. Sorteer TEC subsets door een 100 uM nozzle met behulp van fluorescentie-geactiveerde cel sortering. Gesorteerd cellen worden verzameld in 30% (v / v) FBS in RPMI-1640). Zodra celsortering gedaan, centrifuge cellen bij 400 xg, 4 ° C gedurende 5 min en voorbereiden downstream analyse.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Met dit protocol werd een thymus orgaan uit een volwassen muis (deel 2) en een thymus celsuspensie werd bereid zoals uiteengezet in punt 3 Het verkregen celsuspensie bestond uit thymocyten, hematopoietische afgeleide stromale cellen en niet-hematopoietische stromale cellen. CD45 is een pan-hematopoietische marker expressie zowel thymocyten en hematopoietische stromale cellen zoals macrofagen en dendritische cellen. In tegenstelling, TEC's zijn niet van hematopoietische oorsprong en geen CD45 15 niet te uiten. Cel kleuring en flowcytometrische analyse werden uitgevoerd zoals beschreven in paragraaf 4.

    Twee types van TEC subsets, cTECs en mTECs, afkomstig zijn van een gemeenschappelijke bi-potente TEC voorloper 15. Zowel cTECs en mTECs drukken de EpCAM molecuul op hun oppervlak 28. Aldus TECs kunnen gated volgens EpCAM-positieve en CD45-negatief door flow cytometrie (Figuur 2A). cTECs en mTECs kunnen worden onderscheiden door twee reagentia: het Ly51antilichaam dat glutamyltranspeptidase aminopeptidase door CTEC uitgedrukt erkent, en de lectine Ulex Europaeus agglutinin-1 (UEA-1) 28, dat bindt aan Mtec (figuur 2B). Zowel mTECs en cTECs expressie MHC klasse II moleculen op hun oppervlak (figuur 2C en 2D). mTECs kunnen verder worden ingedeeld in met MTES lage en hoge MTES afhankelijk van het niveau van MHC II moleculen (Figuur 2D). Het gemiddelde aantal TEC per thymus ongeveer 9 x 10 5. In directe vergelijkingen herwonnen we ongeveer 8 maal TEC middels deze Liberase enzym gebaseerde protocol vergeleken met een meerstaps protocol met collagenase / dispase 29 (figuur 3).

    Om sorteertijd verlagen en levensvatbaarheid van teruggewonnen stromale cellen, ontwikkelden we een panning werkwijze voor thymocyten afbreken omdat de thymus celsuspensie uit meer dan 95% thymocyten. Cellen werden geïncubeerd met eenti-CD90 antilichaam en gevangen genomen door voorgelakte platen. In vergelijking met die in de gehele bereide thymus cellen (pre-verrijkte), werd het aandeel TEC gestegen van minder dan 0,5% tot meer dan 15% in post-verrijkte cellen (figuur 4A en 4B). Panning met anti-CD45 kan worden gebruikt wanneer bijvoorbeeld, hoeft men niet te dendritische cellen herstellen ook. In dit geval TEC verrijking toe tot ongeveer 80% (gegevens niet getoond). Na stromale cel verrijking van panning werden de verhoudingen van TEC subsets onveranderd (Figuur 4C en 4D), wat suggereert dat een deel of de andere niet selectief verloren tijdens panning. In vergelijking met de pre-verrijking monster, de recovery rate van TEC was ongeveer 85% (figuur 4E).

    Figuur 1
    Figuur 1 De muis thymus during dissectie. De thymus is gelegen boven het hart van de anterior superior thorax. Na het snijden en het optillen van de ribben, de twee witte lobben van de thymus worden blootgesteld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

    Figuur 2
    Figuur 2 Identificatie van Ctec en MTEC met flowcytometrische data-analyse. Stained thymus cel monsters werden geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. Vertegenwoordiger FACS profielen worden getoond. De getallen geven het percentage van elke populatie. (A) van levende cellen, een poort van CD45-negatieve en EpCAM-positieve gebeurtenissen vertegenwoordigt TEC cellen. (B) In de TEC poort, zijn twee populaties van elkaar gescheiden door de mate van Ly51 en UEA- 1. cTECs hogeer uitdrukking van Ly51; mTECs hebben hogere UEA-1. (C) MHC II moleculen sterk uitgedrukt cTECs. (D) mTECs omvat MHC II hoog en MHC II low sub-populaties, die afzonderlijk worden genoemd MTES hoge en lage Mtec. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

    Figuur 3
    Figuur 3 A Liberase-gebaseerd protocol toegestaan ​​hogere cel opbrengst van thymus dan een multi-step collagenase / dispase protocol. Thymus cellen werden bereid door een eerder gepubliceerde meerstaps collagenase / dispase protocol of deze Liberase-gebaseerd protocol. De twee groepen monsters werden geanalyseerd door flow cytometrie. (A) </ Strong> vertegenwoordiger FACS profielen worden getoond. De getallen geven de percentages TEC cellen in elke groep. (B) Totale cel aantallen TEC per muis thymus wordt in de staafgrafiek. Foutbalken geven de standaardafwijking (n> 3). Een twee-tailed, ongepaarde T-test werd uitgevoerd met behulp van software Prism. P <0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

    Figuur 4
    Figuur 4 Verrijking van TEC de panning werkwijze. FACS profielen van pre-en post-verrijkte thymus stromale cellen worden getoond. Opgesteld thymus cellen werden gekleurd met anti-CD90 antilichaam. CD90-positieve thymocytes samen meer dan 95% van de thymus cellen. Tijdens de TEC verrijkingsprocedure, thymocytes zijn Captured en uitgeput aan de pre-beklede plaat panning, worden dus TEC verrijkt in de supernatant. (A) en (B), worden TEC poorten getoond. De getallen tonen het percentage TECs tussen totale levende cellen in de populatie waarvan (Pre-verrijking) of na verrijking (na verrijking). (C) en (D), cellen in Ctec en MTES poorten getoond. De nummers geven de percentages Ctec en MTES de TEC populaties van elke groep. (E) Cell aantallen cTECs en mTECs per muis thymus worden in de grafiek. Gegevens zijn representatief van 5 experimenten. "Pre" staat voor pre-verrijking monster; "Post" staat voor post-verrijking monster; kleine horizontale lijnen geven het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    In het protocol, kritische stappen zijn de voorbereiding van de thymus stromale cellen (hoofdstuk 3) en de verrijking van de TEC's (paragraaf 4). Het wordt sterk aanbevolen dat verse enzym wordt bereid elke keer en het weefsel wordt zo snel mogelijk behandeld. Voor samengevoegd thymi, optimale volume enzymoplossing wordt afhankelijk van het aantal thymi. Indien weefsel residuen na de verwerking, het toevoegen van meer enzymoplossing en verlenging incubatietijd kan celopbrengst toenemen. Tijdens de verrijking van TEC, de voltooiing van de collectie van het supernatant en het herhalen van de plaat te spoelen geschetst in paragraaf 5.3 zal cel verlies afnemen.

    In 1980, Wekerle et al. eerst melding gemaakt van een soort van TEC - "thymus verpleegkundige cellen" (TNC's) 33, die grote corticale epitheelcellen die volledig omhullen vele levensvatbare lymfecellen binnen intracellulaire blaasjes zijn. In 1982, Kyewski en Kaplan beschreven diverse isolatie conditions dat de opbrengst van de TNC's 34 beïnvloeden. Onlangs, Takahama en collega revisited de isolatie en de kenmerken van de TNC's. Zij identificeerden dergelijke cellen op basis van preferentiële kleuring voor CD45 na membraan permeabilisatie 35. Ook beschreven "gebroken" TNC de voorbereiding, bestaande uit een Ctec en meerdere gebonden thymocyten. Dergelijke gebroken TNC waren positief voor extracellulaire CD45 en voor de Ctec marker β5t en bestond 70% van het totaal cTECs in hun voorbereiding. Inderdaad, we hebben geconstateerd ook een soortgelijke cel bevolking, die CD45 hoge EpCAM- + en Ly51 + in onze voorbereide thymus celsuspensie was, maar bestond uit minder dan 40% van het totaal cTECs met onze isolatie procedure. Deze gebroken TNC worden verwijderd van TEC verrijking protocollen, zoals de onze, dat uitputting gebruiken met ofwel CD90 of CD45. Zo zal een toekomstige uitdaging om het verlies van deze populatie te minimaliseren.

    Vergelekende bestaande meerstaps destructieprocedure 29, de Liberase digestie protocol kan een aanzienlijk hoger celopbrengst van TEC (figuur 3). Andere groepen hebben ook verslag uit over hun nieuwe methoden voor de thymus stroma celisolatie door aanpassing methode 30,36 Gray's, hoewel celopbrengst nam niet significant toe. Onlangs, Chidgey en collega's onafhankelijk rapporteerde een TEC-protocol met behulp Liberase spijsvertering en ze verkregen ook effectief release van TEC 37. De eerste stap thymocyt afgifte van hun protocol heeft het potentieel om ongeveer 1,6 x 10 4 TEC ontdoen van elk thymus 29, waarvan de meeste cTECs. Vanwege de dichtheid gradiënt verrijking leiden tot het verlies van kleinere stromale cellen, is een AutoMACS-gebaseerde CD45-microbead uitputting in de volksmond gebruikt voor de verrijking van TEC's voorafgaand aan FACS zuivering 29,36,37. In vergelijking met de AutoMACS-gebaseerde verrijking met behulp van CD45-microbead uitputting protocollen 29, depanning verrijking verkregen hogere recovery rates van TEC. Over het algemeen, het protocol hier gepresenteerde aggregaten een aantal eerder gerapporteerde voordelen. TEC subsets gezuiverd met dit protocol (hoofdstuk 6) zijn met succes gebruikt voor verdere analyse, zoals Real Time-PCR en Western blot analyse 12.

    Dit protocol is geschikt voor isolatie en onderzoek van andere thymus stromale cellen, zoals dendritische cellen. Wij geloven dat robuuste isolatie van thymus stromale cellen, met name TEC, begrijpen hoe de thymus functies voor T cel ontwikkeling en verwezenlijking in vitro T-cel samenstelling versnelt. Bovendien karakterisatie van deze cellen heeft grote praktische waarde voor de medische gemeenschap, aangezien een veel voorkomend probleem bij herstel van therapieën (zoals gebruikt bij transplantatie en kanker behandeling) slecht reconstitutie van epitheelcellen in de thymus leidt tot immunodeficiëntie.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

    Acknowledgments

    Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (Kah). We danken ook de Universiteit van Minnesota flowcytometrie Resource.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
    2. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
    3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
    4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
    5. Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
    6. Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
    7. Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
    8. Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
    9. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
    10. Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
    11. Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
    12. Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
    13. Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
    14. Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
    15. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
    16. Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
    17. Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
    18. Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
    19. Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
    20. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
    21. Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
    22. Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
    23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
    24. Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
    25. Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
    26. Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
    27. Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
    28. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
    29. Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
    30. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
    31. Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7, (Unit 7.3), (2001).
    32. Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3, (Unit 3.5), (1991).
    33. Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
    34. Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
    35. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
    36. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
    37. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).

    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics