Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

Immunology and Infection

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Summary

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.

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Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

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Abstract

Der Thymus ist ein wichtiges Organ für die T-Lymphozyten-Entwicklung. Von Thymus-Stromazellen sind Thymus-Epithelzellen (TEC) besonders wichtig in mehreren Stufen von T-Zell-Entwicklung: T-Zell-Engagement, positive und negative Selektionsauswahl. Allerdings bleibt die Funktion der TEC in der Thymusdrüse unvollständig verstanden. In dem Artikel wird ein Verfahren zur TEC Teilmengen aus frischen Maus Thymus mit einer Kombination von mechanischen Störungen und enzymatische Verdauung zu isolieren. Das Verfahren ermöglicht Thymus-Stroma-Zellen und Thymozyten effizient von Zell-Zell-und Zell-extrazellulären Matrix-Verbindungen freigesetzt werden, und um eine Einzelzellsuspension zu bilden. Verwendung der isolierten Zellen können Multi Durchflusszytometrie, um die Identifizierung und Charakterisierung von TECs und dendritischen Zellen verwendet werden. Da TEC sind eine seltene Zellpopulation im Thymus, wir beschreiben auch eine effektive Möglichkeit zu bereichern und zu reinigen TEC durch abbau Thymozyten, die am häufigsten vorkommende Zelltyp im Thymus. FolloFlügel die Anreicherung, Zellsortierzeit kann verringert werden, so dass der Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen kann während der Reinigung von TEC minimiert werden. Gereinigten Zellen sind für verschiedene Downstream-Analysen wie Echtzeit-PCR, Western-Blot-und Gen-Expressionsprofilen. Das Protokoll wird die Forschung von TEC-Funktion und so gut wie die Entwicklung von in-vitro-T-Zell-Rekonstitution zu fördern.

Introduction

Frühen T-Zell-Entwicklung werden Knochenmark hämatopoetische Stammzellen abgeleiteten multipotenten Vorläuferzellen an der Rinde des Thymus rekrutiert zogen Engagement der T-Linie und zu T-Zell-Vorläufer 1. In der Rinde, T-Zell-Vorläufer-CD4 und CD8 doppelt negative (DN) Thymozyten erweitern und differenzieren sich in unreifen CD4 und CD8 doppelt positiven (DP) Thymozyten, bilden einen großen Pool von Vorläuferzellen mit sehr unterschiedlichen T-Zell-Rezeptoren 1. Nur eine ausgewählte MHC-beschränkten Teilmenge von DP-Zellen werden CD4 oder CD8 einzigen positiven (SP) Thymozyten zu werden, wandern in der Medulla des Thymus und differenzieren sich in funktional zuständigen reifen T-Zellen, eine Veranstaltung, die als positive Selektion bezeichnet wird 2 6. Im Gegensatz dazu Klone von autoreaktiven Thymozyten zogen negative Selektion und über Apoptose entfernt, um regulatorische T-Zellen, die für Selbst-Toleranz umgewandelt oder intraepitheliale Lymphozyten für Zwecke, die nicht klar sind, abgeleitet 3,7-10.

Im Thymus Thymus-Stromazellen bilden eine einzigartige Mikroumgebung, die Signale für die verschiedenen T-Zell-Entwicklung Schicksale 5,11,12. Einschließlich Rinden TECs (CTEC) und Mark TECs (mTEZ), dendritische Zellen, Makrophagen, Fibroblasten, Endothelzellen, Neuralleiste stamm Perizyten und anderen mesenchymalen Zellen 13-15 - Thymus-Stroma-Zellen von Thymus-Epithelzellen (TECs) besteht. Unter diesen sind TECs entscheidend auf den verschiedenen Stufen der T-Zell-Entwicklung 1,2,16,17. Allerdings hat noch kein robuster Weg zu isolieren TEC ein umfassendes Verständnis ihrer Funktionen 16 behindert. Insbesondere CTEC, die eine dreidimensionale Netzwerk umgebenden Vorläuferzellen im Cortex zu bilden, sind für die positive Selektion 13,18,19 aus Gründen, die nicht klar sind. Frühere Studien lieferten Hinweise auf die Heterogenität und die Rolle der TEC, meist unter Berufung auf morphologische und histologische Werkzeuge 13 12,20 gerichtet. Eine robuste und reproduzierbare Weise zu isolieren TEC ist von grundlegender Bedeutung, um unvoreingenommene Charakterisierung von TEC Teilmengen, quantitative und qualitative Bewertung der TEC-Funktionen, und die Klärung der Mechanismen zu erreichen, wie CTEC unterstützt positive Selektion.

Aufgrund der Seltenheit von TECs im Thymus und den engen Wechselwirkungen sie im intakten Organ zu bilden, die Isolierung von TECs wurde schwierig. Das hier beschriebene Protokoll basiert auf früheren Entdeckungen, die derzeit erhältlichen Reagenzien, Techniken und Kenntnisse der Thymus Struktur und Stromazellen Zusammensetzung. Vor fast zwei Jahrzehnten wurden mehrere Verfahren berichtet, Thymus Gewebe 21-27, in denen verschiedene Enzyme wurden während der Verdauung verwendet werden, einschließlich Trypsin, Collagenase und Dispase aufzuschlüsseln. Gray et al. verglichen diese Enzyme in ihrer precedure 28 und berichtet eine verbesserte Method mit einem mehrstufigen Verdauung von Enzym-Cocktails, die 29 wurde weit verbreitet 20,30. Jedoch beinhaltet dieses Verfahren eine lange Vorbereitungszeit und komplexe Schritte Verdauung und führt variable endgültige Zellzahlen und Mengenverhältnisse der TECs sogar in der gleichen Maus-Kohorte 29,30. Vor einigen Jahren Liberase Research Grade Enzym enthält hoch gereinigte Kollagenase und neutraler Protease begonnen, in Thymus Gewebedissoziation 30 verwendet werden. Hier beschreiben wir eine Liberase Verdauung-basiertes Protokoll, mit optimierten mechanischen Trennverfahren, die eine hohe Anzahl von lebensfähigen TEC aus Maus-Thymus Gewebe ergibt. .

Dissoziiert Stromazellen zu bereichern, haben frühere Studien entweder Dichtegradienten oder Magnetkügelchen Trennung 21,29 eingesetzt. , Verursachen jedoch beide Methoden schweren verloren bestimmter Populationen von Thymusstroma Zellen, insbesondere der Bevölkerung von 29 CTEC. Zytotoxische Eliminierung und Panning-Techniken 12,31 verwendet. Nach dem Vergleich dieser Techniken haben wir die aktuellen Panning-Protokoll zur Anreicherung von TEC. Die sanfte Zustand während der Anreicherungsverfahren führt zu weniger Zelltod und unvoreingenommene und erhöhte TEC Erholung.

Die in Abschnitt 3 beschriebenen isolierten Thymus Zellsuspension kann direkt angewendet werden, um durchflusszytometrische Analyse fließen zur Identifizierung und Charakterisierung von TEC Teilmengen und dendritischen Zellen. Abschnitt 4 beschreibt eine einfache und nützliche Methode, um Untergruppen mit TEC Multi Durchflusszytometer zu identifizieren. Für Experimente, die gereinigt oder CTEC mTEZ, TEC Bereicherung und Zellsortierverfahren zu erhalten suchen, finden Sie in Kapitel 5 und 6 zu finden.

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Protocol

In dieser Studie Erwachsenen - wurden (6 8 Wochen) weibliche C57BL / 6 Mäuse verwendet. Mäuse wurden von der National Cancer Institute gekauft und unter spezifischen Pathogen freien Bedingungen gehalten. Die Universität von Minnesota Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt alle Tierversuche.

1. Vorbereitung der Instrumente und Puffer

  1. Vorbereitung Enzymlösung (RPMI1640-Medium mit 0,05% [w / v] von Liberase TH und 100 U / ml DNase I), Albumin-reichen Puffer (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -freiem] mit 0,5% Rinderserum Albumin und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]), FACS-Puffer (1 × PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -freiem], enthaltend 1% fötales Rinderserum [FBS] und 0,02% NaN 3), FACS Sortierpuffer (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -freiem], enthaltend 2% FBS) und RP10 Medium (RPMI-1640-Medium mit 10% FBS zugeführt wird).
  2. Bereiten Sie 10 Panning-Platten. Vorbereitung 40 ml Beschichtungslösung (0,01 mg / ml GHafer anti-Rat IgG in 0,1 M NaHCO 3-Puffer) und 4 ml Beschichtungslösung in jede 100 x 15 mm-Platte, Wirbel und Inkubation bei 4 ° CO / N. Abgießen Antikörperlösung und spülen Sie die Platte mit 5 ml 1x PBS für 2-fache, wirbeln kräftig zwischen Spülungen. Bewahren Sie die vorbereiteten Platten bei 4 ° C.

2. Ernte des Thymus Tissue

  1. Einschläfern Maus in einem CO 2 Kammer. Legen Sie das Tier auf dem Rücken auf einer Matte Dissektion, stecken Sie die Füße auf der Matte und nass das Fell durch Besprühen mit 70% Ethanol.
  2. Machen Sie eine Mittellinienschnitt durch die Haut, ausgehend von dem oben Harnröhrenöffnung gerade nach oben, um den Unterkiefer mit Schere und erweitern den Schnitt nach unten bis zu den Knien auf beiden Seiten. Der Schnitt sieht aus wie ein umgedrehtes "Y". Ziehen Sie die lose Haut wieder an den Seiten, und stecken Sie es in die Dissektion Matte.
  3. Punktion der Membran von dem Schwertfortsatz, schneiden Sie die Rippen auf jeder Seite bis zu dem Schlüsselbein, dann heben Sie die Rippen mitPinzette und stecken Sie es in die Dissektion Matte. Der Thymus ist nur unter den Rippen, und sieht aus wie zwei dünnen weißen Lappen, die über dem Herzen (Abbildung 1). Trennen Bindegewebe rund um den Thymus, ziehen Sie vorsichtig und entfernen Sie das Paar Thymus Lappen mit gebogenen Pinzette Wellenschliff. Ort Thymus Lappen in eine 6-Well-Platte mit 5 ml RPMI-1640.

3. Vorbereitung der Thymusstroma Cells

  1. Trim umgebenden Fett-und Bindegewebe und übertragen Sie die Thymus Lappen zu einem neuen Brunnen der 6-Well-Platte mit 5 ml frisch zubereiten Enzymlösung. Machen kleine Schnitte in den Thymus Lappen mit einer feinen Schere, und Inkubation der Platte bei 37 ° C für 20 min.
  2. Vorsichtig pipettieren verdauen Thymusgewebes oben und unten 2 - 3 mal mit 5 ml Pipette für Gewebedissoziation. Sammeln Standsfraktion in einer 50-ml-Röhrchen mit 10 ml kaltem albuminreichen Puffer, Enzyme zu neutralisieren. Halten Sie den Sammelröhrchen auf Eis. 2.5 hinzufügenml Enzymlösung zu der verbleibenden Gewebes und Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 15 min.
  3. Führen sanfte mechanische Bewegung mit einem 3-ml-Spritze und 18 G-Nadel, um Aggregate aufzubrechen. Pool Überstand in das Sammelrohr. Hinzufügen von 2,5 ml Enzymlösung zu der verbleibenden Gewebes und Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 15 min.
  4. Wiederholen sanfte mechanische Bewegung mit einem 3-ml-Spritze und einer 25 G-Nadel, und Inkubation der Platte zusätzliche 5 - 10 min.
  5. Nach der vollständigen Verdauung, bündeln den Überstand in das Sammelrohr. Zentrifuge wird das Sammelrohr bei 400 × g, 4 ° C für 8 Minuten, um die Zellen zu sammeln. Saugen Sie die Flüssigkeit und die pelletierten Zellen in 10 ml auszusetzen Albumin-reiche Puffer und Filter die Probe durch 100 mm Maschen. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Führen Sie dann Fluss cytometic Analyse (Abschnitt 4) oder TEC Bereicherung (§ 5).

4. Identifizierung von TEC mittels Durchflusszytometrie

  • Vorbereitung der Zellen bis zu einer Endkonzentration von 4 x 10 6 Zellen pro 100 ul in FACS-Puffer für die Färbung in einer 96-Well-Rundboden-Testplatte und halten die Platte auf Eis. Mit 20 ul Fc Blocklösung (anti-CD16 / CD32-Antikörper bei 10 ug / ml in FACS-Puffer) zu den Zellen und Inkubieren der Zellen für 10 min auf Eis. Drehen Sie die Platte bei 400 g, 4 ° C für 3 min. Verwerfen Flüssigkeit aus Brunnen durch Schwenken der Platte nach unten in ein Waschbecken.
  • Suspendieren die pelletierten Zellen in 100 ul Antikörper-Cocktail (anti-CD45, -EpCAM, -MHC Klasse II, und -Ly51 Antikörper und die UEA-1-Lektin mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen an Hersteller gekennzeichnet empfohlen oder getestet optimalen Konzentrationen jedes Antikörpers in FACS-Puffer ) und Inkubation der Zellen auf Eis für 20 Minuten im Dunkeln. Zur Kompensation Fleck 1 x 10 6 Zellen, die mit jedem einzelnen Fluorochrom.
  • 100 l FACS-Puffer in jede Vertiefung und drehen Sie die Platte bei 400 g, 4 ° C für 3 min. Wiederholen Sie den Waschschritt einZeit, und dann Zellen in 100 ul FACS-Puffer. Übertragung der Zellen auf eine 12 x 15 mm-Rund FACS-Röhrchen mit 300 ul FACS-Puffer gefüllt. Erwerben Proben auf Durchflusszytometer und Daten mit Hilfe der FACS-Analyse-Software zu analysieren. TEC Gating-Strategie ist in Abbildung 2 dargestellt.
  • 5. Anreicherung von TEC durch Schwenken

    1. Spin-Down der Thymus-Zellen (in Abschnitt 3 hergestellt) bei 400 g, 4 ° C für 5 min. Aspirieren der Flüssigkeit und der pelletierten Zellen in FACS-Sortierpuffer auszusetzen bei einer Konzentration von 2 x 10 8 Zellen pro ml in einem 15 ml oder 50 ml konischen Röhrchen. Fügen Anti CD90.2-Antikörpers (Klon 30-H12) (oder anti-CD45) bei einer Endkonzentration von 2,5 ug / ml Zellsuspension und inkubieren Zellen vorsichtig auf einem Rotationsmischer bei 4 ° C für 30 min. Nach der Inkubation, Waschen mit einer 5 - 10-fach Volumen von RP10 Medium und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 g, 4 ° C für 5 min.
    2. Saugen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren pelletierten Zellen inRP10-Medium bei einer Konzentration von 1 x 10 7 pro ml. 5 ml Zellsuspension auf jeden beschichteten Schwenkplatte (in Schritt 1.3 vorbereitet), Wirbel und Inkubation für 30 min bei RT. Wirbeln kräftig; die Überstände wurden in einem konischen Rohr. Spülen Sie die Platte zweimal mit RP10 Medium und den Pool des Überstände in das Sammelrohr.
    3. Zentrifugieren Sie das Sammelrohr bei 400 × g, 4 ° C für 5 min. Saugen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren pelletierten Zellen in 5 ml Medium RP10. Fügen Sie die Zellsuspension auf eine neue Platte Panning, schwenken und Inkubation für 30 min bei RT. Sammeln die Zellen spülen Sie die Platte und bündeln sie zu einem konischen Rohr. Sobald TEC angereichert sind, Spin-Down der Zellen bei 400 g, 4 ° C für 5 min und Suspend-Zellen in 5 ml FACS-Sortierpuffer.

    6. Reinigung von TEC durch Zellsortierung

    1. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und bereiten Zellsuspension mit einer Konzentration von 4 x 10 7 Zellen in FACS-Sortierpuffers. Antikörper des hinzufügencribed in Abschnitt 4.4 in Zell-Lösung und Inkubation Zellen vorsichtig auf einem Rotationsmischer bei 4 ° C für 30 min. Nach der Färbung, Wäsche und Zellen zu suspendieren, um eine Konzentration von 10 x 10 6 Zellen pro ml FACS-Sortierpuffers.
    2. Sortier TEC Teilmengen durch ein 100 uM Düse mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung. Sortiert Zelle werden in 30% (v / v) FBS in RPMI-1640) gesammelt. Sobald Zellsortierung wird, Zentrifuge Zellen durchgeführt bei 400 g, 4 ° C für 5 min und die Vorbereitungen für Downstream-Analyse.

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    Representative Results

    Mit diesem Protokoll wurde ein Thymus Organ von einer erwachsenen Maus (Abschnitt 2) und einer Thymus-Zellsuspension entfernt wurde, wie in Abschnitt 3 skizzierten Die erhaltene Zellsuspension bestand aus Thymozyten hämatopoetischen abgeleiteten Stromazellen und nicht-hämatopoetischen Stromazellen. CD45 ist ein hämatopoetischer pan-Marker exprimiert auf beiden Thymozyten und hämatopoetische stromale Zellen, wie Makrophagen und dendritischen Zellen. Im Gegensatz dazu sind TECs nicht hämatopoetischen Ursprungs und nicht CD45 15 auszudrücken. Zellfärbung und Durchflusszytometrie wurden durchgeführt, wie in Abschnitt 4 beschrieben.

    Zwei Arten von TEC Teilmengen, CTEC und mTEZ, von einem gemeinsamen bi-TEC potenter Vorläufer 15. Beide CTEC und mTEZ drücken die EpCAM-Molekül auf ihrer Oberfläche 28. Somit kann TECs nach EpCAM-positive und CD45-negative durchflusszytometrisch (2A) ausgeblendet werden. CTEC und mTEZ kann durch zwei Reagenzien unterscheiden: der Ly51Antikörper, Glutamyl Aminopeptidase durch cTEC ausgedrückt erkennt und das Lectin Ulex Europaeus Agglutinin-1 (UEA-1) 28, die mTEC (2B) verbindet. Beide mTEZ und CTEC exprimieren MHC-Klasse-II-Moleküle auf ihrer Oberfläche (2C und 2D). mTEZ kann weiter in den mTEC niedrigen und hohen mTEC abhängig von der Höhe der MHC-II-Moleküle (2D) klassifiziert werden. Die durchschnittliche Anzahl der pro TEC Thymus etwa 9 x 10 5. Im direkten Vergleich erholten wir etwa 8-mal mehr TECs mit im Vergleich zu einer mehrstufigen Protokoll mit Kollagenase dieses Liberase Enzym basiertes Protokoll / Dispase 29 (Figur 3).

    Um Sortierzeit verringern und die Lebensfähigkeit der wiedergewonnenen Stromazellen, ein Schwenken Methode Thymozyten führen, da der Thymus-Zellsuspension besteht aus über 95% Thymozyten entwickelt. Zellen wurden mit einer inkubiertenti-CD90-Antikörper und durch Fertigplatten eingefangen. Im Vergleich zu der in der gesamten vorbereiteten Thymus-Zellen (vor-angereicherten), der Anteil der TECs wurde aus weniger als 0,5% auf über 15% in der Post-angereicherten Zellen erhöht (4A und 4B). Panning mit anti-CD45 kann auch verwendet werden, wenn, zum Beispiel, braucht man nicht zu dendritischen Zellen zu gewinnen als auch. In diesem Fall TEC Anreicherung auf etwa 80% (Daten nicht gezeigt). Nach stromalen Zellanreicherung durch Panning wurden die Verhältnisse von TEC Teilmengen nicht verändert (4C und 4D), was darauf hindeutet, dass eine Teilmenge oder die andere nicht selektiv während des Schwenkens verloren. Im Vergleich zu den Vor-Anreicherung Probe, die Rückgewinnungsrate von TEC war etwa 85% (4E).

    Figur 1
    Abbildung 1. Die Maus Thymus During Dissektion. Der Thymus ist über dem Herzen in der vorderen oberen Brustkorb befindet. Nach dem Schneiden und Heben der Rippen, die zwei weißen Lappen des Thymus ausgesetzt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 2
    Abbildung 2. Bezeichnung des cTEC und mTEC mit durchflusszytometrischen Analyse der Daten. Malerei Thymus Zellproben wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Vertreter FACS-Profile werden angezeigt. Die Zahlen geben den prozentualen Anteil der einzelnen Bevölkerungs. (A) an lebenden Zellen, ein Gate CD45-negative und EpCAM-positiven Ereignisse TEC Zellen darstellt. (B) innerhalb der TEC-Tor, sind zwei Populationen von Niveau Ly51 und UEA- getrennt 1. CTEC haben hoheER-Expression von Ly51; mTEZ haben höhere UEA-1. (C) MHC-II-Moleküle sind sehr auf CTEC ausgedrückt. (D) mTEZ besteht aus MHC II hoch und MHC-II-Low-Subpopulationen, die separat als mTEC hoch und niedrig mTEC bezeichnet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 3
    Figur 3. Ein Liberase-basiertes Protokoll erlaubt höhere Zellausbeuten aus Thymus als die Verwendung eines mehrstufigen Kollagenase / Dispase-Protokolls. Thymus-Zellen wurden unter Verwendung eines zuvor veröffentlichten mehrstufige Kollagenase / Dispase-Protokolls oder diese Liberase-basiertes Protokoll hergestellt. Die beiden Gruppen von Proben wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. (A) </ Strong> Repräsentative FACS-Profile werden angezeigt. Die Zahlen geben die Prozentsätze der TEC-Zellen in jeder Gruppe. (B) Zellzahlen von TEC pro Maus Thymus Insgesamt sind im Balkendiagramm dargestellt. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n> 3). Ein zweiseitiges, ungepaarten T-Test wurde durchgeführt unter Verwendung von Software Prism. P <0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 4
    Abbildung 4. Anreicherung von TECs vom Panning-Verfahren. FACS Profile vor und nach der angereicherten Thymus-Stroma-Zellen gezeigt. Hergestellt Thymus-Zellen wurden mit anti-CD90-Antikörper angefärbt. CD90-positiven Thymozyten komponieren über 95% der Thymus-Zellen. Während der TEC Anreicherungsverfahren sind Thymozyten capturED und auf der vorbeschichteten Schwenkplatte erschöpft ist, werden somit TECs im Überstand angereichert. (A) und (B) sind TEC-Gatter gezeigt. Die Zahlen zeigen den Anteil der TEC unter Gesamt lebenden Zellen in der Ausgangspopulation (Pre-Anreicherung) oder nach Anreicherung (Post-Anreicherung). (C) und (D) werden die Zellen innerhalb cTEC und mTEC Toren gezeigt. Die Zahlen zeigen die Prozentsätze der cTEC und mTEC in den TEC-Populationen aus jeder Gruppe. (E) Zellzahlen CTEC und mTEZ pro Maus Thymus sind in der Grafik dargestellt. Daten sind repräsentativ für 5 Experimenten. "Pre" steht für die Anreicherung Probe; "Post" steht für Post-Anreicherung Probe; kleine horizontale Linien zeigen den Mittelwert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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    Discussion

    In dem Protokoll sind wichtige Schritte der Zubereitung des Thymus Stromazellen (Abschnitt 3) und die Anreicherung von TEC (Abschnitt 4). Es wird empfohlen, dass frische Enzymlösung wird jeweils hergestellt, und das Gewebe wird so bald wie möglich behandelt. Für gepoolt Thymi Optimierung des Volumens der Enzymlösung wird in Abhängigkeit von der Anzahl der Thymi erforderlich. Wenn eine Gewebereste nach der Verarbeitung zurückbleiben, zu Hinzufügen von mehr Enzymlösung und Verlängerung der Inkubationszeit Zellausbeute zu erhöhen. Während der Anreicherung von TEC, die Vollendung Sammlung von Überstand und Wiederholung der Platte Spülung in Abschnitt 5.3 beschrieben wird Zellverlust zu verringern.

    1980 Wekerle et al. erstmals über eine Art von TEC - "Thymus-Nährzellen" (TNC) 33, die große kortikale Epithelzellen, die vollständig umhüllen viele lebensfähige lymphatischen Zellen innerhalb intrazellulären Vesikeln sind. Im Jahr 1982 Kyewski und Kaplan beschriebenen verschiedenen Isolation Conditions dass die Ausbeute von TNK 34 beeinflussen. Kürzlich, Takahama und Kollegen revisited die Isolierung und Eigenschaften der transnationalen Konzerne. Sie identifiziert diese Zellen auf der Grundlage der Präferenz Färbung für CD45 erst nach einer Membranpermeabilisierung 35. Sie beschrieben "gebrochen" TNC in ihrer Herstellung, die aus einem cTEC und mehrere gebundene Thymozyten bestand. Solche gebrochenen TNC waren positiv für extrazelluläre CD45 und für die cTEC Marker β5t und umfasst 70% der Gesamt CTEC in ihrer Herstellung. Tatsächlich beobachteten wir auch eine ähnliche Zellpopulation, die CD45 + und hohe EpCAM Ly51 + in die präparierten Thymus-Zellsuspension war, obwohl umfasst weniger als 40% der Gesamt CTEC mit unseren Isolierungsverfahren. Diese gebrochenen TNC aus TEC Anreicherungsprotokolle, wie der unsrigen, die Erschöpfung mit entweder CD90 oder CD45 nutzen entfernt. Somit wird eine zukünftige Herausforderung sein, um den Verlust dieser Population zu minimieren.

    Verglichenan die bestehende mehrstufige Aufschlussverfahren 29 ermöglicht die Liberase Verdauung Protokoll eine deutlich höhere Ausbeute an Zell TECs (Abbildung 3). Andere Gruppen haben berichtet ihre neue Verfahren zur Thymus-Stroma-Zellisolierung durch Modifizieren Gray Verfahren 30,36, wobei die Zellausbeute nicht wesentlich erhöht. Kürzlich, Chidgey und Kollegen unabhängig voneinander über eine TEC-Protokoll mit Liberase Verdauung und sie auch erhalten, effektive Freisetzung von TEC 37. , Der erste Release thymocyte Schritt ihrer Protokoll hat jedoch das Potenzial, etwa 1,6 x 10 4 TEC aus jeder Thymus 29, von denen die meisten CTEC verwerfen. Durch Dichtegradienten Bereicherung führen zum Verlust der kleineren Stromazellen, ein autoMACS-basierten CD45-Mikroperlen-Depletion ist im Volksmund für die Anreicherung von TEC vor FACS Reinigung 29,36,37 verwendet. Im Vergleich zu den autoMACS-Anreicherungs mit CD45-Mikrokügelchen Erschöpfung Protokolle 29, diePanning Anreicherung erhaltene höhere Wiederfindungsraten von TEC. Insgesamt ist die hier vorgestellte Protokoll Aggregate eine Reihe von bereits berichtet Vorteile. TEC Teilmengen mit diesem Protokoll (Abschnitt 6) gereinigt wurden erfolgreich für die weitere Analyse verwendet werden, wie beispielsweise Echtzeit-PCR und Western-Blot-Analyse 12.

    Dieses Protokoll ist auch für die Isolierung und Untersuchung von anderen Thymus-Stroma-Zellen, wie dendritische Zellen. Wir glauben, dass robuste Isolierung von Thymus-Stromazellen, insbesondere TEC, wird verstehen, wie der Thymus-Funktionen für T-Zell-Entwicklung und Verwirklichung in vitro T-Zell-Verfassung zu beschleunigen. Weiterhin Charakterisierung dieser Zellen hat eine große praktische Bedeutung für die medizinische Gemeinschaft, da ein häufiges Problem bei der Wiederherstellung von Therapien (wie jene in Transplantation und der Krebstherapie verwendet wird) ist schlecht Rekonstitution von epithelialen Zellen im Thymus, die zu Immunschwäche.

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    Disclosures

    Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

    Acknowledgments

    Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants R01 AI088209 (zu KAH) unterstützt. Wir danken auch der University of Minnesota Durchflusszytometrie Ressource.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

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