İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada izolasyonu, tanımlanması ve fare timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) saflaştırılması için etkili bir yöntem tarif eder. Bu protokol, normal T-hücresi gelişimi, timus disfonksiyon ve T hücresi sulandırılacak timus fonksiyonunun çalışmaları için kullanılabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Timus T-lenfosit gelişimi için hayati bir organdır. T hücre bağlılık, pozitif ve negatif seçim seçimi: timik stromal hücrelerin, timik epitel hücreleri (Tecs) T hücre gelişiminin çeşitli aşamalarında özellikle önemlidir. Bununla birlikte, timus Tecs işlevi tam olarak anlaşılamamıştır. Makalede, mekanik parçalama ve enzimatik sindirme bir kombinasyonu kullanılarak taze fare timusundan TEC alt kümelerini izole etmek için bir yöntem sağlar. Yöntem, timus hücreleri ve antikor fragmanlarının verimli hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris bağlantıları serbest kalmasına ve tek bir hücre süspansiyonu meydana getirmek üzere sağlar. Izole edilmiş hücreler kullanılarak, çok parametreli akış sitometri Tecs ve dendritik hücrelerin belirlenmesi ve karakterize edilmesi uygulanabilir. Tecs timus nadir hücre topluluğu olduğundan, daha da zenginleştirmek ve timositleri, timus içinde en bol hücre tipi tüketerek Tecs arındırmak için etkili bir yol tarif eder. Follohücre canlılığı kaybının Tecs saflaştırılması sırasında minimize edilebilir, böylece kanat zenginleştirme, hücre tasnifi, ayırma süresi azaltılabilir. Saflaştırılmış hücreleri Real Time PCR, Western blot ve gen ekspresyonu profillemesi gibi çeşitli alt analizler için uygundur. Protokol TEC fonksiyonun araştırma ve hem de in vitro T hücresi sulandırma gelişimini teşvik edecektir.

Introduction

Erken T hücresi gelişiminde, kemik iliği hematopoetik kök hücre türevli multipotent progenitorlar timus korteks için işe, T kökene bağlı geçmesi ve T hücresi ön-1 olur. Son derece değişken T hücre reseptörleri 1 progenitörlerin büyük bir havuz oluşturan, kortekste T hücresi öncü CD4 ve CD8 çift negatif (DN), timositler genişletmek ve olgun CD4 ve CD8 çift pozitif (DP), timositler içinde farklılık gösterir. Sadece DP hücrelerin seçilmiş bir MHC ile sınırlandırılmış bir alt kümesi, CD4 veya CD8 tek bir pozitif (SP), timositler hale timus medullaya geçer ve fonksiyonel olarak yetkin olgun T hücrelerine gibi pozitif seleksiyona 2 adlandırılan bir olay ayırt edecektir 6. Buna karşılık, oto-reaktif timositlerin klonları negatif seçim geçmesi ve öz-hoşgörü için düzenleyici T hücreleri dönüştürülür, ya da henüz net değil amaçlarla intraepitelyal lenfositlerin yönlendirilir, apoptoz yoluyla uzaklaştırılır 3,710.

Timus, timik stromal hücreler bu çeşitli T hücre gelişimi kaderi 5,11,12 için sinyalleri veren eşsiz bir mikroortam oluştururlar. Kortikal Tecs (cTECs) ve kemik iliği Tecs (mTECs), dendritik hücreler, makrofajlar, fibroblastlar, endotel hücreleri, nöral tepe türetilmiş perisitlerin ve mezenkimal hücreler de dahil olmak üzere 13-15 - Timus, stromal hücreleri, timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) oluşmaktadır. Bunlar arasında, Tecs T hücresi gelişme 1,2,16,17 çeşitli aşamalarında çok önemlidir. Ancak, Tecs izole etmek için sağlam bir yol olmaması işlevleri 16 kapsamlı bir anlayış engelliyordu. Özellikle, kortekste ata hücreleri çevreleyen, üç boyutlu bir ağ oluşturmak cTECs, henüz net değildir nedenlerle pozitif seçim 13,18,19 için gereklidir. Daha önceki çalışmalar çoğunlukla morfolojik ve histolojik araçları 13 güvenerek, Tecs heterojen ve rolü gibi ipuçları sağlanan 12,20 genetik yaklaşımlar ele alındı. Tecs izole etmek sağlam ve tekrarlanabilir yoldur cTECs pozitif seçim nasıl desteklediğini TEC alt kümeleri, TEC fonksiyonların nicel ve nitel değerlendirilmesi ve mekanizmaların aydınlatılmasını tarafsız karakterizasyonu elde esastır.

Nedeniyle onlar bozulmamış organ formu timus Tecs azlığı ve sıkı etkileşimler, Tecs izolasyonu zorlu olmuştur. Burada açıklanan protokol, önceki keşifler, mevcut reaktif, teknikleri, ve timus yapısı ve stromal kompozisyon bilgisine dayanmaktadır. Yaklaşık iki yıl önce, birkaç prosedür tripsin, Kollajenazının ve Dispase dahil olmak üzere farklı enzimler sindirimi sırasında kullanılan edildiği timus dokuları 21-27, parçalamak bildirildi. Gray ve ark. kendi Muhakemelerine 28 bu enzimler göre ve geliştirilmiş bir meth Başkaoldu enzim kokteyller 29 bir çoklu-aşamalı sindirim od yaygın 20,30 kullanılmaktadır. Ancak, bu yöntem uzun bir işlem süresi ve hatta aynı sıçangil kohort 29,30 hücre sayıları ve Tecs oranlar son değişken karmaşık sindirim adımlar ve sonuçları içerir. Birkaç yıl önce, Liberase® araştırma sınıfı enzim, son derece saf hale getirilir ve kolajenaz nötr proteaz timus doku ayrışma 30 kullanılmaya başlanmıştır içeren. Burada, fare timusundan dokulardan uygulanabilir Tecs yüksek numarasını verir iyileştirilmiş mekanik ayırma prosedürleri ile sindirim Liberase® tabanlı bir protokol tanımlıyoruz. .

Ayrışmış stromal hücreler zenginleştirmek için, daha önceki çalışmalar yoğunluk geçişlerini veya manyetik boncuk ayırma 21,29 ya kullandık. Ancak yöntem hem timik stromal hücreleri, cTECs 29 özellikle nüfusun belli popülasyonlarının kaybetti ciddi neden olur. Sitotoksik eliminasyon ve kaydırma teknikleri 12,31 tüketilmesi veya lenfositlerin artan ayrılması için kullanılmıştır. Bu tekniklerin karşılaştırılması sonra, biz Tecs zenginleştirilmesi için geçerli kaydırma protokolünü kurulmuştur. Zenginleştirme işlemi sırasında nazik durum daha az hücre ölümü ve tarafsız ve artan TEC kurtarma yol açar.

Bölüm 3'te tarif edildiği gibi izole edilmiş bir hücre süspansiyonu, timus, doğrudan alt-TEC ve dendritik hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu için akış sitometrik analizi, uygulanabilir. Bölüm 4 sitometresini multiparametre akışını kullanarak TEC alt kümelerini tanımlamak için basit ve kullanışlı bir yol. Saflaştırılmış cTECs veya mTECs, TEC zenginleştirme ve ayıklama prosedürleri hücresi elde etmeye deneyler için Bölüm 5 ve 6'da bulunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada, yetişkin (6-8 haftalık) dişi C57BL / 6 fareleri kullanılmıştır. Fareler, Ulusal Kanser Enstitüsü alınan ve spesifik patojensiz şartlar altında muhafaza edilmiştir. Minnesota Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi (IACUC) bütün hayvan deneylerini onayladı.

Araçların ve Tamponlar hazırlanması 1.

  1. Enzim çözeltisi hazırlayın, albüminsiz açısından zengin tamponlu (1X PBS: [Ca2 + / Mg2 +-free]% 0.5 sığır serumu (% 0.05 içeren RPMI1640 ortamı Liberase® TH ve DNase I 100 U / ml [w / v]) albümini ve 2 mM etilendiamin tetraasetik asit [EDTA]) FACS tampon (PBS 1X [Ca2 + / Mg2 +-free] ihtiva eden,% 1 fetal inek serumu [FBS] ve% 0.02 NaN3), tampon sıralama FACS (1X PBS [Ca2 + / Mg2 +-free]% 2 FBS) ve RP10 ortamında içeren (RPMI-1640 ortamı),% 10 FBS ile birlikte.
  2. 10 kaydırma tabak hazırlayın. (0.01 mg / ml G 40 mi kaplama çözeltisi hazırlayınyulaf, 0.1 M NaHCO3 Tamponu içinde anti-fare IgG) ve her biri 100 x 15 mm levha, girdap içine kaplama solüsyonu ve 4 ml 4 ° CO / N inkübe edilir. Antikor çözüm dökün ve 2 kez 1x 5 ml PBS kullanılarak plaka durulama, durulama arasındaki şiddetle girdap. 4 ° C 'de hazırlanmış plakalar saklayın.

Thymus Doku 2. Hasat

  1. Bir CO2 odası içinde fare öldürülür. , Bir diseksiyon mat sırtında hayvan koymak mat ayak pin ve% 70 etanol ile püskürtülerek kürk ıslak.
  2. Düz kadar makas ile alt çene için üretral açıklıkta yukarıdaki başlayarak, deri yoluyla bir ensizyon olun ve her iki tarafta diz aşağı kesi uzatmak. Kesi "Y" bir baş aşağı gibi görünüyor. Tarafta gevşek deriyi geri çekin ve diseksiyon mat onu pin.
  3. , Kılıç şeklinde diyaframı delinme klavikula hakkında, daha sonra kaburga ile yukarı kaldırın kadar her tarafta kaburga kestiforseps diseksiyon mat onu pin ve. Timus sadece kaburga altında ve kalp (Şekil 1) örten ince iki beyaz lob gibi görünüyor. Kes bağ dokusu hafifçe çekin ve kavisli dişli forseps ile timus lobları çifti kaldırmak, timus çevreleyen. 5 ml RPMI-1640 ihtiva eden bir 6 yuvalı plaka içine yerleştirin timus loblar.

Timik Stromal Hücrelerinin 3. hazırlanması

  1. Çevredeki yağ ve bağ dokusu Trim ve 5 ml taze bir enzim solüsyonunun hazırlanması ihtiva eden 6 oyuklu plakanın yeni bir oyuğuna timus lobları aktarın. Ince bir makas timus loblarda küçük kesikler yapmak ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. Doku ayrışması için 5 ml pipet kullanarak 3 kez - yavaşça timus doku yukarı ve aşağı 2 sindirerek pipetle. 10 ml enzimleri etkisiz hale getirmek için soğuk albümin açısından zengin tampon içeren 50 ml'lik bir tüp içinde süpernatan fraksiyonu toplamak. Buz üzerinde toplama tüpünü tutun. 2.5 Eklemi enzim kalan dokuya çözeltisi ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Agrega kırmak için 3 ml şırınga ve 18 G iğne ile hafif mekanik ajitasyon gerçekleştirin. Toplama tüpüne Havuz süpernatant. Ve geri kalan dokulardan 2.5 mi enzim çözeltisi eklenir ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. 3 ml şırınga ve 25 G iğne ile nazik mekanik ajitasyon tekrarlayın ve plaka ek 5 kuluçkaya - 10 dk.
  5. Tam bir sindirimden sonra, toplama tüpünün içine süpernatant bir araya getirirler. Santrifüj 400 xg, 8 dk hücreleri toplamak için 4 ° C'de toplama tüpü. Aspire sıvı ve 10 ml albümin zengin tamponu içinde topak hücrelerin süspansiyonu ve 100 mm-örgü genişliği ile örnek filtre edin. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Sonra akış cytometic analizi (Bölüm 4) veya Tecs zenginleşme (Bölüm 5) gerçekleştirin.

Sitometrisi ile Tecs 4. Kimlik

  • 96 havuzlu yuvarlak dipli deney plakasında boyanması için FACS tampon maddesi içinde 100 ul başına 4 x 10 6 hücre arasında nihai bir konsantrasyona kadar hücrelere hazırlamak ve buz üzerinde plaka tutun. Hücrelere (10 ug FACS tamponu / ml anti-CD16 / CD32 antikoru) 20 ul Fc blok çözeltisi eklenir ve buz üzerinde 10 dakika için kuluçkalayın. 400 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C 'de plaka Spin. Bir lavabo içine plaka yüzeyini hafifçe vurarak kuyulardan sıvı atın.
  • Tanelenmiş hücreler 100 ul antikor kokteyli içinde (anti-CD45 -EpCAM, MHC sınıf II, -Ly51 antikorlar ve farklı üreticiler florokromlar ile işaretlenmiş UEA-1 lektin önerilen ya da FACS tampon her bir antikorun uygun konsantrasyonlarda test Askıya ) ve karanlıkta 20 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkalayın. Telafisi için, her bir fluorokrom ile 1 x 10 6 hücre leke.
  • Her bir oyuğa FACS tampon 100 ul ve 400 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C 'de plaka dönerler. Yıkama adımı birini tekrarlayınsaat ve daha sonra 100 ul FACS tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon hücreleri. 300 ul FACS tampon maddesi ile doldurulmuş bir 12 x 15 mm yuvarlak dipli bir FACS tüpü hücreleri aktarın. Sitometresiyle akış örnekleri Edinme ve FACS analiz yazılımı kullanarak verileri analiz. TEC yolluk strateji Şekil 2'de gösterilmiştir.
  • Panning ile Tecs 5. zenginleştirilmesi

    1. 400 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C 'de (Bölüm 3'te hazırlandı) başlanarak ve timus hücreleri dönerler. Aspire sıvı ve bir 15 ml ve 50 ml konik bir tüp içinde ml başına 2 x 10 8 hücre konsantrasyonunda FACS tamponu içerisinde sıralama topak hücrelerin süspansiyonu. Hücre süspansiyonu, 2.5 mikrogram / ml lik bir nihai konsantrasyonda anti-CD90.2 antikoru (klon 30-H12) (ya da anti-CD45) ilave edilir ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de dönen bir miksere yavaşça kuluçkalayın. Kuluçkalamanın ardından, 5 ile yıkayın - RP10 ortamında 10x hacmi ve 400 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj tüpü.
    2. Aspire sıvı ve pelet hücreleri tekrar süspansiyon, Ml başına 1 x 10 7 konsantrasyonunda RP10 ortamında. Her bir kaplanmış kaydırma (Kademe 1.3 hazırlandı) levha, girdap 5 mi hücre süspansiyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. Şiddetle girdap; konik bir tüp içine süpernatantlar aktarın. Plakalı RP10 ortamı kullanılarak iki kez durulayın ve toplama tüpünün içine Süpernatantlar havuzu.
    3. 400 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj toplama tüpü. Aspire sıvı ve 5 ml RP10 ortamında yeniden süspanse pelet hücreleri. Yeni bir kaydırma plakasına hücre süspansiyonu ekleyin girdap ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. Hücreler plaka yıkayın ve konik bir tüp içine havuzu toplayın. Tecs zenginleştirilmiş sonra, tampon sıralama 5 mi FACS hücreler 400 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C'de hücreleri durması ve askıya.

    Hücre sıralayarak Tecs 6. saflaştırılması

    1. Hemasitometre ile hücre sayımı ve FACS tamponu içerisinde 4 x 10 7 hücre bir konsantrasyonda bir hücre süspansiyonu hazırlanır. Antikorları des EkleHücre çözeltisi içine, Bölüm 4.4 'de tanımlanmış ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de dönen bir miksere yavaşça kuluçkalayın. Boyamayı takiben, yıkama ve FACS tampon ml'si başına 10 x 10 6 hücre bir konsantrasyona hücrelerin süspansiyonu.
    2. Sıralama, 100 uM alt-gruplar meme boyunca TEC fluoresan ile etkin hale getirilmiş hücre sıralaması kullanılmıştır. Kriteri hücre, RPMI-1640 içinde (hac / hac) FBS) içeren% 30 toplanır. Hücre sıralama 400 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj yapılır ve hücreler alt analizi için hazırlamak sonra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Elde edilen hücre süspansiyonu timositler, hematopoietik kaynaklı stromal hücreler ve hematopoietik olmayan stromal hücrelerin oluşuyordu Bölüm 3'te belirtildiği gibi, bu protokol kullanılarak, bir timüs bir organ, bir yetişkin fare (Bölüm 2) ve bir timüs hücre süspansiyonu uzaklaştırılmıştır hazırlandı. CD45 hematopoietik bir Pan-işaretleyici olarak timositlerde ve örneğin makrofajlar ve dendritik hücreler gibi hematopoietik hem de stromal hücrelerin üzerinde ifade edilir. Bunun aksine, Tecs hematopoetik kaynaklı olmayan ve CD45 15 açıklanmamıştır. Bölüm 4'te belirtildiği gibi hücre boyama ve akım sitometri analizi yapılmıştır.

    TEC alt kümeleri, cTECs ve mTECs iki tipi, ortak bir çift kuvvetli TEC öncüsü 15 kaynaklanır. Hem cTECs ve mTECs yüzeylerinde 28 EpCAM molekülü ifade eder. Böylece Tecs EpCAM-pozitif ve CD45-negatif, akış sitometresi ile (Şekil 2A) 'e göre kapı olabilir. cTECs ve mTECs iki reaktif ile ayırt edilebilir: Ly51CTEC ifade glutamil aminopeptidaz tanıyan bir antikor ve MTec (Şekil 2B) bağlanan lektin Ulex Europaeus aglutinin-1 (UEA-1) 28. Hem mTECs ve cTECs MHC sınıf yüzey (Şekil 2C ve 2D) II molekülleri ifade. mTECs ayrıca MHC sınıf II molekülleri (Şekil 2D) seviyesine bağlı olarak, düşük ve MTec MTec yüksekliğe kadar sınıflandırılabilir. Timus başına TEC ortalama sayısı, yaklaşık 9 x 10 5'tir. Doğrudan karşılaştırmalarda, kollagenaz, çok aşamalı bir protokole göre bu Liberase® enzim tabanlı bir protokol kullanılarak, yaklaşık olarak 8 kat daha fazla Tecs geri kazanılmış / 29 (Şekil 3) dispaz.

    Sıralama süresini azaltmak ve geri stromal hücrelerin canlılığını artırmak için, biz timus hücre süspansiyonu 95 üzerinde% timositlerin oluşur, çünkü tiyomistleri tüketmek için bir kaydırma yöntemi geliştirdi. Hücreler ile kuluçkalanmıştırti-CD90 antikoru ve önceden kaplanmış plakalar tarafından yakalanan. Tüm hazırlanmış timus hücrelerinde olduğu (ön zenginleştirilmiş) ile karşılaştırıldığında, Tecs oranı sonrası zenginleştirilmiş hücrelerinde% 15'in üzerine en az 0.5 'den% (Şekil 4A ve 4B) eklenmiştir. Anti-CD45 kaydırma aynı zamanda, örneğin, bir de dendritik hücrelerin geri gerek yoktur, bile kullanılabilir. Bu durumda, yaklaşık% 80, TEC zenginleştirme artar (veriler gösterilmemiştir). Panlamayla stromal hücre zenginleştirme sonra, TEC altkümelerin oranları bir alt kümesi ya da diğer seçici kaydırma sırasında kayıp değil düşündüren, (Şekil 4C ve 4D) değişmemiştir. Zenginleştirme numune ile karşılaştırıldığında, Tecs geri kazanım oranı yaklaşık olarak% 85 (Şekil 4E).

    Şekil 1
    Şekil 1. fare timus during diseksiyonu. Timus anterior superior toraks kalp üzerinde yer almaktadır. Kesme ve kaburga kaldırdıktan sonra, timus iki beyaz lob maruz kalmaktadır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 2
    Akış sitometri veri analizi ile Şekil 2. Kimlik CTEC ve MTec Otel. Vitray timus hücre örnekleri akım sitometri kullanılarak analiz edildi. Temsilcisi FACS profilleri gösterilmiştir. Sayılar, her bir popülasyonda yüzdesini göstermektedir. (A), canlı hücre, CD45-negatif ve EpCAM-pozitif etkinlikleri kapı TEC hücreleri temsil eder. TEC kapısı içinde (B), ve iki popülasyonu Ly51 UEA- seviyesine göre ayrılır 1. cTECs yüksek olmasıLy51 bir er ifadesi; mTECs UEA-1 yüksek seviyede. (C), MHC sınıf II molekülleri yüksek cTECs ifade edilmiştir. (D) ayrı ayrı düşük mTECs MTec ve yüksek MTec olarak anılır MHC sınıf II ve MHC II yüksek düşük alt gruplar oluşur. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 3,
    Şekil 3. bir Liberase tabanlı bir protokol çok aşamalı bir kolajenaz / dispaz protokolü kullanılarak daha yüksek bir hücre timüsten verim sağladı. Timüs hücreleri, daha önce yayınlanan bir çok-basamaklı bir kollajenaz / dispaz protokolü veya bu Liberase tabanlı bir protokol kullanılarak hazırlanmıştır. Numunelerin iki grup akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. (A) </ Strong> Temsilcisi FACS profilleri gösterilmiştir. Sayıları (B) fare timusundan başına TEC toplam hücre sayıları. Her grupta TEC hücrelerin yüzdelerini gösteren çubuk grafikte gösterilmiştir. Hata çubukları (n> 3) standart sapma gösterir. İki kuyruklu, eşsiz T test yazılımı Prism kullanılarak gerçekleştirildi. P <0.0001. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 4
    Kaydırma yöntemi ile Tecs Şekil 4 zenginleştirilmesi. Öncesi ve sonrası zenginleştirilmiş timik stromal hücrelerin FACS profilleri gösterilir. Hazırlanan timus hücreleri, anti-CD90 antikoru ile birlikte boyandı. CD90-pozitif timositleri timus hücreleri% 95 in üzerinde oluşturmaktadır. TEC zenginleştirme işlemi sırasında, timositleri Captur vardırmış ve önceden kaplanmış kaydırma plakası üzerinde arındırılmış, böylece Tecs süpernatan içinde zenginleştirilmiştir. (A) ve (B) 'TEC kapılar gösterilmiştir. Sayılar başlangıç ​​nüfus (Ön-zenginleştirme) veya zenginleştirme (post-zenginleştirme) sonrasında, toplam canlı hücreler arasında Tecs oranını gösterir. (C) ve (D), CTEC ve MTec kapıları dahilinde hücreler gösterilmiştir. Sayılar, her gruptan TEC popülasyonlarda CTEC ve MTec yüzdelerini gösterir. (E) Celi cTECs sayıları ve fare timusundan başına mTECs grafiğinde gösterilmiştir. Veriler 5 deneyi temsil etmektedir. "Pre" ön-zenginleştirme numune için; "Post" post-zenginleştirme numune için; küçük yatay çizgiler ortalama göstermektedir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Protokolde, kritik adımlar timus stromal hücrelerinin (Bölüm 3) hazırlama ve Tecs zenginleştirme (Bölüm 4) vardır. Kuvvetle taze enzim solüsyonu her zaman hazırlanır ve doku kısa sürede tedavi tavsiye edilir. Toplanmış Thymi için, enzim çözeltisinin hacmini optimize Thymi sayısına bağlı olarak gereklidir. Artık madde, herhangi bir doku, işlemden sonra kalan, daha fazla enzim çözeltisi ve inkübasyon süresi uzantısı ekleyerek hücre verimini artırabilir. Tecs zenginleştirilmesi, süpernatan alımı tamamlandıktan ve hücre kaybını azaltmak doyurmaya Bölüm 5.3 de tarif edilen plaka durulama sırasında tekrar.

    1980 yılında, Wekerle ve ark. Tamamen içi keseler içinde birçok canlı lenfoid hücreler saracak geniş kortikal epitel hücreleri "timus hemşire hücreleri" (TNCler) 33, - ilk Tecs bir tür bildirdi. 1982 yılında, Kyewski ve Kaplan, çeşitli izolasyon kon tarifulusötesi şirketlerin 34 verimini etkileyebileceği itions. Son zamanlarda, Takahama ve arkadaşları izolasyonu ve ulusötesi özelliklerini gözden. Sadece membran geçirgenliği 35 sonra CD45 için tercihli boyama temelinde bu tür hücreleri tespit edilmiştir. Onlar da bir CTEC ve çoklu bağlı timositlerin oluşuyordu bunların hazırlanması, içinde "kırık" TNC nitelendirdi. Bu kırık TNC hücre CD45 ve CTEC işaretleyici β5t pozitif ve bunların hazırlanmasında toplam cTECs% 70'ini oluşturmaktadır. Bizim izolasyon prosedürü ile, toplam cTECs az% 40 içermektedir, ancak Gerçekten de, aynı zamanda, bizim hazırlanan timus hücre süspansiyonu, CD45 + ve yüksek EpCAM Ly51 + oldu benzer bir hücre popülasyonu gözlenmiştir. Bu kırık TNC CD90 veya CD45 ile ya tükenmesi kullanan bizimki gibi TEC zenginleştirme protokolleri, kaldırılır. Böylece, gelecekteki bir meydan okuma bu nüfusun kaybını en aza indirmek olacaktır.

    KarşılaştırıldığındaMevcut çok adımlı sindirim prosedürü 29, Liberase® sindirim protokol Tecs arasında önemli ölçüde daha yüksek hücre verimi (Şekil 3) sağlar. Hücre verimi önemli ölçüde artmıştır olmamasına rağmen diğer gruplar da, Gray'in yöntemini 30,36 değiştirerek timik stromal hücre izolasyonu için yeni yöntemler bildirilmiştir. Son zamanlarda, Chidgey ve arkadaşları bağımsız Liberase sindirim kullanılarak bir TEC protokolü bildirdi ve onlar da Tecs 37 etkili serbest bırakıldı. Ancak, protokolün birinci timosit bırakma adımı cTECs çoğu ve bunların her biri timus 29, yaklaşık 1.6 x 10 4 Tecs atmak için potansiyele sahiptir. Daha küçük stromal hücrelerin kaybına neden yoğunluk gradyan zenginleşmesine bir AutoMACS tabanlı mikro tanesi, CD45-tükenmesi halk önce FACS saflaştırma 29,36,37 için Tecs zenginleştirilmesi için kullanılmıştır. CD45-microbead tükenmesi protokolleri 29, kullanarak AutoMACS tabanlı zenginleştirme karşılaştırıldığındaTecs yüksek iyileşme oranları zenginleşme elde edilen kaydırma. Genel olarak, burada sunulan protokol daha önce bildirilen bir dizi avantaj toplanır. Bu protokol (Bölüm 6) ile arıtılmış, TEC alt-gruplar başarılı bir şekilde Anlık-PCR ve Batı boya analizi 12 kadar, daha fazla analiz için kullanılmıştır.

    Bu protokol, aynı zamanda izolasyon ve dendritik hücreler gibi diğer timik stromal hücrelerin, çalışma için uygundur. Biz timik stromal hücreleri, özellikle Tecs, sağlam izolasyon T hücre gelişimi için nasıl timus fonksiyonları anlayış ve in vitro T hücre anayasa ulaşmada ivme inanıyoruz. (Örneğin transplantasyon ve kanser tedavisinde kullanılanlar gibi) tedaviler kurtarma ile ortak bir sorun immün yetmezlik önde timus epitel hücrelerinin zayıf sulandırılması olduğundan Dahası, bu hücrelerin karakterizasyonu, tıp camiası için büyük bir pratik değeri vardır.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

    Acknowledgments

    Bu çalışma (Kah için) Sağlık Hibe R01 AI088209 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Biz de Minnesota Sitometrisi Kaynağın Üniversitesi teşekkür ederim.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
    2. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
    3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
    4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
    5. Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
    6. Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
    7. Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
    8. Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
    9. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
    10. Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
    11. Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
    12. Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
    13. Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
    14. Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
    15. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
    16. Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
    17. Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
    18. Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
    19. Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
    20. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
    21. Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
    22. Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
    23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
    24. Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
    25. Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
    26. Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
    27. Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
    28. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
    29. Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
    30. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
    31. Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7, (Unit 7.3), (2001).
    32. Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3, (Unit 3.5), (1991).
    33. Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
    34. Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
    35. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
    36. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
    37. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).

    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics