Isolering, identifikation og oprensning af murine thymusepitelmonolag Celler

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her beskriver vi en effektiv fremgangsmåde til isolering, identifikation og oprensning af muse thymiske epitelceller (TECs). Protokollen kan bruges til undersøgelser af thymus funktion for en normal T-celle udvikling, thymus-dysfunktion, og T-celle rekonstitution.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Thymus er et vigtigt organ for T-lymfocyt-udvikling. Thymuslidelser stromalceller, thymiske epitelceller (TECs) er særligt afgørende på flere stadier af T-celle udvikling: T-celle engagement, positiv udvælgelse og negativ udvælgelse. Imidlertid forbliver funktion TEC i thymus ufuldstændigt forstået. I artiklen giver vi en metode til at isolere TEC delmængder fra frisk mus thymus ved hjælp af en kombination af mekanisk sprængning og enzymatisk nedbrydning. Metoden giver mulighed for thymiske stromale celler og thymocytter til effektivt frigivet fra celle-celle og celle-ekstracellulær matrix-forbindelser og til at danne en enkelt-celle suspension. Brug af isolerede celler, kan multiparameter flowcytometri anvendes til identifikation og karakterisering af TEC og dendritiske celler. Fordi TEC er en sjælden cellepopulation i thymus, vi beskriver også en effektiv måde at berige og oprense TEC ved at nedbryde thymocytter, den mest rigelige celletype i thymus. Follofløj berigelsen, cellesortering tid kan reduceres, således at tab af levedygtighed celle kan minimeres under oprensning af TEC. Rensede celler er egnet til forskellige downstream analyser som Real Time-PCR, Western blot og genekspression profilering. Protokollen vil fremme forskning TEC funktion og samt udvikling af in vitro-T-celle rekonstitution.

Introduction

Tidligt i T-celle udvikling, er knoglemarv hæmatopoietisk stamcelletransplantation afledt multipotente progenitorer rekrutteret til cortex af thymus, gennemgår engagement T afstamning og bliver T-celle forstadier 1. I cortex, T-celle-prækursor CD4 og CD8 dobbelt negative (DN) thymocytter udvide og differentiere til umodne CD4 og CD8 dobbelt positive (DP) thymocytter, der udgør en stor pulje af stamfædre med meget variable T-cellereceptorer 1. Kun en udvalgt MHC-begrænset delmængde af DP-celler bliver CD4 eller CD8 enkelt positive (SP) thymocytter, migrere til medulla thymus og differentierer til funktionelt kompetente modne T-celler, en hændelse, der betegnes som positiv selektion 2- 6. I modsætning hertil kloner af auto-reaktive thymocyter gennemgå negativ udvælgelse og fjernes via apoptose, omregnet til regulatoriske T-celler til selv-tolerance, eller omdirigeret til intraepitel lymfocytter til formål, der endnu ikke klart 3,7-10.

I thymus, thymus stromaceller danner en unik mikromiljø give signaler for disse forskellige T celle udvikling skæbne 5,11,12. Thymiske stromaceller er sammensat af thymiske epitelceller (TECs) - herunder kortikale TEC (cTECs) og medullære TEC (mTECs), dendritiske celler, makrofager, fibroblaster, endotelceller, neurale crest-afledte pericytter og andre mesenchymale celler 13-15. Blandt disse TEC er afgørende på de forskellige stadier af T-celle udvikling 1,2,16,17. Imidlertid har manglen på en robust måde at isolere TEC hæmmet en bred forståelse af deres funktioner 16. Især cTECs, der danner et tredimensionalt netværk omkring progenitorer i cortex, er afgørende for positiv selektion 13,18,19 af årsager, der endnu ikke klart. Tidligere undersøgelser forudsat fingerpeg om heterogenitet og rolle TEC, for det meste afhængige af morfologiske og histologiske værktøjer 13 12,20. En robust og reproducerbar måde at isolere TECs er afgørende for at opnå objektiv karakterisering af TEC delmængder, kvantitativ og kvalitativ vurdering af TEC funktioner og afklaring af mekanismer, hvordan cTECs understøtter positiv selektion.

På grund af sjældenheden af ​​TEC i thymus og de stramme interaktioner danner de i den intakte orgel er isoleringen af ​​TEC været udfordrende. Den her beskrevne protokol er baseret på tidligere opdagelser, pt tilgængelige reagenser, teknikker og viden om thymus struktur og stromale sammensætning. Næsten to årtier siden blev flere procedurer rapporteret at opdele thymus væv 21-27, hvor forskellige enzymer blev anvendt under fordøjelsen, herunder trypsin, Collagenase og Dispase. Gray et al. sammenlignede disse enzymer i deres precedure 28, og rapporterede en forbedret method med en multiple-trins fordøjelse af enzym cocktails 29, der blev udbredt 20,30. Men denne metode indebærer en lang forberedelsestid og komplekse fordøjelse trin og resultater i variabel endelige celletal og proportioner TEC selv i samme murine kohorte 29,30. Flere år siden, Liberase forskning klasse enzym, der indeholder højt oprenset Collagenase og neutral protease begyndte at blive brugt i thymus væv dissociation 30. Her beskriver vi en Liberase fordøjelse-baseret protokol, med optimerede mekaniske separationsprocedurer, der giver et højt antal levedygtige TEC fra muse thymus væv. .

At berige dissocierede stromaceller har tidligere undersøgelser anvendt enten densitetsgradienter eller separationsteknologi med magnetiske perler 21,29. Men begge metoder forårsage alvorlig tabt af visse bestande af thymiske stromalceller, især befolkningen i cTECs 29. Cytotoksisk eliminering og panorering teknik 12,31. Efter sammenligning af disse teknikker, vi etableret den aktuelle panorering protokol for berigelse af TEC. Den blide tilstand under proceduren berigelse fører til mindre celledød og fordomsfri og øget TEC opsving.

Den isolerede thymus cellesuspension beskrevet i punkt 3 kan anvendes direkte flowcytometrianalyse til identifikation og karakterisering af TEC delmængder og dendritiske celler. Afsnit 4 beskriver en enkel og brugbar måde at identificere TEC delmængder anvender multiparameter flowcytometer. Til eksperimenter, der søger at opnå oprensede cTECs eller mTECs TEC berigelse og cellesortering procedurer kan findes i afsnit 5 og 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I denne undersøgelse, voksen - blev (6 8 uger) C57BL / 6 mus anvendes. Mus blev købt fra National Cancer Institute og holdt under SPF forhold. University of Minnesota Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) godkendte alle dyreforsøg.

1. Fremstilling af instrumenter og buffere

  1. Forbered enzymopløsning (RPMI1640-medium med 0,05% [vægt / volumen] af Liberase TH og 100 U / ml DNase I), albumin-rig puffer (1X PBS [Ca2 + / Mg2 +-fri] med 0,5% bovint serum albumin og 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre [EDTA]), FACS-puffer (1X PBS [Ca2 + / Mg2 +-fri] indeholdende 1% føtalt bovint serum [FBS] og 0,02% NaN3), FACS-sortering puffer (1X PBS [Ca2 + / Mg2 +-fri] indeholdende 2% FBS), og RP10 medium (RPMI-1640-medium leveres med 10% FBS).
  2. Forbered 10 panorering plader. Forbered 40 ml coatingopløsning (0,01 mg / ml Ghavre anti-rotte IgG i 0,1 M NaHCO3 Buffer), og der tilsættes 4 ml coatingopløsning i hver 100 x 15 mm plade, hvirvel og inkuberes ved 4 ° CO / N. Hæld antistofopløsning og skylle pladen ved hjælp af 5 ml 1x PBS til 2 gange, sving kraftigt mellem skylninger. Opbevar de forberedte plader ved 4 ° C.

2. Høst af Thymus Tissue

  1. Aflive mus i en CO 2 kammer. Sæt dyret på ryggen på en dissektion måtten, pin fødderne på måtten og våd pels ved sprøjtning med 70% ethanol.
  2. Foretag en midtlinjeincision gennem huden, fra over urinrørets åbning lige op til den nedre kæbe med en saks og udvide indsnit nedad til knæene på begge sider. Snittet ligner en på hovedet "Y". Træk den løse hud tilbage på siderne, og pin det til dissektion måtten.
  3. Punktere membranen fra formet som et sværd, skære ribberne på hver side op til omkring kravebenet, og løft derefter op ribbenene medpincet og pin det til dissektion måtten. Thymus er lige under ribbenene og ligner to tynde hvide lapper overliggende hjertet (figur 1). Afbryd bindevæv omkring thymus, træk forsigtigt og fjern par thymus lapper med buede takkede pincet. Sted thymus lapper i en 6-brønds plade indeholdende 5 ml RPMI-1640.

3. Fremstilling af tymisk stromacellers

  1. Trim omgivende fedt og bindevæv og overføre thymus lapper til en ny brønd i 6-brønds plade indeholdende 5 ml frisk forberede enzymopløsning. Lav små indsnit i thymus lapper med fine sakse og inkuber pladen ved 37 ° C i 20 min.
  2. Forsigtigt pipette fordøje thymus væv op og ned 2 - 3 gange med 5 ml pipette for vævs dissociation. Saml supernatantfraktionen i et 50 ml-rør indeholdende 10 ml kold albumin-rig buffer at neutralisere enzymer. Hold opsamlingsrøret på is. Tilføj 2,5ml enzymopløsning til det resterende væv og inkuber pladen ved 37 ° C i 15 min.
  3. Udfør forsigtig mekanisk omrøring med en 3 ml sprøjte og 18 G kanyle at opbryde aggregater. Pool supernatant i opsamlingsrøret. Tilføj 2,5 ml enzymopløsning til det resterende væv og inkuber pladen ved 37 ° C i 15 min.
  4. Gentag forsigtig mekanisk omrøring med en 3 ml sprøjte og en 25 G nål og inkuber pladen yderligere 5 - 10 min.
  5. Efter fuldstændig spaltning, pool supernatanten i indsamlingen røret. Centrifuger opsamlingsrøret ved 400 xg, 4 ° C i 8 minutter for at opsamle cellerne. Aspirer væsken og suspendere de pelleterede celler i 10 ml albumin-rig buffer og filtreres prøven gennem 100 mm masker. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer. Udfør derefter flow cytometic analyse (afsnit 4) eller TEC berigelse (Afsnit 5).

4. Identifikation af TEC ved flowcytometri

  • Forbered cellerne til en slutkoncentration på 4 x 10 6 celler pr 100 gl i FACS-buffer til farvning i en 96-brønds rundbundet testplade og holde pladen på is. Der tilsættes 20 ul Fc blokopløsning (anti-CD16 / CD32 antistof ved 10 ug / ml i FACS-buffer) til cellerne og inkuberes cellerne i 10 minutter på is. Spin pladen ved 400 x g, 4 ° C i 3 minutter. Kassér væske fra brøndene ved at stille pladen ansigt ned i en vask.
  • Hæng pelleterede celler i 100 ul antistofcocktail (anti-CD45, -EpCAM, -MHC klasse II og -Ly51 antistoffer og UEA-1 lektin mærket med forskellige fluorokromer på fabrikanten anbefalede eller testede optimale koncentrationer af hvert antistof i FACS-buffer ), og inkuber cellerne på is i 20 minutter i mørke. Til erstatning, bejdse 1 x 10 6 celler med hver enkelt fluorokrom.
  • Tilsæt 100 pi FACS-buffer til hver brønd og dreje pladen ved 400 x g, 4 ° C i 3 minutter. Gentag vasketrinet entid, og derefter resuspenderes cellerne i 100 pi FACS buffer. Overfør cellerne til et 12 x 15 mm rundbundet FACS-rør fyldt med 300 pi FACS buffer. Anskaf prøver på flowcytometer og analysere data ved hjælp af FACS-analyse-software. TEC gating strategi er vist i figur 2.
  • 5. Berigelse af TECs ved at panorere

    1. Spin ned thymusceller (fremstillet i afsnit 3) ved 400 xg, 4 ° C i 5 min. Aspirer væsken og suspendere de pelleterede celler i FACS-sortering puffer ved en koncentration på 2 x 10 8 celler pr ml i et 15 ml eller 50 ml konisk rør. Tilføj anti-CD90.2 antistof (klon 30-H12) (eller anti-CD45) i en endelig koncentration på 2,5 ug / ml cellesuspension og inkuber cellerne forsigtigt på en roterende blander ved 4 ° C i 30 minutter. Efter inkubation vaskes med en 5 - 10x volumen RP10 medium og centrifugeres røret ved 400 xg, 4 ° C i 5 min.
    2. Aspirer væsken og resuspenderes de pelleterede celler iRP10 medium ved en koncentration på 1 x 10 7 per ml. Tilsæt 5 ml cellesuspension til hver overtrukket panorering plade (fremstillet i trin 1.3), hvirvel og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Swirl energisk; overføre supernatanter i et konisk rør. Skyl pladen to gange ved brug RP10 mellemstore og Supernatanterne i opsamlingsrøret.
    3. Centrifugeres opsamlingsrøret ved 400 xg, 4 ° C i 5 min. Aspirer væsken og resuspenderes de pelleterede celler i 5 ml RP10 medium. Tilføj cellesuspensionen til en ny panorering plade hvirvle og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Indsamle cellerne skylles pladen og samle dem i en konisk rør. Når TEC er beriget, spin ned cellerne ved 400 x g, 4 ° C i 5 minutter og suspenderes cellerne i 5 ml FACS-sortering puffer.

    6. Oprensning af TEC ved cellesortering

    1. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og forberede cellesuspension ved en koncentration på 4 x 10 7 celler i FACS-sortering puffer. Tilføj antistoffer described i afsnit 4.4 i celle opløsning og inkuber cellerne forsigtigt på en roterende blander ved 4 ° C i 30 minutter. Efter farvning, vask og suspendere cellerne til en koncentration på 10 x 10 6 celler pr ml FACS-sortering puffer.
    2. Sorter TEC delmængder gennem en 100 uM dyse ved hjælp af fluorescens-aktiveret cellesortering. Sorteret celle opsamles i 30% (v / v) FBS i RPMI-1640). Når celle sortering er færdig, centrifugeres cellerne ved 400 xg, 4 ° C i 5 min og forberede nedstrøms analyse.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Ved anvendelse af denne protokol blev en thymus organ fjernet fra en voksen mus (afsnit 2) og en thymus cellesuspension blev fremstillet som beskrevet i afsnit 3. Den opnåede cellesuspension bestod af thymocytter, hæmatopoietiske-afledte stromaceller og ikke-hæmatopoietiske stromaceller. CD45 er en hæmatopoietisk pan-markør udtrykt på både thymocytter og hæmatopoietiske stromale celler, såsom makrofager og dendritiske celler. I modsætning hertil TEC er ikke af hæmatopoietisk oprindelse og ikke udtrykker CD45 15. Cellefarvning og flowcytometrisk analyse blev udført som beskrevet i afsnit 4.

    To typer af TEC delmængder, cTECs og mTECs, stammer fra en fælles bi-potent TEC forstadiet 15. Både cTECs og mTECs udtrykker EpCAM-molekylet på overfladen 28. Således TEC kan gated ifølge EpCAM-positive og CD45-negative ved flowcytometri (figur 2A). cTECs og mTECs kan skelnes ved to reagenser: Det Ly51antistof, der genkender glutamyl aminopeptidase udtrykt ved CTec og lectin Ulex Europaeus agglutinin-1 (UEA-1) 28, som binder til MTEC (figur 2B). Begge mTECs og cTECs udtrykker MHC klasse II-molekyler på deres overflade (figur 2C og 2D). mTECs kan yderligere inddeles i til MTEC lav og MTEC høj afhængigt af niveauet af MHC-II-molekyler (figur 2D). Det gennemsnitlige antal TEC pr thymus er omkring 9 x 10 5. I direkte sammenligninger, vi genvundet omkring 8 gange flere TEC bruge denne Liberase enzym baseret protokol i forhold til en multi-trins protokol med collagenase / dispase 29 (figur 3).

    For at mindske sortering tid og øge rentabiliteten af ​​genvundne stromaceller, har vi udviklet en panorering metode til at udtømme thymocyter fordi thymus cellesuspensionen består af over 95% thymocytter. Celler blev inkuberet med etTI-CD90-antistof og taget til fange af forovertrukne plader. I forhold til, at der i hele tilberedte thymusceller (præ-berigede), blev andelen af TEC steg fra mindre end 0,5% til over 15% i post-berigede celler (figur 4A og 4B). Panning med anti-CD45 kan også anvendes, hvis for eksempel, behøver man ikke at genvinde dendritiske celler samt. I dette tilfælde TEC berigning stiger til omkring 80% (data ikke vist). Efter stromacelle berigelse ved at panorere, blev andelen af TEC delmængder ikke ændret (figur 4C og 4D), hvilket tyder på, at den ene den anden delmængde eller ikke selektivt tabt under panorering. Sammenlignet med den præ-berigelse prøve, recovery rate af TECs var omkring 85% (figur 4E).

    Figur 1
    Figur 1. Musen thymus during dissektion. Thymus ligger over hjertet i anterior superior brystkassen. Efter opskæring og løfte ribbenene, de to hvide kamre af thymus er udsat. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2. Identifikation af CTec og MTEC med flowcytometrisk analyse af data. Stained thymus celleprøver blev analyseret under anvendelse af flowcytometri. Repræsentative FACS-profiler er vist. Tallene angiver den procentvise andel af hver population. (A) på levende celler, en port af CD45-negative og EpCAM-positive begivenheder repræsenterer TEC celler. (B) Inden TEC porten, er to populationer adskilt af niveauet af Ly51 og UEA- 1. cTECs har højER udtryk for Ly51; mTECs har højere niveau af UEA-1. (C) MHC II-molekyler er kraftigt udtrykt på cTECs. (D) mTECs består af MHC II høje og MHC II lave subpopulationer, der hver for sig benævnt MTEC høj og MTEC lav. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3. En liberase-baseret protokol tillod højere celleudbytter fra thymus end at bruge en multi-trins collagenase / dispase protokol. Thymus celler blev fremstillet ved anvendelse af en tidligere offentliggjort flere trin collagenase / dispase protokol eller denne liberase-baseret protokol. De to grupper af prøver blev analyseret ved flowcytometri. (A) </ Strong> Repræsentative FACS profiler er vist. Tallene angiver de procentdele af TEC celler i hver gruppe. (B) Samlet celletal TEC pr mus thymus er vist i søjlediagrammet. Fejlsøjler angiver standardafvigelsen (n> 3). En to-halet, uparret t-test blev udført ved hjælp af software Prism. P <0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 4
    Figur 4. Berigelse af TEC ved panorering metoden. FACS profiler af før og efter beriget thymisk stromale celler er vist. Tilberedt thymus celler blev farvet med anti-CD90 antistof. CD90-positive thymocyter komponere over 95% af thymusceller. Under TEC berigelse procedure, thymocytter er Captured og forarmet på den præ-coatede panorering plade, er således TEC beriget i supernatanten. (A) og (B), er TEC porte vist. Tallene viser den andel af TEC blandt samlede levende celler i start befolkning (Pre-berigelse) eller efter tilsætning (Post-berigning). (C) og (D), er celler inden CTec og MTEC porte vist. Tallene viser de procentdele af CTec og MTEC i TEC befolkninger fra hver gruppe. (E) Cell antal cTECs og mTECs per mus thymus er vist i grafen. Data er repræsentative for fem eksperimenter. "Før" står for præ-berigelse prøve; "Post" står for post-berigelse prøve; små vandrette linjer angiver middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    I protokollen, kritiske trin er fremstillingen af ​​thymus stromale celler (afsnit 3) og berigelsen af ​​TEC (afsnit 4). Det anbefales kraftigt, at frisk enzym opløsning fremstilles hver gang og vævet behandles så hurtigt som muligt. Til poolet thymi, optimerer mængden af ​​enzymopløsning kræves afhængigt af antallet af thymi. Hvis væv rester efter behandlingen, kan tilføje mere enzymopløsning og udvidelse af inkubationstiden øges celleudbytte. Under berigelse af TEC, færdiggøre indsamling af supernatanten og gentage pladen skylning skitseret i afsnit 5.3 vil falde celle tab.

    I 1980 Wekerle et al. først rapporteret en type TEC - "thymiske sygeplejerske celler" (TNC) 33, som er store kortikale epitelceller som helt omslutter mange levedygtige lymfoide celler i intracellulære vesikler. I 1982 Kyewski og Kaplan beskrevet forskellige isolation conditions der påvirker udbyttet af transnationale 34. For nylig, Takahama og kolleger revisited isolation og karakteristika transnationale. De identificerede sådanne celler på basis af præferentiel farvning for CD45 efter membranpermeabilisering 35. De har også beskrevet "knækket" TNC i deres forberedelse, som bestod af en CTec og flere bundne thymocytter. Sådanne brudt TNC var positive for ekstracellulære CD45 og for CTec markør β5t og omfattede 70% af de samlede cTECs i deres forberedelse. Faktisk har vi også observeret et lignende cellepopulation, som var CD45 høj EpCAM + og Ly51 + i vores rede thymus cellesuspension, men omfattede mindre end 40% af den samlede cTECs med vores isolation procedure. Disse brudt TNC fjernes fra TEC berigelse protokoller, som vores, der udnytter udtynding med enten CD90 eller CD45. Således vil en fremtidig udfordring være at minimere tabet af denne population.

    Sammenlignettil den eksisterende flertrinsproces fordøjelse procedure 29 den Liberase fordøjelse protokol tillader en betydeligt højere celleudbytte af TEC (figur 3). Andre grupper har også indberettet deres nye metoder til thymisk stromacelle isolation ved at ændre Grays metode 30,36, selvom celleudbytte ikke var steget betydeligt. For nylig, Chidgey og kolleger selvstændigt rapporteret en TEC protokol hjælp Liberase fordøjelse, og de ​​også opnået effektiv frigørelse af TEC 37. Den første thymocyt frigivelse trin deres protokol har imidlertid potentiale til at skille omkring 1,6 x 10 4 TEC fra hver thymus 29, hvoraf de fleste er cTECs. Grundet densitetsgradienten berigelse forårsager tab af mindre stromalceller er en AutoMACS-baserede CD45-mikroperlesuspensionen udtømning populært anvendes til berigelse af TECs før FACS oprensning 29,36,37. Sammenlignet med AutoMACS-baserede berigelse ved hjælp af CD45-mikroperlesuspensionen depletion protokoller 29, depanorering berigelse opnået højere genanvendelsesprocenter for TEC. Samlet set protokol præsenteres her aggregerer en række tidligere rapporterede fordele. TEC delmængder oprenset med denne protokol (afsnit 6) har med held anvendt til yderligere analyse, som Real Time-PCR og Western blot-analyse 12.

    Denne protokol er også velegnet til isolering og undersøgelse af andre thymiske stromale celler, såsom dendritiske celler. Vi mener, at robust isolering af thymiske stromale celler, især TEC, vil accelerere forståelse af, hvordan thymus funktioner for T-celle udvikling og opnåelse in vitro T-celle forfatning. Desuden karakterisering af disse celler har stor praktisk værdi for det medicinske samfund, da et fælles problem med nyttiggørelse fra behandlinger (som dem der bruges i transplantation og kræftbehandling) er dårlig rekonstituering af epitelceller i thymus, der fører til immundefekt.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgments

    Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (til KAH). Vi takker også University of Minnesota flowcytometri ressource.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
    2. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
    3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
    4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
    5. Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
    6. Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
    7. Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
    8. Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
    9. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
    10. Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
    11. Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
    12. Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
    13. Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
    14. Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
    15. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
    16. Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
    17. Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
    18. Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
    19. Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
    20. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
    21. Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
    22. Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
    23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
    24. Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
    25. Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
    26. Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
    27. Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
    28. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
    29. Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
    30. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
    31. Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7, (Unit 7.3), (2001).
    32. Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3, (Unit 3.5), (1991).
    33. Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
    34. Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
    35. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
    36. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
    37. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).

    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics